專利名稱：一種培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法
技術領域：
本發明涉及一種培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法，屬于微生物菌種分離方法。研究背景菌種分離是將有價值的子實體的局部組織、孢子或基內菌絲移接到斜面試管培養基上，從而獲得純培養菌絲。菌種資源的獲得有野外采集和栽培場所采集兩種途徑。野外標本的采集，主要適用于食用菌的野生種馴化、遺傳育種、生理生態以及各種研究用的ー級種的分離。而在食用菌栽培上ー級種的分離，其種菇的來源主要是從栽培場中經留種獲得的。 食用菌菌種是重要的生產資料，也是教學、科研上的重要實驗材料。菌種質量的好壞直接影響栽培的成敗和產量的高低，只有優良的菌種才能獲得高產和優質的產品，因此生產優良的菌種是食用菌栽培的一個極其重要的環節。根據菌種的來源、繁殖代數及生產目的，把菌種分為母種、原種和栽培種、用子實體分離，通常在子實體大量出現時期。最好在采集當天就進行分離。一般應選取幼嫩、堅實、干爽、無病的子實體為分離對象。無論是人工栽培子實體還是液體發酵菌絲體生產，獲得高品質的優良菌種是關鍵。進行菌種分離是食用菌栽培中的ー個重要環節。菌種分離須按一個嚴格的無菌操作程序進行。菌種分離可以分為孢子分離、組織分離和基內菌絲分離三種。食用菌菌種分離的組織分離法包括子實體、菌核，菌索內部組織獲得純培養的方法都屬于組織分離法。實際生產中用最多的就是組織分離法，常規的組織分離方法是選擇優良的種菇作為分離材料，用無菌水沖洗后，用75%的酒精溶液表面消毒。取消毒過的刀片從菌柄或菌蓋中部縱切、撕開，挑取菌蓋與菌柄交界處的一小塊組織(火柴頭大小)，接種到PDA培養基上3-5天后，接種塊上產生白色絨毛狀菌絲。但目前分離野生食用菌存在的問題主要是野生食用菌一般生長在野外，外附雜物及雜菌較多，部分又遭蟲蝕，分離的菌種塊極易污染，不容易分離成功。
發明內容
本發明的目的在于提供一種培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法。為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了一種培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法，包括以下步驟取子實體，用膠帶包裏，75 %的酒精擦洗外表面，縱向切開子實體，削取子實體厚實的地方組織塊，在酒精燈火焰上快速來回過火2-3次送入試管，此時試管培養基表面向下，再用接種針送到試管底部分離培養基的下面，距離分離培養基2-4mm，并保持此種狀態培養，溫度28_30°C，相対濕度70-90%的狀態下保濕培養7_10d，組織塊萌發的菌絲即可向上對接培養基而成活。所述的子實體先用無菌刷子刷去菇體表面的雜質。縱向切開子實體采用手術刀進行。所述的分離培養基由以下原料組成馬鈴薯350_450g，發酵腐熟牛糞90_110g，葡萄糖15-25g，磷酸ニ氫鉀O. 5-1. 2g，硫酸鎂O. 2-1. 8g，酵母膏45_55g，瓊脂15_25g、水IOOOmL,鏈霉素 50U/mL，青霉素 50U/mL，pH6. 5。所述分離培養基的制備方法為將土豆削皮切薄皮加3000mL水煮30min,過濾取2000mL，加入發酵腐熟的牛糞。小火浸煮20min，過濾取濾液IOOOmL ;在此濾液中加入瓊脂后繼續加熱，火力大小以不溢出為好，同時不停攪拌，防止糊鍋，待其完全溶化后，再加入葡萄糖、酵母膏、、磷酸ニ氫鉀、硫酸鎂、鏈霉素和青霉素各50000U，攪拌均勻，定容至IOOOmL ；將已制備好的培養基趁熱分裝于試管內，姆支5mL,用太空棉棉塞緊試管ロ，7支一把,高壓滅菌，溫度121°C，時間50min，試管培養基擺成大斜面，覆蓋報紙停放2-4d，散去培養基表面的水分，利用食用菌菌組織保濕萌發，自然接種到懸空的培養基上。通常情況下，食用菌子實體不能使用75%酒精搽拭，酒精很容易浸入子實體，造成 組織塊不萌發；而本發明采用膠帶包裹子實體，可用酒精消毒搽拭，有效防止了子實體表面的雜菌在操作的空間造成污染；抗生素直接加入分離培養基，具有抗細菌活性。野生食用菌附帯雜菌頗多，采用組織塊保濕萌發后懸空接種，成功機率達到80%以上。本發明是針對外附雜菌較多的野生食用菌，本發明中的菌種塊一般取較大組織塊，容易萌發菌絲，和培養基隔空對應培養，通過萌發的氣生菌絲接種到懸空在組織塊上方的空白培養基，不易污染，成功率比較高。
圖I為本發明的接種塊位置示意圖。
