專利名稱：小麥法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS及其分離克隆、酶活性測定方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及一種參與小麥葉綠素、類胡蘿卜素等類異戊二烯物質合成的關鍵酶基因法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的分離克隆、酶蛋白的原核表達、 酶蛋白的分離純化及酶活性體外檢測技術。
背景技術：
類異戊二烯物質存在于所有生物體中，在植物中含量尤其豐富，是維持植物生長發育、光合作用等所必需的重要有機物質。目前，已經發現了 3萬余種植物類異戊二烯， 而且這個數字還在逐年增加。該類物質在生物體中具有各種不同的作用，可作為光合色素 (如葉綠素、類胡蘿卜素)、生長物質和植物激素(細胞分裂素、脫落酸、赤霉素和油菜素內酯)、膜結構的一部分如谷留醇、電子傳遞受體如質體醌、作為葡萄糖基化反應中葡萄糖的受體如多萜醇，并能調控細胞的生長(如異戊烯基蛋白，細胞分裂素)。此外，很多植物類異戊二烯還具有重要的商業價值如作為食物香料、飲料、維生素A、D、E，天然殺蟲劑如除蟲菊素和橡膠等。類異戊二烯物質的生物合成主要由甲羥戊酸途徑中的一系列酶酶促合成的，法呢基焦磷酸合酶(FPS ；EC2. 5. 1. 1/EC2. 5. 1. 10)是該代謝途徑中分支點的關鍵酶，通過類異戊二烯1 ‘ -4順序縮合的方式催化異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)，首先形成櫳牛兒基焦磷酸(GPP)，然后與另一分子異戊烯焦磷酸縮合形成一個多分支點的、特別重要的中間產物法呢基焦磷酸(FPP)，是控制整個代謝途徑的限速酶之一。目前已分別從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、7jC 禾S (Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghum bicolor)、橡膠(Hevea brasiliensis)等40種植物中分離克隆了法呢基焦磷酸合酶基因， 在本發明申請之前，還沒有公開或發表過關于從小麥(Triticum aestivum)中分離克隆法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS、編碼蛋白酶的原核基因表達、酶蛋白的分離純化及其酶活性體外檢測和動力學參數等研究資料信息。
發明內容
針對現有技術中在小麥中法呢基焦磷酸合酶基因相關技術的缺失，本發明的發明人提供了一整套關于小麥特別是品種“濟南13”法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS克隆、編碼蛋白酶的原核基因表達、酶蛋白的分離純化及其酶活性體外檢測和動力學參數測定的技術。 測得自小麥品種濟南13克隆獲得的法呢基焦磷酸合酶對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、 異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的Vmax分別為22. 7士 1.5、73. 5士 16. 9和 73. 0 + 10. 8ymol/min/mg ；Km 值分別為 0. 84士0. 14、1. 83士0. 79 禾口 1. 51 士0. 43 μ M ；Kcat 分別為 1.67士0.11、5. 42士 1.25 和 5. 38士0. 80S、Kcat/KM 分別為 1. 99xl06、2. 96xl06 和 3. Sexio6M-1S-1,由此證明克隆的小麥法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物學功能。本發明為進一步構建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達載體并轉化相應作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業價值的植物，探討法呢基焦磷酸合酶基因在受體植物中的過量表達與次生代謝產物、作物籽粒大小及粒重等重要農藝性狀的關系，進而提高農作物產量，以及對法呢基焦磷酸合酶基因內含子、外顯子及啟動子結構進行剖析，研究啟動子功能、開發有關分子標記提供重要技術儲備。本發明提供的小麥法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的編碼區基因序列如SeqID No 1所示，其編碼的氨基酸序列如Seq ID No 2所示。上述的小麥品種濟南13中的法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS是從小麥品種濟南13 中克隆獲得的，其中小麥品種濟南13中該基因cDNA總長為1399bp，翻譯起始密碼子ATG自 49位核苷酸開始，終止密碼子TAG位于1111位核苷酸處，在1310位核苷酸處有polyA尾巴。