專利名稱：提高水稻分蘗的小分子RNA Osa-miR393及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域。具體涉及一種控制水稻分蘗的小分子 microRNA0sa-miR393 及其作用的靶基因 L0C_0s05g05800. 1 和 L0C_0s04g32460，同時涉及該microRNA和靶基因在轉基因水稻中的應用。本發明利用網上microRNA數據庫克隆了一種屬于bHLB轉錄因子的小分子RNA 0sa-miR393，將其導入pNW55載體后，通過酶切連入雙元表達載體pCambial301，構建超量表達載體Ami393，并轉入水稻中花11。該microRNA超表達后的TO、Tl和T2代轉基因植株均穩定出現分蘗數目顯著性增加的現象。該基因及其與靶基因作用的模式對于闡述小分子RNA調控水稻的生長發育過程，控制植株分蘗及抗性能力方面具有重要的應用價值。
背景技術：
水稻作為重要的糧食作物，世界上三分之一以上的人以其為主食。為解決人口增長與耕地面積減少的矛盾，提高水稻單位面積產量仍然是人們面臨的巨大挑戰。在產量構成因素穗數、穗粒數和粒重中，穗數的多少在很大程度上受制于分蘗的發生量，因而分蘗是影響水稻與小麥等主要農作物單產的重要農藝形狀之一。同時，分蘗又是單子葉植物一種特殊的分枝現象，具有重要的發育生物學意義。探索控制水稻分蘗的分子機理將有助于生產上遺傳調控分蘗并促進植物分枝的分子機理研究，而水稻中與分蘗相關基因的分離與鑒定是控制水稻分蘗的分子機理研究的瓶頸。一些參與調控水稻分蘗的重要基因與擬南芥都屬于同源基因。如水稻 M0N0CULM1 (MOCl)和 Arabidopsis LATERAL SUPPRESSOR (LAS)是同源基因，分別在控制水稻和擬南芥花芽的分化方面具有重要意義。(Li X, Qian Q, Fu Z， et al· Control of tilleringin rice· Nature，2003，422 :618-621. Greb T，Clarenz 0， Schafer E，et al. Molecular analysis of theLATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axi11arymeristem formation. Genes Dev， 2003,17 :1175-1187.)已經得到了很多控制水稻和擬南芥分蘗的突變體，分別命名為more axillary growth (max) and dwarf (d)Mutants。這些突變體具有類似的表型分蘗增加和植株變矮。這些突變體性狀的形成都是由于獨腳金萌發素內酯(strigolactone)的合成或者信號傳導受限所導致的(Umehara M, Hanada A, Yoshida S, et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid planthormones. Nature, 2008,455 195-200 ； Gome ζ-RoIdan V,Fermas S,Brewer PB,et al. Strigolactone inhibition of shoot branching. Nature, 2008,455 :189-194.)。至目前為止，已經克隆出多個與水稻分蘗相關的基因，1個就是我國李學勇等研究的 MOCl 基因(Fengli Sun, Weiping Zhang, Guosheng Xiong, Meixian Yan, QianQian, Jiayang Li, Yonghong Wang. Identification and functional analysis of the MOCl interactingprotein 1 J. Genet. Genomics，2010，37 :69-77.)。另兩個則都是日本人研究的OsTBl基因和D3基因(Takeda T，Suwa Y, et al. The OsTBl gene negatively regulates lateral branching in rice.Plant J,2003,33 (3) :513-20.； Haifang Yan,Hiroaki Saika,et al. Rice tillering dwarf mutant dwarf3has increasedleaf longevity during darkness-induced senescence or hydrogen peroxide-induced celldeath. Genes genetic systems, 2007,82 (4) :361-366)。MOCl 基因是李家洋院士等以自然發生的一個單稈分蘗的突變體“mocl”為材料，采用圖位克隆的方法分離出來的控制水稻分蘗的關鍵基因。MOCl基因控制著腋生分生組織的起始和分蘗芽的形成，同時還有促進分蘗芽生長的功能。水稻OsTBl基因，是Takeda等基于與玉米TBI (Teosinte branched 1) 基因序列相似性采用同源克隆方法分離出來的。