專利名稱:一種篩選耐鹽性轉基因玉米的方法
技術領域:
本發明涉及一種特定種質的篩選方法,特別涉及一種篩選耐鹽性轉基因玉米的方法。屬于作物遺傳育種領域。
背景技術:
土壤鹽堿化已經成為影響農業生產的重要因素。據統計全世界鹽堿地的面積為 9. 5438億hm2,其中我國為9913萬hm2 (郭慶法,2004)。玉米既是重要的飼料和糧食作物,也是極其重要的工業原料,所以大力提高玉米綜合生產能力已經成為目前一項緊迫的任務。 玉米是對鹽堿中度敏感的作物,只能在氯化鈉含量0. 3%以下的土壤上生長,這就極大的限制了玉米在鹽堿灘地上的生長(江春梅等,2001)。由于玉米的耐鹽性屬于數量性狀、現有可利用的耐鹽種質資源匱乏,想要通過常規育種的方式大幅度的提高玉米的耐鹽堿性耗時費力、難度較大。近年來,隨著生物技術的迅速發展,其已經廣泛應用于玉米的抗逆育種中。 目前利用生物技術培育轉基因玉米,是解決當前土壤鹽堿化的一條行之有效的途徑之一。
利用基因工程技術培育玉米耐鹽新種質已成為玉米耐鹽新技術育種的重要途徑。 劉巖等(1998)將大腸桿菌6-磷酸山梨醉脫氫酶基因gutD轉入玉米,使玉米耐鹽性明顯高于對照。何銘潔等(1999)利用基因槍法成功將甜菜堿醛脫氫酶基因導入玉米。通過對外源基因的分子檢測和耐鹽性分析,表明目的基因已整合入玉米基因組并正常表達,轉基因玉米耐鹽脅迫性明顯提高。Yin等Q004)將分離于擬南芥的液泡膜Na' /H"反向轉運蛋白基因NXtll導入玉米,提高了轉基因植株的耐鹽脅迫能力。劉祥久等Q005)利用花粉管通道法將抗旱基因和耐鹽種質DNA導入玉米自交系。趙磊Q006)用根癌農桿菌介導玉米, 將膽堿單加氧酶基因(CMO)和甜菜堿醛脫氫酶基(BADH)成功轉入玉米自交系。通過對測定玉米愈傷組織、幼苗有關耐鹽堿性生理指標的試驗表明其抗鹽性有一定的提高。付光明等Q006)利用花粉管通通技術將BADH基因導入玉米,并且提高玉米的耐鹽性。轉基因玉米在鹽脅迫條件下所受傷害明顯低于非轉基因植株。程艷松等O008)將來自于擬南芥的 3個耐鹽基因S0S1、S0S2和S0S3導入玉米,抗性愈傷的耐鹽堿能力明顯高于非轉基因愈傷的耐鹽堿能力。
對轉基因玉米進行耐鹽性鑒定,是選育耐鹽性轉基因新種質的關鍵步驟。現在小麥、水稻、番茄等作物在這方面的研究比較深入,可以作為玉米耐鹽性篩選和鑒定方法研究的參考。目前,國內外對玉米耐鹽性篩選和鑒定方法的研究還少有報道,采用的具體方法主要有鹽水發芽鑒定法、盆栽鑒定法、海水灌溉和大田自然鑒定法,沒有較為理想的對于作物的耐鹽堿性的鑒定方法及篩選方法,因此,亟需加強這方面的研究。發明內容
針對現有技術中的問題,本發明的目的是提供一種用于篩選耐鹽性轉基因玉米的方法。
本發明方法以玉米幼苗為檢測對象,采用特定濃度氯化鈉處理一定時間后,通過檢測與耐鹽性顯著相關的生理生化指標,進行數據處理后與受體對照相比較,根據數值來評價轉基因玉米耐鹽能力,以達到建立一個客觀準確的轉基因玉米耐鹽性評價方法的目的,并可進一步作為玉米耐鹽性篩選和鑒定方法研究的參考。
本發明的目的是這樣實現的
一種用于篩選耐鹽性轉基因玉米的方法,其特征在于包括以下步驟
(1)玉米種子萌發
挑選供試發育良好的轉基因玉米種子和非轉基因受體對照種子,按照常規方法發芽;
(2)溫室內玉米種子播種
取芽長一致的種子播種在裝有等量蛭石的花盆中,每天用適量的l/2H0agland營養液澆灌,溫室中培養;
(3)玉米幼苗鹽脅迫處理
幼苗長至三葉一心期時,每天用含有300mmol/L NaCl的l/2Hoagland營養液澆灌處理;
(4)玉米葉片生理生化指標的檢測
處理7d后,取玉米幼苗的第3片真葉的葉中部位0. Ig左右,測定幼苗的各項生理生化指標;
(5)玉米耐鹽能力評價
對生理生化指標檢測結果按照新復極差法進行方差分析和多重比較,依據生理生化指標的差異顯著性測驗結果進行賦值,a = l,b = 2,c = 3......以此類推,有字母重疊時只計第一個字母,并計算各項生理生化指標的平均值,依據轉基因后代株系的平均值與非轉基因受體對照值的差χ進行分級,分級標準為平均值與對照值之差χ < 0. 5,則轉基因玉米比對照耐鹽性提高0級,耐鹽性無提高;平均值與對照值之差0. 5 < χ < 1. 2,則轉基因玉米比對照耐鹽性提高1級,耐鹽性小幅提高;平均值與對照值之差1. 2 < χ < 1. 9, 轉基因玉米比對照耐鹽性提高2級,耐鹽性明顯提高;平均值與對照值之差1. 9 < X,轉基因玉米比對照耐鹽性提高3級,耐鹽性大幅提高;
(6)根據步驟( 所述的分級標準對供試玉米進行分級,根據需要選擇具有耐鹽性的轉基因玉米。
優選的,為保持處理濃度的恒定,步驟(3)中所述的含有300mmol/L NaCl的 l/2H0agland營養液,其每澆灌一次的用量為蛭石持水量體積的二倍。
