專利名稱：：麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法
技術領域：
：本發明涉及麻瘋樹植物遺傳轉化
技術領域：
，尤其涉及一種麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法。
背景技術：
：麻瘋樹(Jatrophacurcas),多年生木本油料植物，大戟科麻瘋樹屬，原產美洲，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區。麻瘋樹耐干旱貧瘠，種子含油量高達60%，是目前重要的生物能源植物之一。然而，目前麻風樹存在種植區域狹窄，產量低等問題，而傳統育種周期長，要獲得一個優良性狀且穩定遺傳的品種需要8-10年。近年來，植物基因工程技術的快速發展，在許多糧食和經濟作物的種質改良方面發揮了重要的作用。因此，成為改良麻風樹抗逆性、提高產量、改善油質等性狀的重要手段。根癌農桿菌介導法是最常用的植物基因轉化方法之一。根癌農桿菌含有Ti質粒，其上有一段T-DNA區。將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，通過侵染植物傷口進入細胞后，可將目的基因插入到植物基因組中，通過減數分裂穩定地遺傳給后代。麻風樹的研究工作起步較晚，關于麻瘋樹組織培養和遺傳轉化技術的報道還很少，且轉化苗的生根率普遍較低。李美茹等研究人員以麻風樹子葉作為外植體，草胺膦作為篩選劑，建立了根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系，轉化苗生根率為78%(LiM.,LiH.,JiangH.，etal.TransformationofanAgrobacterium-mediatedcotyledondisctransformationmethodforJatrophacurcas.PlantCellTissueandOrganCulture,2008,92(2):173-181)。而Kumar等研究人員以麻風樹葉片作為外植體，潮霉素作為篩選劑，建立的根癌農桿菌介導麻風樹的遺傳轉化中，轉化苗的生根率只有40%(KumarN.,AnandK.G.V.,PamidimarriD.V.N.S.etal.StablegenetictransformationofJatrophacurcasviaAgrobacteriumtumefaciens-mediatedgenetransferusingleafexplants.IndustrialCropsandProducts,32:41—47)。Pan等石開究人員以)風十片作為外植體，卡那霉素作為篩選劑，利用農桿菌介導法對麻風樹進行轉化中，獲得的120株再生植株只有1株生根(PanJ.,FuQ.,XuF.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofbiofuelplantJatrophacurcasusingkanamycinselection.AfricanJournalofBiotechnology,9(39),6477—6481)。
發明內容本發明實施例所要解決的技術問題在于，提供一種麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，以明顯改善麻瘋樹遺傳轉化苗纖弱的生長狀態，提高生根率。