具體實施例方式本實施例的方法為取子實體，用無菌刷子刷去菇體表面的雜質，用膠帶包裏，75%的酒精擦洗外表面，用手術刀縱向切開子實體，削取子實體厚實的地方組織塊，在酒精燈火焰上快速來回過火3次送入試管，此時試管培養基表面向下，如圖I中的I所示，再用接種針送到試管底部培養基的下面，距離培養基3mm，如圖I中的2所示。并保持這種狀態培養，溫度28°C，相対濕度80%保濕培養7-10d，組織塊萌發的菌絲即可向上對接培養基而成活。本實施例的分離培養基由以下原料組成馬鈴薯400g，發酵腐熟牛糞100g，葡萄糖20g，磷酸ニ氫鉀I. 0g，硫酸鎂I. 5g，酵母膏50g，瓊脂20g，水IOOOmL,鏈霉素50U/mL，青霉素 50U/mL，pH6. 5。其中，分離培養基的制備方法為將土豆削皮切薄皮加3000mL水煮30min,過濾取2000mL，加入發酵腐熟的牛糞。小火浸煮20min，過濾取濾液IOOOmL ;在此濾液中加入葡萄糖、酵母膏、瓊脂、磷酸ニ氫鉀、硫酸鎂、鏈霉素和青霉素各50000U，煮至瓊脂溶解，定容至1000M1 ;將已制備好的培養基趁熱分裝于試管內，姆支5mL,用太空棉棉塞緊試管ロ，7支一把，高壓滅菌，溫度121°C，時間50min，試管培養基擺成大斜面，覆蓋報紙停放2-4d，散去培養基表面的水分，利用食用菌菌組織保濕萌發，自然接種到懸空的培養基上。
權利要求
1.一種培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法，其特征在于包括以下步驟取子實體，用膠帶包裏，75%的酒精擦洗外表面，縱向切開子實體，削取子實體厚實的地方組織塊，在酒精燈火焰上快速來回過火2-3次送入試管，此時試管培養基表面向下，再用接種針送到試管底部分離培養基的下面，距離分離培養基2-4_，并保持此種狀態培養，溫度28-30°C，相対濕度70-90%的狀態下保濕培養7_10d，組織塊萌發的菌絲即可向上對接培養基而成活。
2.根據權利要求I所述的培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法，其特征在于所述的子實體先用無菌刷子刷去菇體表面的雜質。
3.根據權利要求I所述的培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法，其特征在于縱向切開子實體采用手術刀進行。
4.根據權利要求I所述的培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法，其特征在于所述的分離培養基由以下原料組成馬鈴薯350-450g，發酵腐熟牛糞90-110g，葡萄糖15-25g，磷酸ニ氫鉀O. 5-1. 2g，硫酸鎂O. 2-1. 8g，酵母膏45_55g，瓊脂15_25g、水IOOOmL,鏈霉素 50U/mL，青霉素 50U/mL，pH6. 5。
5.根據權利要求I或4所述的培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法，其特征在于所述分離培養基的制備方法為將士豆削皮切薄皮加3000mL水煮30min，過濾取2000mL,加入發酵腐熟的牛糞；浸煮20min,過濾取濾液IOOOmL ;將已制備好的培養基分裝于試管內，用太空棉棉塞緊試管ロ，高壓滅菌，溫度121°C,時間50min,試管培養基擺成大斜面，覆蓋報紙停放2-4d，自然接種到懸空的培養基上。
全文摘要
本發明涉及一種培養基倒置懸空法組織分離野生食用菌菌種的方法，包括以下步驟取子實體，用膠帶包裹，75％的酒精擦洗外表面，縱向切開子實體，削取子實體厚實的地方組織塊，在酒精燈火焰上快速來回過火2-3次送入試管，此時試管培養基表面向下，再用接種針送到試管底部分離培養基的下面，距離分離培養基2-4mm，并保持此種狀態培養，溫度28-30℃，相對濕度70-90％的狀態下保濕培養7-10d，組織塊萌發的菌絲即可向上對接培養基而成活。采用組織塊保濕萌發后懸空接種，成功機率達到80％以上。本發明是針對外附雜菌較多的野生食用菌，本發明中的菌種塊一般取較大組織塊，容易萌發菌絲，和培養基隔空對應培養，通過萌發的氣生菌絲接種到懸空在組織塊上方的空白培養基，不易污染，成功率比較高。
文檔編號A01G1/04GK102668874SQ20111043209
公開日2012年9月19日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者侯軍, 侯小旗, 侯明陽, 侯海龍, 林曉民 申請人:河南科技大學