專利名稱：蘇云金桿菌固體發酵工藝及其在農業中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物，植物保護和土壤肥料領域。特別涉及蘇云金芽胞桿菌菌株利用玉米芯作為基質的固體發酵工藝及其在玉米秸桿促腐中的應用。
背景技術：
農作物秸桿是自然界中存在最豐富的一類可再生資源，我國年產各種農作物秸桿約5.7億U占世界秸桿總產量的20 % 30 % (畢于運，2008)，因此，農作物秸桿的循環利用，引起了廣泛關注。玉米秸桿是我國北方旱作區的主要秸桿之一，其還田再利用是目前較為普遍的農藝措施，也是一項培肥地力和增產增效的農藝措施。隨著秸桿還田實行少耕、免耕面積的不斷擴大，玉米秸桿直接粉碎還田等農藝措施的使用，自然情況下，秸桿腐解慢的問題則成為了影響·下茬作物產量的關鍵問題。在我國小麥-玉米輪作區，由于還田的玉米秸桿腐解時間較長，一方面，秸桿還田致使土壤變得過于松透，大孔隙過多，播種后土壤與種子不能緊密接觸，影響小麥種子發芽，到冬季又易造成小麥凍害；另一方面，也為鞘翅目害蟲蠐螬等地下害蟲在土壤中長時間存活提供了十分有利的孳生場所，這些未經腐熟的秸桿都是蠐螬良好的飼料，十分利于蠐螬的繁殖與生長，甚至導致蠐螬爆發(臧冬初等，2010)，給小麥生產又帶來潛在危害，影響小麥高產穩產。因此，目前急需一種能促進秸桿快速腐解，同時又對根部蠐螬等地下害蟲有效的材料和方法。目前已發現多種芽胞桿菌具有纖維素分解能力，篩選秸桿腐解效果好的芽胞桿菌已成為產纖維素酶微生物的一個重要方向(頓寶慶等，2008)。芽胞桿菌的優勢主要表現在以下方面:一方面，芽胞桿菌制劑在休眠期產生芽胞，芽胞具有耐受高溫和具有良好的貯存性能；另一方面，由于芽胞桿菌繁殖快，易于發酵，利于工業化生產。但是，目前發現的分解纖維素芽胞桿菌均未涉及對蠐螬的防治效果，因此，急需一種能夠實現促進秸桿腐解，又可以持續控制地下害蟲蠐螬，降低農藥殘留，實現秸桿促腐、保苗、增產的芽胞桿菌。
發明內容
有鑒于此，本發明提供蘇云金桿菌固體發酵工藝及其在農業中的新應用。該蘇云金芽胞桿菌的保藏編號為CGMCC N0.5437。該蘇云金桿菌能夠實現促進玉米秸桿腐解，同時持續控制地下害蟲蠐螬的目的，在降低農藥殘留的同時，實現小麥的增產，增收。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案:
本發明提供了一株蘇云金芽胞桿菌，其保藏編號為CGMCC N0.5437。該菌株經Bt殺蟲蛋白cry基因鑒定，存在對蠐螬有毒性的cry8Ea基因。本發明還提供了保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌高效分解秸桿菌株的獲得，所述秸桿為玉米秸桿，篩選方法采用水解圈測定和纖維素酶酶活測定。利用溫度篩選法(65°C水浴20min)對分離到的58株Bt菌株進行秸桿分解能力的篩選，具體方法采用Hart T D的水解圈測定法。將獲得的菌株分別轉接于玉米秸桿粉替代羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的鑒別培養基平板上培養24h，剛果紅染色培養好的平板，染色30min后，倒出染色液，再用NaCl洗滌15min，每菌株重復4次，測量水解圈直徑，保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌Bt HBl菌平均水解圈直徑為(1.8±0.06) cm，水解能力最強。將保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌Bt HBl菌分別接種到玉米秸桿粉替代羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)鑒別培養基上，在30°C，200rpm震蕩培養24 h，按照DNS法分別測定菌株的內切型葡聚糖酶(CMC酶)、濾紙酶(FPA酶)、和半纖維素酶的酶活，在玉米秸桿培養基上測得CMC酶酶活和FPA酶酶活分別達34.599U和27.396U，半纖維素酶酶活41.839U。再次證明該菌株對玉米秸桿有腐解作用。本發明還提供了一種菌肥，其包括保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌及肥料中可接受的佐劑。其對大黑鰓金龜二齡幼蟲7d的胃毒活性，LC5tl為6.43X IO6Cells/mL，毒力回歸方程為y=4.1909x+21.467。作為優選，所述蘇云金芽胞桿菌的含量彡109CFU/g。本發明還提供了上述菌肥的發酵工藝，包括如下步驟:
步驟1:挑取保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌置于LB液體培養基中，于30 37°C、200 220 rpm培養10 16h，得第一培養物；
步驟2:將所述第一培養物按5 10 %的接菌量轉接于LB液體培養基中，于30 37 0C >200 220 rpm培養20 28h，得第二培養物。步驟3:將第二培養物做為固態搖瓶發酵的種子液，按8 12%的接菌量轉接至固態搖瓶發酵培養基中，搖勻后30 37°C培養120 168 h，即得；所述固態搖瓶發酵培養基包括:玉米芯粉28 32重 量份，水68 72重量份，CaCO3 0.05重量份，K2HPO4 0.075重量份，MgSO4 0.035重量份。作為優選，上述菌肥的施用量為75 150kg/公頃。本發明還提供了一株蘇云金桿菌菌株及其在玉米秸桿促腐中的應用，該蘇云金芽胞桿菌的保藏編號為CGMCC N0.5437。包含保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌的菌肥在盆栽試驗和田間生產中的應用。在盆栽試驗中，通過設置不同的秸桿干粉用量、土壤質量和保藏編號為CGMCCN0.5437菌的固體發酵產物之間的不同比例，篩選經濟有效的配比，以確定在花盆中的最優使用配比和使用方法。通過試驗確定為I kg 土壤,加入玉米稻桿干粉4 5 g,包含保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌菌肥I 3 g，然后澆水，使土壤含水量為20% 25%為宜。10 d時，在添加蘇云金芽胞桿菌菌肥的處理組，玉米秸桿干粉的腐解率在51.6% 55.3%之間，而對照組腐解率在35.4% 39.2%之間，能夠快速腐解玉米秸桿，且秸桿腐解率隨時間的延長而提高。在田間，通過調查每畝玉米秸桿質量，設置不同發酵液用量和土壤含水量，篩選經濟有效的使用方法。通過試驗確定為:在玉米收獲后立即將玉米秸桿粉碎，翻耕，通過澆水或其他方法保持土壤相對濕度在65% 80%之間，將包含保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌的菌肥每667m2噴灑5 10kg，立即耕翻或者旋耕，使粉碎后的玉米秸桿和耕層土壤混勻，10 d時腐解率達到41.6% 57.8%。30 d時腐解率達到65.2% 77.5%，腐解率隨時間的延長而提高。出苗率增加8.2 16.8%，實現了快速腐解秸桿保苗的目的。本發明涉及該菌肥利用保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金桿菌用玉米芯粉發酵得到，菌株分離自土壤，玉米芯材料不造成環境污染，不影響土壤環境自身平衡，有利于土壤自凈；且其芽胞含量高、用量少，且無毒無致病性，對人畜安全，生產成本低；玉米秸桿的快速腐解能夠改善土壤的理化性質，為作物生長提供合適的土壤環境，減輕死苗、凍害及病蟲害給作物帶來的危害。對于秸桿的高效利用及后茬作物小麥的生產具有保苗增產作用。生物保藏說明
分類命名:蘇云金芽胞桿菌，Bacillus thuringiensis HBl菌株于2011年11月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.5437。