為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案一種麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，包括如下步驟準備步驟，選用合適的外植體由根癌農桿菌浸染處理后，再經抗性愈傷誘導及分化培養基培養后獲得再生芽作為抗性芽備用；壯苗培養步驟，將抗性芽從抗性愈傷組織上切取下來，切去褐化部位，轉接到壯苗培養基P中進行壯苗培養；生根培養步驟，挑取經過壯苗培養后高2-3厘米并有4-6片葉的抗性芽，切除基部愈傷組織，用10-20mg/L的生根粉溶液浸泡纊15分鐘，轉接至生根培養基R中進行生根培養，直至生根苗達到出罐煉苗的技術要求；煉苗步驟，對達到出罐煉苗的技術要求的生根苗開蓋煉苗，移栽至溫室。進一步地，準備步驟中選用的外植體為帶有4-6片真葉的莖段，其長度為2-3cm。進一步地，所述準備步驟中使用的根癌農桿菌是如下攜帶含有目的基因載體的根癌農桿菌菌株中的任意一種EHA105、LBA4404、GV3101、MP90。進一步地，所述準備步驟中使用的抗性愈傷誘導及分化培養基含有1-3mg/L草胺膦或20-50mg/L卡那霉素或1-10mg/L潮霉素。進一步地，壯苗培養基P的配方為MS基本培養基+30g/L蔗糖+0.2-1.5mg/L6-芐氨基嘌呤+0.005-0.1mg/L吲哚丁酸+1-5mg/L硝酸銀+100-300mL/L椰汁+5-10g/L瓊脂+1-3mg/L草胺膦或20-50mg/L卡那霉素或l-10mg/L潮霉素+50-150mg/L特美汀，pH=5.6-6.0。進一步地，壯苗培養的培養條件是溫度M_28°C，光照強度1000-2000lx，光照時間12-18小時/天，培養時間為3-5周，每兩周繼代一次。進一步地，生根培養基R配方為1/2MS基本培養基+0.01-0.1mg/L吲哚_3_乙酸+0.01-0.1mg/L萘乙酸+0.05-0.25mg/L吲哚丁酸+10-15g/L蔗糖+4-8g/L瓊脂+1-3mg/L草胺膦或20-50mg/L卡那霉素或1-10mg/L潮霉素+50-150mg/L特美汀。進一步地，生根培養步驟中，培養條件是溫度M_28°C，光照強度1000-2000Ix,光照時間12-18小時/天，每兩周繼代一次。進一步地，抗性芽在生根培養基R中培養7-10天開始生根，25-35天達到出罐煉苗的技術要求。進一步地，生根苗的根長為3-5cm即可進行煉苗。通過采用上述技術方案，本發明至少具有如下有益效果1.改善轉化苗的生長狀態。經過根癌農桿菌浸染后的轉化苗通常會更加纖細瘦弱，生根率會更低，尤其是經卡那霉素和潮霉素篩選所獲得轉化苗，葉片較小，莖細弱，植株發黃，而本發明通過增加壯苗培養步驟，使轉化苗葉片濃綠，莖段粗壯，生長旺盛，有利于后續的生根培養。2.生根率高。麻風樹組織培養中一直存在著生根困難的問題，生根率普遍較低。經過根癌農桿菌浸染后的轉化苗狀態較差，生根率更低，而本發明的方法中，不論經過草胺膦，卡那霉素還是潮霉素篩選得到的轉化苗，經壯苗培養后，生根率均可達80-90%，為麻風樹的轉基因育種奠定了良好的基礎。3.有效篩選出轉基因苗。現有技術都是在抗性愈傷組織階段和分化階段加入篩選劑，將得到的抗性芽轉入不含篩選劑的生根培養基；本發明不僅在抗性愈傷組織階段和分化階段加入篩選劑，生根階段也選擇了合適的篩選劑濃度，這樣有助于避免非轉化苗的逃逸，有效篩選出轉化苗，減少后期的鑒定工作。具體實施例方式下面結合實例詳述描述本發明的實施方案。需要說明的是，下述實例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實例來限定本發明的保護范圍。本發明提供一種麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，步驟如下準備步驟，選用合適的外植體由根癌農桿菌浸染處理后，再經抗性愈傷誘導及分化培養基培養后獲得再生芽作為抗性芽備用；壯苗培養步驟，將抗性芽從抗性愈傷組織上切取下來，切去褐化部位，轉接到壯苗培養基P中進行壯苗培養；生根培養步驟，挑取經過壯苗培養后高2-3厘米并有4-6片葉的抗性芽，切除基部愈傷組織，用10-20mg/L的生根粉溶液浸泡纊15分鐘，轉接至生根培養基R中進行生根培養，直至生根苗達到出罐煉苗的技術要求；煉苗步驟，對達到出罐煉苗的技術要求的生根苗開蓋煉苗，移栽至溫室。