基因功能研究發現，OsTBl基因控制側芽伸長。OsTBl的過量表達抑制側芽的生長，過量表達的轉基因水稻植株分蘗數目顯著減少， 而側芽的起始不受影響。水稻中一個典型的突變體“fcl” (fine culml)被發現缺失OsTBl 功能，其表現為分蘗增多。D3基因是Ishikawa等最近以多蘗型矮稈突變體“Id3”為材料， 采用圖位克隆的方法分離出來的與水稻分蘗相關的又一新基因(Ishikawa S, Maekawa M， Arite T, et al. Suppression oftiller bud activity in tillering dwarf mutants of rice. Plant Cell Physiol，2005，46 :79-86.)。張等研究發現 0sa_MIR156e 在水稻中的表達量高低影響了水稻的分蘗數。水稻的分蘗是一個復雜的發育性狀，易受環境影響，故通常也被認為受數量性狀位點WTLs)控制。這方面的研究報道很多，至今至少已發現了 27個影響分蘗數目的數量性狀位點，分布在除第9染色體之外的其余11條染色體上，但不同研究者的結果很不一致，不僅QTL數目、在染色體上分布不一致，而且QTL的貢獻率、效應也不同。目前對QTL的分析在相當程度上還是建立在統計分析的基礎上，缺乏十分完善的分析方法及應用軟件來分析基因之間的互作，從而難以精細定位單個QTL以及分析其效應和互作方式，進而進行位點克隆或獲取目標QTL基因。控制分蘗數目的QTL也不例外，至目前為止還沒有通過圖位克隆的方法分離相關的QTL的報道，更未進行基因功能與表達調控分析。因此，現在各國都在創建各種突變體庫，并以此為平臺克隆基因，而更多的植物分蘗基因也有望通過此方法被克隆出來。 MicroRNA與植物的生長發育有著密切的關系。MicroRNA的正常表達是植物正常生長發育所必需的。人們最初通過提高或降低植物體中microRNA的表達量，或者通過改變microRNA中核苷酸以降低與其靶基因中堿基配對程度來研究植物microRNA的功能。MicroRNA miR393是一類高度保守的microRNA，盡管miR393的前體在不同的植物種類中差別很大，但是其成熟序列均是21個堿基。目前，在擬南芥，水稻，蘋果，楊樹， 苜蓿及番茄中均發現了 miR393 基因(Sunkar R, Zhu JK. Novel and stress-regulated microRNAs andother small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell,2004，16 :2001-2019 ; Navarro L. , Dunoyer P, Jay F, et al, A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressingauxin signaling. Science, 2006, 312 :436-439 ；Moxon S,Jing R, Szittya G, et al. Deepsequencing of tomato short RNAs identifies microRNAs targeting genes involved in fruitripening. Genome Res,2008,18 :1602-1609.)。 miR393通過調控IAA途徑中部分生長素受體mRNA的表達調控著植物的生長發育(Navarro L, Dunoyer P, Jay F, et al, A plant miRNAcontributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science, 2006, 312 :436-439)。同時 miR393 被認為正向調控了植物應對對病毒侵染、低溫、干旱、高鹽和ABA脅迫(Sunkar R，Zhu JK. Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAsfrom Arabidopsis. Plant Cell, 2004,16(8) :2001-2019 ；Navarro L,Dunoyer P,Jay F，et al. Aplant miRNA contributesto antibacterial resistance by repressing auxin signaling.Science,2006, 312(5772) :436-439. Gao P, Bai X，Yang L, et al. osa-MIR393 :a salinity-andalkaline stress-related microRNA gene. Mol Biol R印，2011，38 :237-242)。雖然對miR393 的功能進行了一定的研究，但是都集中于植物應對脅迫誘導，未見miR393調控植物分蘗的報導， 同時也未見miR393通過調控生長素受體蛋白基因mRNA的表達調控植物分蘗的報導。同時，植物中的microRNA及其對植物生長發育的影響是植物生物學研究領域中的一個熱點， 它為植物生物學的研究提出了新的研究思路。