具體實施例方式以下敘述本發明的實施例。應該說明的是，這些實施例對本發明只有說明作用，沒有限制作用。本發明公開了一株蘇云金芽胞桿菌菌株及其在玉米秸桿促腐中的應用，特別需要指出的是，盡管在實施例中詳盡描述了保藏編號為CGMCC N0.5437菌株在玉米秸桿促腐中的應用，然而這并不意味著本發明的Bt HBl只限于對玉米秸桿的分解能力及在上述體系中的應用。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供了一株蘇云金芽胞桿菌，其保藏編號為CGMCC N0.5437。該菌株經Bt殺蟲蛋白cry基因鑒定，存在對蠐螬有毒性的cry8Ea基因。本發明還提供了保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌高效分解秸桿菌株的獲得，所述秸桿為玉米秸桿，篩選方法采用水解圈測定和纖維素酶酶活測定。利用溫度篩選法(65°C水浴20min)對分離到的58株Bt菌株進行秸桿分解能力的篩選，具體方法采用Hart T D的水解圈測定法。將獲得的菌株分別轉接于玉米秸桿粉替代羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的鑒別培養基平板上培養24h，剛果紅染色培養好的平板，染色30min后，倒出染色液，再用NaCl洗滌15min，每菌株重復4次，測量水解圈直徑，保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌Bt HBl菌平均水解圈直徑為(1.8±0.06) cm，水解能力最強。將保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌Bt HBl菌分別接種到玉米秸桿粉替代羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)鑒別培養基上，在30°C，200rpm震蕩培養24 h，按照DNS法分別測定菌株的內切型葡聚糖酶(CMC酶)、濾紙酶(FPA酶)、和半纖維素酶的酶活，在玉米秸桿培養基上測得CMC酶酶活和FPA酶酶活分別達34.599U和27.396U，半纖維素酶酶活41.839U。再次證明該菌株對玉米秸桿有腐解作用。本發明還提供了一種菌肥，其包括保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌及肥料中可接受的佐劑。其對大黑鰓金龜二齡幼蟲7d的胃毒活性，LC5tl為6.43X IO6Cells/mL，毒力回歸方程為y=4.1909x+21.467。作為優選， 所述蘇云金芽胞桿菌的含量彡109CFU/g。本發明還提供了上述菌肥的發酵工藝，包括如下步驟:步驟1:挑取保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌置于LB液體培養基中，于30 37°C、200 220 rpm培養12 16h，得第一培養物；
步驟2:將所述第一培養物按5 10 %的接菌量轉接于LB液體培養基中，于30 37 0C >200 220 rpm培養22 26h，得第二培養物。步驟3:將第二培養物做為固態搖瓶發酵的種子液，按8 12%的接菌量轉接至固態搖瓶發酵培養基中，搖勻后30 37°C培養120 160 h，即得；所述固態搖瓶發酵培養基包括:玉米芯粉28 32重量份，水68 72重量份，CaCO3 0.05重量份，K2HPO4 0.075重量份，MgSO4 0.035重量份。作為優選，上述菌肥的施用量為75 150kg/公頃。 本發明還提供了一株蘇云金桿菌菌株及其在玉米秸桿促腐中的應用，該蘇云金芽胞桿菌的保藏編號為CGMCC N0.5437。包含保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌的菌肥在盆栽試驗和田間生產中的應用。在盆栽試驗中，通過設置不同的秸桿干粉用量、土壤質量和保藏編號為CGMCCN0.5437菌的固體發酵產物之間的不同比例，篩選經濟有效的配比，以確定在花盆中的最優使用配比和使用方法。通過試驗確定為I kg 土壤,加入玉米稻桿干粉4 5 g,包含保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌菌肥I 3 g，然后澆水，使土壤含水量為20% 25%為宜。10 d時，在添加蘇云金芽胞桿菌菌肥的處理組，玉米秸桿干粉的腐解率在51.6% 55.3%之間，而對照組腐解率在35.4% 39.2%之間，能夠快速腐解玉米秸桿，且秸桿腐解率隨時間的延長而提高。在田間，通過調查每 畝玉米秸桿質量，設置不同發酵液用量和土壤含水量，篩選經濟有效的使用方法。