其中，所述準備步驟中，使用的外植體優選為帶有4-6片真葉的小桐子莖段，其長度為2-3cm;而所用的根癌農桿菌是如下攜帶含有目的基因載體的根癌農桿菌菌株中的任意一種疋擬105、1^六4404、6￥3101、]\^90，而目的基因載體可以是？81121呼11或？0六1^認1301等。使用的抗性愈傷誘導及分化培養基中含有1-3mg/L草胺膦或20-50mg/L卡那霉素或1-10mg/L潮霉素。在壯苗培養步驟中，壯苗培養基P的配方為MS基本培養基+10_30g/L蔗糖+0.2-1.5mg/L6-芐氨基嘌呤+0.005-0.1mg/L吲哚丁酸+1-5mg/L硝酸銀+100-300mL/L椰汁+5-10g/L瓊脂+1-3mg/L草胺膦或20-50mg/L卡那霉素或Ι-lOmg/L潮霉素+50-150mg/L特美汀，pH=5.6-6.0。壯苗培養條件是培養溫度M_28°C，光照強度1000-2000Ix,光照時間12-18小時/天，培養時間為3-5周，每兩周繼代一次。而生根培養步驟中，生根培養基R配方為1/2MS基本培養基+0.01-0.1mg/L吲哚-3-乙酸+0.01-0.1mg/L萘乙酸+0.05-0.25mg/L吲哚丁酸+10-15g/L蔗糖+4-8g/L瓊脂+1-3mg/L草胺膦或20-50mg/L卡那霉素或1-10mg/L潮霉素+50-150mg/L特美汀。生根培養條件是培養溫度M_28°C，光照強度1000-2000lx，光照時間12-18小時/天，每兩周繼代一次。一般地，抗性芽在生根培養基R中培養7-10天開始生根，25-35天達到出罐煉苗的技術要求。根據目前的技術水平狀況，生根苗的根長為3-5cm即可進行煉苗。下面結合實例詳述描述本發明的實施方案。需要說明的是，下述實例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實例來限定本發明的保護范圍。實例1本實例是以根癌農桿菌GV3101介導將GUS基因轉入云南元謀野生麻風樹進行培養，各工藝步驟具體如下準備步驟，將外植體經攜帶含有目的基因載體PCAMBIA1301的根癌農桿菌GV3101浸染后，再在含有2mg/L草胺膦的抗性愈傷誘導及分化培養基上培養獲得再生芽作為抗性芽備用；壯苗培養步驟，將抗性芽從抗性愈傷組織上小心切取下來，切去褐化部位，轉接到壯苗培養基P中進行壯苗培養，所述壯苗培養基P配方為MS基本培養基+30g/L蔗糖+0.2mg/L6-芐氨基嘌呤+0.005mg/L吲哚丁酸+1mg/L硝酸銀+200mL/L椰汁+7g/L瓊脂+2mg/L草胺膦+50mg/L特美汀，pH=5.6-6.0,培養條件是溫度，光照強度2000Ix,光照時間16小時/天。培養時間為四周，每兩周繼代一次；生根培養步驟，挑取經過壯苗培養后高2-3厘米并有4-6片葉的抗性芽，切除基部愈傷組織，用由北京艾比蒂研究開發中心研制及銷售的ABT-I號生根粉配制得到的10mg/L的生根粉溶液浸泡10分鐘，轉接至生根培養基R中，生根培養基R配方為1/2MS基本培養基+0.01mg/L吲哚-3-乙酸+0.01mg/L萘乙酸+0.05mg/L吲哚丁酸+10g/L蔗糖+7g/L瓊脂+2mg/L草胺膦+50mg/L特美汀，培養條件是溫度，光照強度2000Ix,光照時間16小時/天，每兩周繼代一次，一般地，7-10天開始生根，25-35天可以達到出罐煉苗要求；煉苗步驟，將生長25-35天，根長3-5cm的生根苗開蓋煉苗，移栽至溫室。