因此，小麥品種濟南13TaFPS全長cDNA包括1個48bp的5'非編碼區、1065bp編碼區和1個257bp的3'非編碼區，編碼一條包含354aa的多肽，分子量約為42kDa，其基因序列及氨基酸序列如Seq ID No 3所示；本發明的發明人提供了該基因的具體的分離克隆方法及其原核表達及酶活性檢測的方法為1.小麥葉片RNA的分離提取根據Trizol試劑盒的說明書進行。獲得的RNA保存在DEPC水中備用。2.第一鏈cDNA的合成按照Takara反轉錄試劑盒說明書進行。3.基因中間序列擴增、連接與轉化根據植物中FPS氨基酸序列的高度保守區設計基因中間序列擴增引物，擴增小麥 FPS的相應序列。上游引物為DFFPS:5' TGGTGTATTGAATGGCTTCAAGC3‘，其基因序列如Seq ID No 4 所示；下游引物為DRFPS 5' TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3‘，其基因序列如Seq ID No :5所示。根據一定條件進行PCR，利用DNA膠回收試劑盒回收461bp特異條
市ο將回收的DNA片段與pGEM-T Easy載體進行連接。利用熱激法轉化大腸桿菌DH 5 α，挑取陽性克隆，制備質粒DNA并進行DNA測序，通過NCBI比對獲得目的基因片段。4.利用RACE技術快速獲得基因末端序列4. IRACE 引物設計根據所獲得的461bp的基因中間序列，設計5' RACE和3' RACE引物。5' RACE 引物(DRFPS) :5' TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3‘，其基因序列如 Seq ID No 5 所示；3' RACE 引物(Fps-IS) :5' ACGGCTTCAGGGCAGTTGTTGGA3‘，其基因序列如 SeqID No 6所示。4. 2基因末端序列快速擴增根據Clontech Laboratories INC 的 SMARTTmRACE cDNA Amplification kit 的方法快速擴增基因的5'和3'末端，篩選重組子，并測序。4. 3基因中間序列和RACE序列使用Contig Express 9. 1拼接全長序列，然后對所得的contig序列進行人工校對。5基因全長序列的擴增
5.1基因全長引物的設計根據中間序列和RACE序列contig結果，設計全長擴增引物。上游引物序列為FPS-2F :5' GCTCCTTCTCGTCCCTTCT3 ‘，其基因序列如 Seq IDNo 7所示下游引物序列為1FPS-2R. 1 TAGCACCGTAGTTTATTGTTG3‘，其基因序列如 Seq ID No 8 所示；5. 2全長基因的PCR擴增以第一鏈cDNA為模板擴增全長目的基因，進行全長基因PCR產物的膠回收、連接、 轉化、PCR重組子檢測、質粒提取和測序，獲得全長序列為1399bp。6基因的原核表達6. 1基因原核表達引物設計根據所得全長序列測序結果，利用DNAMAN軟件把所得的基因序列翻譯成氨基酸序列，然后同NCBI已知生物法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列進行比對來確定小麥法呢基焦磷酸合酶基因的0RF，設計連入pLMl表達載體的引物。在基因的5'端，設計帶有核糖體結合位點(AGGAGGA)、限制性內切酶SalI酶切位點(GTCGAC)、起始密碼子、6個組氨酸密碼子以及含有法呢基焦磷酸合酶基因中編碼7個氨基酸的正向引物5' CGCGCGTCGACAGGAGG AATTTAAAATGAGAGGATCGCATCATCACCACCATCACGCGGCGGCGGCGGTGGCGTTGTC3 ‘基因序列如 Seq ID No :9所示；在基因的3'端，設計具有限制性內切酶Hind III酶切位點(AAGCTT)、終止密碼子(TAG)以及含有編碼7個氨基酸的反向引物5' CTGCAGAAGCTTCTATTTCTGCCTCTTGT AGATCTTC3‘，基因序列如 Seq IDNo 10 所示。6. 2基因原核表達載體的構建包括基因原核表達序列PCR擴增產物的酶切、酶切產物與載體的連接、轉化、陽性克隆重組子PCR鑒定、酶切鑒定、質粒DNA提取、DNA測序驗證。6. 3法呢基焦磷酸合酶基因表達首先進行法呢基焦磷酸合酶蛋白表達條件的優化，包括IPTG濃度、誘導溫度的優化等。根據確定的優化條件，進行法呢基焦磷酸合酶蛋白的大量表達。7法呢基焦磷酸合酶蛋白的純化利用離子交換柱分離純化法呢基焦磷酸合酶蛋白。過柱純化的蛋白質，裝于透析袋中在一定溶液中透析去鹽，純化的蛋白質于_86°C保存備用。