通過試驗確定為:在玉米收獲后立即將玉米秸桿粉碎，翻耕，通過澆水或其他方法保持土壤相對濕度在65% 80%之間，將包含保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌的菌肥每667m2噴灑5 10kg，立即耕翻或者旋耕，使粉碎后的玉米秸桿和耕層土壤混勻，10 d時腐解率達到41.6% 57.8%，30 d時腐解率達到65.2% 77.5%，且腐解率隨時間的延長而提高。出苗率增加8.2 16.8%，實現了快速腐解秸桿保苗的目的。本發明涉及該菌肥利用保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金桿菌用玉米芯粉發酵得到，菌株分離自土壤，玉米芯材料不造成環境污染，不影響土壤環境自身平衡，有利于土壤自凈；且其芽胞含量高、用量少，且無毒無致病性，對人畜安全，對于秸桿的高效利用及后茬作物小麥的生產具有保苗增產作用。本發明提供的蘇云金芽胞桿菌菌株、菌肥中所用試劑均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明:
實施例1.高效分解纖維素Bt菌株篩選
對利用溫度篩選法(65°C水浴20min)得到的58株Bt菌株進行高效分解纖維素菌株的篩選。采用Hart T D (Hart T D，2002)的水解圈測定法。將獲得的菌株分別轉接于玉米秸桿粉替代羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)鑒別培養基平板上培養24h，然后用剛果紅染色培養好的平板，染色30min后，倒出染色液，再用NaCl洗滌15min，每菌株重復4次，測量水解圈直徑，比較各菌株的水解能力。結果如表I所示，其中保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金桿菌Bt HBl對玉米稻桿的分解能力最強,水解圈直徑達到(1.8±0.06) cm。實施例2.高效分解纖維素Bt菌株酶活分析將Bt HBl菌株分別接種到秸桿替代羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)鑒別培養基上，在30°C，200rpm震蕩培養72 h，按照DNS法分別測定菌株的內切型葡聚糖酶(CMC)、濾紙酶(FPA)、半纖維素酶的酶活。在玉米秸桿培養基上測得CMC酶酶活和FPA酶酶活分別達34.599U和27.396U，半纖維素酶酶活41.839U。再次證明該菌株對玉米秸桿有腐解作用。實施例3.Bt HBl菌基因型及殺蟲活性鑒定
參考蘇旭東等方法(蘇旭東，2005)對保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌BtHBl菌株的殺蟲cry基因進行crjd-9基因型鑒定，進行PCR分析及序列測定；結果表明，其存在crySEa基因，將該菌培養至胞晶分離，血球計數板計數，用無菌水連續稀釋I X IO8 lX103cells/mL六個濃度，加入到均勻一致的土豆塊中，以5-7日齡大黑鰓金龜幼蟲作為供試蟲種，每個處理接蟲10頭，重復四次，以同處理滅菌水為空白對照，，每天檢查死亡情況，計算校正死亡率與LC5tl及毒力回歸方程。其對大黑鰓金龜二齡幼蟲7d的胃毒活性，LC5tl為
6.43X 106cells/mL，毒力回歸方程為 y=4.1909x+21.467，毒性高 實施例4菌肥的發酵工藝
挑取LB平皿上的蘇云金芽胞桿菌單菌落放在3mL的LB液體培養基中，置30°C、220rpm恒溫搖床下培養16h,獲得第一培養物；
將第一培養物按1%的接菌量轉接在LB液體培養基中，置于30°C、220rpm恒溫搖床下培養28h，獲得第二培養物；
將第二培養物做為固態搖瓶發酵的種子液，按12%轉接至固態搖瓶發酵培養基中，搖勻后30°C培養168h ;該菌肥的固態搖瓶發酵培養基為:玉米芯粉28重量份，水72重量份，CaCO3 0.05 重量份，K2HPO4 0.075 重量份，MgSO4 0.035 重量份。晾干陰干，裝袋。實施例5菌肥的發酵工藝