實例2本實例是以根癌農桿菌EHA105介導將GUS基因轉入云南元謀野生麻風樹進行培養，各工藝步驟具體如下準備步驟，選取合適的外植體經攜帶含有目的基因載體pBI121-Hyg的根癌農桿菌EHA105浸染后，在含有5mg/L潮霉素的抗性愈傷誘導及分化培養基上培養獲得再生芽作為抗性芽備用；壯苗培養步驟，將抗性芽從抗性愈傷組織上小心切取下來，切去褐化部位，轉接到壯苗培養基P中進行壯苗培養，壯苗培養基P配方為MS基本培養基+30g/L蔗糖+1.5mg/L6-芐氨基嘌呤+0.1mg/L吲哚丁酸+5mg/L硝酸銀+200mL/L椰汁+7g/L瓊脂+5mg/L潮霉素+150mg/L特美汀，pH=5.6-6.0,培養條件是溫度，光照強度2000Ix,光照時間16小時/天，培養時間為四周，每兩周繼代一次；生根培養步驟，挑取經過壯苗培養后高2-3厘米并有4-6片葉的抗性芽，切除基部愈傷組織，用由北京艾比蒂研究開發中心研制及銷售的ABT-I號生根粉配制得到的20mg/L的生根粉溶液浸泡10分鐘，轉接至生根培養基R中，生根培養基R配方為1/2MS基本培養基+0.1mg/L吲哚-3-乙酸+0.1mg/L萘乙酸+0.25mg/L吲哚丁酸+15g/L蔗糖+7g/L瓊脂+5mg/L潮霉素+150mg/L特美汀，培養條件是溫度，光照強度1800Ix,光照時間16小時/天，每兩周繼代一次，一般7-10天開始生根，25-35天可以達到出罐煉苗要求；煉苗步驟，將生長25-35天，根長3-5cm的生根苗開蓋煉苗，移栽至溫室。實例3本實例是以根癌農桿菌MP90介導將FT基因轉入云南元謀野生麻風樹進行培養，各工藝步驟具體如下準備步驟，選取合適的外植體經攜帶含有目的基因載體PBI121-FT的根癌農桿菌MP90浸染后，在含有20mg/L卡那霉素的抗性愈傷誘導及分化培養基上獲得再生芽作為抗性芽備用；壯苗培養步驟，將抗性芽從抗性愈傷組織上小心切取下來，切去褐化部位，轉接到壯苗培養基P中進行壯苗培養，壯苗培養基P配方為MS基本培養基+30g/L蔗糖+1.0mg/L6-芐氨基嘌呤+0.05mg/L吲哚丁酸+3mg/L硝酸銀+200mL/L椰汁+7g/L瓊脂+20mg/L卡那霉素+100mg/L特美汀，pH=5.6-6.0，培養條件是溫度25°C，光照強度1500Ix,光照時間16小時/天，培養時間為四周，每兩周繼代一次；生根培養步驟，挑取經過壯苗培養后高2-3厘米并有4-6片葉的抗性芽，切除基部愈傷組織，用由北京艾比蒂研究開發中心研制及銷售的ABT-I號生根粉配制得到的15mg/L的生根粉溶液浸泡10分鐘，轉接至生根培養基R中，生根培養基R配方為1/2MS基本培養基+0.05mg/L吲哚-3-乙酸+0.05mg/L萘乙酸+0.1mg/L吲哚丁酸+12g/L蔗糖+7g/L瓊脂+20mg/L卡那霉素+100mg/L特美汀，培養條件是溫度，光照強度2000Ix,光照時間16小時/天，每兩周繼代一次，一般地，7-10天開始生根，25-35天可以達到出罐煉苗程度；煉苗步驟，將生長25-35天，根長3-5cm的生根苗開蓋煉苗，移栽至溫室。以上三個實例所得的抗性芽的生根率統計如下表_實例序號I存活抗性芽數(棵)I生根苗(棵)I生根率~實例111_10_90.90_實例2121083.33“實例31126IlOl|80.16由上表可看出，采用本發明的培養方法，抗性芽的生根率能達到80、0%，遠高于現有技術的生根率，實用性強。權利要求1.一種麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于，步驟如下準備步驟，選用合適的外植體由根癌農桿菌浸染處理后，再經抗性愈傷誘導及分化培養基培養后獲得再生芽作為抗性芽備用；壯苗培養步驟，將抗性芽從抗性愈傷組織上切取下來，切去褐化部位，轉接到壯苗培養基P中進行壯苗培養；生根培養步驟，挑取經過壯苗培養后高2-3厘米并有4-6片葉的抗性芽，切除基部愈傷組織，用10-20mg/L的生根粉溶液浸泡纊15分鐘，轉接至生根培養基R中進行生根培養，直至生根苗達到出罐煉苗的技術要求；煉苗步驟，對達到出罐煉苗的技術要求的生根苗開蓋煉苗，移栽至溫室。2.根據權利要求1所述的麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于準備步驟中選用的外植體為帶有4-6片真葉的莖段，其長度為2-3cm。