8采用分光光度計檢測克隆獲得的法呢基焦磷酸合酶活性測得法呢基焦磷酸合酶對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP) 和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的 Vmax 分別為 22. 7士 1. 5,73. 5士 16. 9 和 73. 0士 10. 8 μ mol/min/ mg;KM 值分另Ij 為 0. 84 + 0. 14、1.83士0. 79 禾口 1. 51 士0. 43 μ M ;Kcat 分別為 1.67 士0. 11、 5. 42 士 1. 25 和 5. 38 士0. 80S-1，Kcat/KM 分別為 1. 99xl06、2. 96xl06 和 3. 56x106IT1S-1,由此證明克隆的小麥法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物學功能。本發明為進一步構建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達載體并轉化相應作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業價值的植物，探討法呢基焦磷酸合酶基因在受體植物中的過量表達與次生代謝產物、作物籽粒大小及粒重等重要農藝性狀的關系，進而提高農作物產量，以及對法呢基焦磷酸合酶基因內含子、外顯子及啟動子結構進行剖析，研究啟動子功能、開發有關分子標記提供重要技術儲備。
圖1為小麥品種濟南13法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列示意圖；圖2為小麥葉片RNA電泳圖譜，圖中1為DNA Marker I ；2-6為小麥濟南13的RNA樣品；圖3為小麥法呢基焦磷酸合酶基因中間序列PCR產物電泳圖譜，圖中IDNA marker ；2-11為小麥濟南13法呢基焦磷酸合酶基因中間序列的PCR產物，長度為461bp ；圖4為小麥品種濟南13法呢基焦磷酸合酶基因末端序列快速擴增PCR產物電泳圖，圖中 Al 為 DNA marker ；A2 為 3' RACE PCR產物，大小為 869bp ；Bl 為 DNAmarker ； B2為5' RACE PCR產物，大小為748bp ；圖5為小麥品種濟南13法呢基焦磷酸合酶基因的全長cDNA電泳圖，cDNA全長為 1399bp ；圖6為小麥品種濟南13法呢基焦磷酸合酶基因的ORF的PCR擴增電泳圖，引物 FPS-PLM1-F/FPS-PLM1-R 的 PCR 擴增產物長度為 1102bp ；圖7為含有小麥法呢基焦磷酸合酶基因ORF的pLMl質粒酶切電泳圖，圖中對含有目的基因的陽性克隆的質粒DNA利用Sal I和Hind III雙酶切后，獲得1085bp的目的片段；圖8為原核基因表達載體pLMl結構示意圖，圖中Ampcilin表示氨芐青霉素抗性，T7promoter為啟動子，poly linker為多克隆位點，EcoRI和Hind III為多克隆位點邊緣的限制性內切酶；圖9為純化的小麥品種濟南13法呢基焦磷酸合酶蛋白SDS-PAGE電泳圖，圖中1為純化的蛋白；2為蛋白質分子量標準；圖10為小麥法呢基焦磷酸合酶活性檢測方法示意圖。
具體實施例方式實施例1 (小麥葉片RNA提取)(1)用蛭石于恒溫培養箱(28°C )培養小麥品種濟南13長至三葉期。(2)液氮中將葉片研磨至粉末狀，移到DEPC處理的EP管中。(3)加入適量 RNAiso Plus。(4)室溫下靜置5Hiin。(5)加入l/5RNAiso Plus體積的氯仿。振蕩至乳白狀。(6)室溫下靜置5Hiin。(7) 12000g，4°C 離心 15min。(8)上清移到新的DEPC處理的EP管中，加入與上清等體積的異丙醇，混勻。室溫下靜置lOmin。(9) 12000g，4°C離心 lOmin。
(10)向沉淀中加入ImL用DEPC水配制的75%乙醇。12000g 4°C離心5min。(11)保留沉淀，通風櫥中干燥至無色。(12)加入40 ii L DEPC水溶解。半小時后分裝并電泳檢測。取0. 5 ii L和0. 8 ii L RNA樣品，1. 0%瓊脂糖非變性凝膠電泳，電壓140V，電泳30min，凝膠成像系統拍照紀錄，結 果如圖2所示。實施例2 (cDNA第一條鏈的合成)按照Takara反轉錄試劑盒的說明進行。(1)在microtube管中配制下列混合液
Oligo dT primer (50[j,m)Iul
dNTP Mixture (IOmM each)Iul
Total RNA<5ドg
RNase free dH20up to 10ド1(2)在PCR儀上進行下列條件的變性、退火反應65度5分鐘——冰上急冷。(3)在上述Microtube管中配制下列反轉錄反應液。
上述變性、退火后反應液10 U 1
5XPrimerscript TM BF4 ド 1
RNase inhibitor (40U/ul)0. 5 ド1
Primescript TM RTase (200U/ul)1 ド1