挑取LB平皿上的蘇云金芽胞桿菌單菌落放在3mL的LB液體培養基中，置37°C、200rpm恒溫搖床下培養10小時，獲得第一培養物；
將第一培養物按10%的接菌量轉接在LB液體培養基中，置于37°C、200rpm恒溫搖床下培養20小時，獲得第二培養物；
將第二培養物做為固態搖瓶發酵的種子液，按8%轉接至固態搖瓶發酵培養基中，搖勻后37°C培養120h ;該菌肥的固態搖瓶發酵培養基為:玉米芯粉32重量份，水68重量份，CaCO3 0.05 重量份，K2HPO4 0.075 重量份，MgSO4 0.035 重量份。晾干，陰干，裝袋。實施例6 Bt HBl菌肥在盆栽中腐解玉米秸桿的方法
盆栽試驗中，在裝有1.5kg 土的花盆中，均勻混入8.0g玉米秸桿干粉和包含保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌菌肥3 5g，然后澆水保濕，使土壤含水量為20% 25%為宜。10 d時，玉米秸桿干粉的腐解率在51.6% 55.3%之間，而對照組腐解率在35.4% 39.2%之間，且稻桿腐解率隨時間的延長而提聞。實施例7 Bt HBl菌肥在玉米秸桿還田地塊促進玉米秸桿腐解的方法 玉米收獲后，將玉米秸桿粉碎，使粉碎的秸桿均勻平鋪在土表，澆水或保持土壤濕度使土壤相對濕度在65% 80%之間，將包含保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽胞桿菌的菌肥每667m2噴灑5 10kg，立即耕翻或者旋耕，使粉碎后的玉米秸桿和耕層土壤混勻，10 d時腐解率達到41.6% 57.8%。且腐解率隨時間的延長而提高。出苗率增加8.2 16.8%，實現了快速腐解秸桿保苗的目的。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.蘇云金芽孢桿菌(保藏編號為CGMCCN0.5437)在農業中的應用；所述應用為在玉米秸桿促腐中的作用；所述秸桿為干粉或濕秸桿。
2.一種菌肥，其特征在于，其包括保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽孢桿菌及肥料中可接受的佐劑。
3.根據權利要求3所述菌肥，其特征在于，所述蘇云金芽孢桿菌的含量>IO9 CFU/g。
4.根據權利要求3或4所述菌肥的固態搖瓶發酵工藝，其特征在于:包括如下步驟: 步驟1:挑取保藏編號為CGMCC N0.5437的蘇云金芽孢桿菌置于LB液體培養基中，于30 37°C、200 220 rpm培養10 16h，得第一培養物； 步驟2:將所述第一培養物按5 10 %的接菌量轉接于LB液體培養基中，于30 370C >200 220 rpm培養20 28h，得第二培養物； 步驟3:將第二培養物做為固態搖瓶發酵的種子液，按8 12%的接菌量轉接至固態搖瓶發酵培養基中，搖勻后于30 37°C培養120 168 h后即得；所述固態搖瓶發酵培養基包括:玉米芯粉28 32重量份，水68 72重量份，CaCO3 0.05重量份，K2HPO4 0.075重量份，MgSO4 0.035重量份。
5.根據權利要求3、4或5任一項所述菌肥，其特征在于，其施用量為75 150kg/公頃。
全文摘要
本發明屬于微生物、土壤肥料和植物保護技術領域。秸稈還田是一項培肥地力和增產增效的農藝措施。秸稈在土壤中腐解時間長將造成土壤空隙大，容易形成死苗、凍害、蠐螬等地下害蟲孳生等生產問題。本發明提供一種以玉米芯為主要原料，包含保藏編號為CGMCCNo.5437蘇云金桿菌的菌肥在盆栽實驗及秸稈還田土壤中的應用方法。盆栽試驗中添加菌肥的處理組，玉米秸稈干粉10d的腐解率在51.6%～55.3%之間，在田間，鮮秸稈10d時腐解率達到41.6%～57.8%之間，小麥出苗率增加8.2～16.8%，實現了快速腐解秸稈，對后茬作物小麥的生產也具有保苗增產作用。同時，該菌肥來源于土壤，不污染環境，生產成本低。
文檔編號C05F11/08GK103159511SQ20111042075
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者陸秀君, 劉文菊, 耿麗平, 郭巍, 劉云飛, 楊軍玉, 李瑞軍, 陶晡, 李靜, 劉廷輝 申請人:河北農業大學