本發明所述的方法,其特征在于步驟中所述的生理生化指標包括超氧化物歧化酶SOD活性、過氧化物酶POD活性、過氧化氫酶CAT活性、相對電導率、葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量其中幾種或全部。
本發明相對于現有的技術而言所具有的主要優點和效果如下
1.適應范圍廣。
本發明的一種用于篩選耐鹽性轉基因玉米的方法除適用于篩選具有耐鹽性的轉基因玉米外,也適用于篩選具有耐鹽性的普通玉米種質。
2.評價標準數值化,更客觀準確。
在篩選耐鹽性轉基因玉米的過程中,由于玉米受體自身的耐鹽性級別較高,比受4體材料耐鹽性有明顯提高的材料無法進行準確評價。本發明利用玉米苗期鹽脅迫后與抗逆性相關的生理生化指標的變化,建立了新的耐鹽性評定體系,能夠更客觀的反應轉基因材料比受體耐鹽性提高的程度。
3.本發明易于掌握,重復性高。
本發明使用轉基因玉米幼苗作為評價篩選對象,試驗材料容易獲得,一次可同時評價大量轉基因植株,操作方法易于掌握,重復性高。
本發明的主要創造點在于
(1)本發明對轉基因玉米苗期進行鹽脅迫處理,針對幼苗鹽脅迫后與抗逆性相關的生理生化指標的變化進行了詳細的研究,確立了耐鹽堿性評價的分級標準,建立了一種篩選耐鹽性轉基因玉米的方法。
(2)本發明以轉基因玉米幼苗作為評價對象,試驗材料易于獲取,試驗周期短,效率高。
(3)本發明的一種篩選耐鹽性轉基因玉米的方法具有適用范圍廣的特點,將評價標準數值化,更客觀準確,適用于篩選轉基因玉米與受體相比耐鹽性提高程度不同的玉米種質。
圖1是發明的流程示意圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明,應該理解的是,這些實施例僅用于例證的目的,決不限制本發明的保護范圍。
實施例1
1試驗材料
7份玉米非轉基因受體常規自交系及32份轉BcWRKYI基因的玉米T2代株系均由東北農業大學玉米研究所提供,見表1。
表132份供試玉米轉基因材料
權利要求
1.一種篩選耐鹽性轉基因玉米的方法,其特征在于包括以下步驟(1)玉米種子萌發挑選供試發育良好的轉基因玉米種子和非轉基因受體對照種子,按照常規方法發芽;(2)溫室內玉米種子播種取芽長一致的種子播種在裝有等量蛭石的花盆中,每天用適量的l/2H0agland營養液澆灌,溫室中培養;(3)玉米幼苗鹽脅迫處理幼苗長至三葉一心期時,每天用含有300mmol/L NaCl的l/2Hoagland營養液澆灌處理;(4)玉米葉片生理生化指標的檢測處理7d后,取玉米幼苗的第3片真葉的葉中部位0. Ig左右,測定幼苗的各項生理生化指標;(5)玉米耐鹽能力評價對生理生化指標檢測結果按照新復極差法進行方差分析和多重比較,依據生理生化指標的差異顯著性測驗結果進行賦值,a = l,b = 2,c = 3......以此類推,有字母重疊時只計第一個字母,并計算各項生理生化指標的平均值,依據轉基因后代株系的平均值與非轉基因受體對照值的差χ進行分級,分級標準為平均值與對照值之差χ ^ 0. 5,則轉基因玉米比對照耐鹽性提高0級,耐鹽性無提高;平均值與對照值之差0. 5 < χ < 1. 2,則轉基因玉米比對照耐鹽性提高1級,耐鹽性小幅提高;平均值與對照值之差1. 2 < χ < 1. 9,轉基因玉米比對照耐鹽性提高2級,耐鹽性明顯提高;平均值與對照值之差1. 9 < X,轉基因玉米比對照耐鹽性提高3級,耐鹽性大幅提高;(6)根據步驟( 所述的分級標準對供試玉米進行分級,根據需要選擇具有耐鹽性的轉基因玉米。
2.按照權利要求1所述的方法,其特征在于步驟(3)中所述的含有300mmOl/LNaCl的 l/2H0agland營養液,其每澆灌一次的用量為蛭石持水量體積的二倍。
3.按照權利要求1所述的方法,其特征在于步驟(4)中所述的生理生化指標包括超氧化物歧化酶SOD活性、過氧化物酶POD活性、過氧化氫酶CAT活性、相對電導率、葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量其中幾種或全部。
全文摘要
本發明公開了一種篩選耐鹽性轉基因玉米的方法,它包括以下步驟(1)玉米種子萌發、(2)溫室內玉米種子播種、(3)玉米植株鹽脅迫處理、(4)玉米葉片生理生化指標的檢測、(5)玉米耐鹽能力評價和(6)選擇具有耐鹽性的轉基因玉米。本發明的方法建立了一個適合玉米苗期耐鹽性評價的方法,該體系以玉米幼苗為檢測對象,用氯化鈉溶液灌澆處理后,通過對植株生理生化指標的檢測,達到建立一個客觀準確的轉基因玉米耐鹽性評價方法的目的,從而為耐鹽性轉基因玉米的篩選提供可靠的依據。
文檔編號A01H1/04GK102524054SQ20111043015
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者劉顯君, 單長建, 張 林, 曾興, 李新海, 王振華, 翁建峰, 蘆翠華, 邸宏 申請人:東北農業大學