RNase FreedH204. 5 ド1(4)在PCR儀上按下列條件進行反轉錄反應42°C，60min ；70°C, 15min ；4°C冷卻。實施例3 (中間序列擴增)1中間序列的引物設計用ft~imer5. 0引物設計軟件和DNAMAN軟件，根據植物中FPS的氨基酸序列的高度 保守區設計引物。上游引物DFFPS:5' TGGTGTATTGAATGGCTTCAAGC3 ‘ (Seq ID No 4)下游引物DRFPS :5' TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3 ‘。(kq ID No 5)PCR 體系為cDNA 2ul、buffer 1. 5 ii L、Taq 酶 0. 3 ii L、dNTP 0. 7 ii L、DFFPS 0. 6 ii L、DRFFPS 0. 6 u L, ddH20 9. 8 ii しPCR 程序為94°C 3min、94°C 45s、55°C 45s,72°C lmin、72°C 6min，32cycles。2中間序列的PCR結果檢測取8iiL PCR擴增產物與Iii L溴酚藍混勻，點入1.5%瓊脂糖凝膠中，在120V電壓 下電泳45min，紫外凝膠成像系統觀察并照相。如圖3所示PCR得到一 461bp的DNA片段， 結果如圖3所示。3擴增片段的回收PCR產物經常規瓊脂糖凝膠(TaKaRa Agarose, 1. 5 %濃度)電泳，在紫外燈(波 長302nm)下觀察，割取目的DNA條帶。以DNA膠回收試劑盒(TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver2. 0，大連寶生物產品)回收特異條帶。
(1)在紫外燈下用干凈、無菌手術刀片切除含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體，此時應注意盡量切除不含有目的DNA部分的凝膠。(2)向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer。(3)混勻后75°C加熱融化膠塊，此時應間斷振蕩混合，使膠塊充分融化(約 610min)。(4)加入DR-I Buffer 1/2體積量的DR-II Buffer,吹吸混勻，當分離461bp的 DNA片段時，在上述溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。(5)將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(6)將上述操作的溶液轉移至Spin Column中，12000rpm，離心lmin，棄濾液。將濾液再加入Spin Column中，離心一次，可以提高DNA回收率。(7)加入 500 μ L Rinse A, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(8)加入 700 μ L Rinse B, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(9)重復 8—次。(10)將Spin Column安置于新的1. 5mL離心管上，在Spin Column膜中央處加入 25 μ L 60°C預熱的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置lmin。(ll) 12000rpm 離心 lmin，洗脫 DNA，-20°C保存 DNA 備用。4回收產物的電泳檢測取5μ L回收的中間序列PCR產物，用1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測回收效率。5PCR產物的連接根據回收片段的濃度確定產物和pGEM-T Easy Vector之間的比例。連接步驟如下(1)加入 DNA 3. 75 μ L，T 載體 0.25 μ L，輕輕混勻。(2)45°C水浴5min，立即轉入冰上5min。(3)再加入 T4 DNA 連接酶 0. 5μ L 和 2xRapid Ligation BufferO. 5 μ L 混勻，于 PCR儀上16°C連接16h以上。6轉化、培養(1)將5μ L連接液加入含50μ L感受態細胞的離心管中，吹吸混勻，冰上放置 30mino(2) 42°C水浴熱激90s，立即冰浴2min。(3)加入950yL LB液體培養基，置于37°C搖床，230rpm振蕩培養lh，使細胞復蘇并表達抗性。(4)3000rmp離心3min。于超凈工作臺中去900 μ L上清，留100 μ L。(5)取70 μ L菌液均勻地涂布于LB固體培養基上，剩余30 μ L涂布在另外一個LB 固體培養基上。37°C倒置培養12 16h，直至出現菌落。7陽性重組子鑒定用滅菌槍頭挑取單個白斑菌落于4mL含有100 μ g/mL Amp的LB液體培養基中， 230rpm，37°C過夜振蕩培養。以菌液為模板，用PCR方法對含有插入片段的克隆進行篩選。 菌液PCR反應體系和反應程序參照以上方法。取2. 5 μ L PCR反應產物，經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