3.根據權利要求1所述的麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于所述準備步驟中使用的根癌農桿菌是如下攜帶含有目的基因載體的根癌農桿菌菌株中的任意一種EHA105、LBA4404、GV3101、MP90。4.根據權利要求1所述的麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于所述準備步驟中使用的抗性愈傷誘導及分化培養基含有1-3mg/L草胺膦或20-50mg/L卡那霉素或1-10mg/L潮霉素。5.根據權利要求1所述的麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于壯苗培養基P的配方為MS基本培養基+10-30g/L蔗糖+0.2-1.5mg/L6-芐氨基嘌呤+0.005-0.1mg/L吲哚丁酸+1-5mg/L硝酸銀+50-300mL/L椰汁+5-10g/L瓊脂+1-3mg/L草胺膦或20-50mg/L卡那霉素或l-10mg/L潮霉素+50-150mg/L特美汀，pH=5.6-6.0。6.根據權利要求1或5所述的麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于壯苗培養的培養條件是溫度M_28°C，光照強度1000-2000lx，光照時間12-18小時/天，培養時間為3-5周，每兩周繼代一次。7.根據權利要求1所述的麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于生根培養基R配方為:1/2MS基本培養基+0.01-0.1mg/L吲哚-3-乙酸+0.01-0.1mg/L萘乙酸+0.05-0.25mg/L吲哚丁酸+10-15g/L蔗糖+4-8g/L瓊脂+1-3mg/L草胺膦或20-50mg/L卡那霉素或1-10mg/L潮霉素+50-150mg/L特美汀。8.根據權利要求1或7所述的麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于生根培養步驟中，培養條件是溫度M_28°C，光照強度1000-2000lx，光照時間12-18小時/天，每兩周繼代一次。9.根據權利要求1所述的麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于抗性芽在生根培養基R中培養7-10天開始生根，25-35天左右達到出罐煉苗的技術要求。10.根據權利要求1或9所述的麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，其特征在于生根苗的根長為3-5cm即可進行煉苗。全文摘要本發明涉及一種麻瘋樹遺傳轉化苗的復壯及生根的培養方法，包括準備步驟，將外植體由根癌農桿菌浸染處理后，再經抗性愈傷誘導及分化培養基培養后獲得再生芽作為抗性芽備用；壯苗培養步驟，將抗性芽從抗性愈傷組織上切取下來，切去褐化部位，轉接到壯苗培養基P中進行壯苗培養；生根培養步驟，挑取經過壯苗培養后高2-3厘米并有4-6片葉的抗性芽，切除基部愈傷組織，用10-20mg/L的生根粉溶液浸泡8~15分鐘，轉接至生根培養基R中進行生根培養，直至生根苗達到出罐煉苗的技術要求；煉苗步驟，對達到出罐煉苗的技術要求的生根苗開蓋煉苗，移栽至溫室。本發明方法可明顯改善麻瘋樹遺傳轉化苗纖弱的生長狀態，提高生根率，為麻瘋樹的分子育種奠定了良好基礎。文檔編號A01H4/00GK102524064SQ20111042650公開日2012年7月4日申請日期2011年12月19日優先權日2011年12月19日發明者孫懷娟,李耿光,李艷梅,潘文歡,王梅珍,許文釗,陳小蓮申請人:普羅米綠色能源(深圳)有限公司