但是隨著研究的深入，越來越多的問題擺在人們面前有待解決，如microRNA對多個靶基因的網絡調控具體機制是怎樣的，microRNA作用過程中是否有放大效應，植物中究竟有多少microRNA，如何查清楚植物中的microRNA并找出它們的靶基因和揭示它們的功能。只有揭示其作用的靶基因后才能更好地進行功能研究，從而才可以弄清楚它在生命活動中的作用。就目前的研究來看，雖然各個物種中發現的microRNA數量已不少，但能說明microRNA的靶基因及其功能的直接證據并不多，而且多數是通過篩選突變體獲得的。相信，隨著microRNA研究技術的不斷成熟，將有更多的 microRNA及其靶基因被鑒定出來，并進行更為詳細的生物學功能的研究。
發明內容
本發明的目的在于提供一種控制水稻分蘗的基因0sa-miR393在轉基因水稻中的應用。通過控制0sa-miR393或其靶基因及其同源基因在水稻的表達量來控制水稻分蘗數， 從而形成理想株型，達到增產的目的。本基因的克隆還對闡明0sa-miR393基因家族的生物學功能有重要意義以及對植物分蘗的分子機理研究將具有極大的推動作用。實現本發明的技術如下1.人工超表達microRNA Osa-IiiiR393載體的構建通過網立占 http://www. mirbase. orR 找至Ij 0sa_miR393 的序列，把此 microRNA 序列輸入 microRNA 的設計應用網站 http //wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi ？ paRe = Home project = stdwmd自動合成四條引物，通過多輪PCR擴增，將microRNA片段連入適合于構建水稻人工干涉RNA的載體pNW55，同時通過酶切的方式連入植物雙元表達載體 pCambia 1301，命名為 Ami393。2.創建超表達0sa_miR393的轉基因水稻(T0，Tl和T2代)構建超表達載體Ami393，采用農桿菌EHA105介導的遺傳轉化方法，將超表達載體導入正常粳稻品種中花11，最后獲得超表達的組培苗67株，用載體上的引物序列027和 G4369進行PCR擴增檢測后共得到60株轉基因陽性植株，陽性率為89. 6%。作為對照的由正常粳稻品種中花11愈傷分化的組培苗30株，都種于大田。結果顯示超表達組培苗出現分蘗增多的表型。將Ami3933Tl代和T2代種子種植于大田后，分別在晚季和早季出現分蘗數目較對照中華11和轉空載體植株P1301顯著性增加的現象，說明0sa-miR393基因具有控制水稻分蘗的功能。3. 0sa-miR393 的應用單株收種并種植，直至T2代鑒定出純合植株，超表達植株的開花提前、分蘗數顯著性提高。有望通過調控0sa-miR393的表達從而達到控制水稻的分蘗數的目的，從而根據不同的水稻品種要求增加或者減少水稻的分蘗數，形成理想的水稻株型，達到提高水稻的產量的目的。4. 0sa-miR393靶基因的分析及Ami393中靶基因的表達分析通過網站 http://bioinfo3. noble. org/miRNA/miRU. htm 對 0sa-miR393 作用的靶基因進行了分析，網站預測有11個靶基因(見表1)。設計引物，用定量q-PCR的方法對其作用的靶基因在Ami393轉基因材料中的表達進行了分析，發現Tl代和T2代都只有兩個生長素受體基因 L0C_0s05g05800. 1 和 L0C_0s04g32460 (L0C_0s04g32460. 1 和 L0C_ 0s04g32460. 2)在Ami393中被顯著性的下調。表明0sa_miR393可能通過參與這兩個基因的表達，從而調控了植株的分蘗。表1 :0Sa-miR393作用的靶基因預測分析
權利要求
1.小分子RNA0sa-miR393在調控轉基因水稻分蘗中的應用。
2.小分子RNA 0sa-miR393 作用的靶基因 L0C_0s05g05800. 1 和 L0C_0s04g32460 在調控轉基因水稻分蘗中的應用。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程領域。具體涉及一種提高水稻分蘗數的小分子microRNAOsa-miR393，同時涉及該小分子RNA和其作用的靶基因在轉基因水稻中的應用。發明通過基因工程的方法得到超表達Osa-miR393的轉基因水稻。此超表達水稻穩定表現出分蘗數顯著性高于對照的表型，證實了Osa-miR393基因的功能。對其結合基因的表達分析表明，Osa-miR393通過影響靶基因LOC_Os05g05800.1和LOC_Os04g32460的表達具有調控植株分蘗的功能。通過基因工程技術提高或者降低Osa-miR393在水稻中的表達，能夠調控水稻分蘗，從而控制植株的株型，以達到高產的目的。
文檔編號A01H5/00GK102533760SQ20111038756
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月29日 優先權日2011年11月29日
發明者區曉勁, 夏快飛, 張明永, 王忍 申請人:中國科學院華南植物園