8質粒DNA提取(1)取1500μL菌液加入Eppendorf管中，12000rpm，離心lmin，棄上清，浙干殘液。(2)加250yL solution I，置于渦旋振蕩器上振蕩，充分懸浮菌體。(3)加250 μ L solution II，輕輕顛倒混勻4-6次，室溫下lmin。整個過程不要超過 5min。(4)加 350 μ L solution III，輕輕混勻，室溫下放置 5min。(5) 12000rmp，離心 lOmin。(6)取上清液，移入柱中。8000rmp離心2min。(7)去廢液，力口入 500 μ L washing solutions, lOOOOrmp，lmin。(8)重復(7)。(9)去廢液，柱子于IOOOOrmp離心2min。(10)柱子室溫下放置lOmin。(11)將柱子套到新的Eppendorf管中，加入50 μ L Elution Buffer。室溫下放置 2min, IOOOOrmp 離心 2min。(Elution Buffer 預熱到 60°C效果最好)(12)-20°C 保存備用。9質粒DNA濃度檢測和測序取2. 5 μ L質粒于1. 0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測濃度。取15個陽性質粒送上海生工生物技術有限公司測序。10DNA序列分析通過DNAMAN和NCBI比對分析，獲得小麥法呢基焦磷酸合酶基因的部分序列。實施例4 (通過RACE技術快速獲得末端序列)RACE是基于PCR技術基礎上由已知一段cDNA片段，通過向兩端延伸擴增從而獲得完整的3'端和5'端的方法。該方法同篩庫法相比較，有許多優點首先RACE技術是通過 PCR技術實現的，無需建立cDNA文庫，可以在很短的時間內獲得有價值的信息。其次，只要引物設計正確，在初級產物基礎上就可以獲得感興趣基因的全長。再次，該技術節約了實驗時間和經費。IRACE引物的設計根據所獲得的461bp的基因中間序列，設計5' RACE和3' RACE引物。5' RACE 引物(DRFPS) :5' TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3‘ ； (Seq ID No 5)3' RACE 引物(Fps-IS) :5' ACGGCTTCAGGGCAGTTGTTGGA3‘。(Seq ID No :6)2第一鏈cDNA合成(1)①對于 5' -RACE-ReadycDNA
5'-CDS primer A 1 |aL SMART II A oligo 1 μ L DEPC water1 μ L②對于3' -RACE-Ready cDNARNA2μ L
3' -CDS primer A1 u LDEPC water2u L(2)微離心。(3)在 PCR 儀上進行 70 °C anin。(4)冰上放置anin，微離心。(5)向上管中分別加入
權利要求
1.小麥法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的編碼區基因序列如SeqIDNo :1所示，其編碼的氨基酸序列如Seq ID No 2所示。
2.如權利要求1所述的小麥法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS在構建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達載體并轉化相應作物上的應用。
全文摘要
本發明屬于分子生物學領域，涉及一種參與小麥葉綠素、類胡蘿卜素等類異戊二烯物質合成的關鍵酶基因法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的分離克隆、酶蛋白的原核表達、酶蛋白的分離純化及酶活性體外檢測技術。為進一步構建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達載體并轉化相應作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業價值的植物，探討法呢基焦磷酸合酶基因在受體植物中的過量表達與次生代謝產物、作物籽粒大小及粒重等重要農藝性狀的關系，進而提高農作物產量，以及對法呢基焦磷酸合酶基因內含子、外顯子及啟動子結構進行剖析，研究啟動子功能、開發有關分子標記提供重要技術儲備。
文檔編號A01H5/00GK102433349SQ201110383608
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月28日 優先權日2011年11月28日
發明者劉愛峰, 李永波, 李玉蓮, 楚秀生, 樊慶琦, 隋新霞, 高潔, 黃承彥 申請人:山東省農業科學院作物研究所