專利名稱：擬南芥wrky57基因及其制備方法和提高農作物抗干旱能力的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及以轉基因植物技術為主的農業生物技術，更具體地說，本發明涉及擬南芥WRKY57基因，同時，還涉及所述基因的制備方法和其在農業上的用途。
背景技術：
WRKY轉錄調控因子自成一個家族，是由于它們高親和性地結合在基因啟動子區W 盒(C/TTGACT/C)的典型且保守的 WRKY 結構域上(Eulgem T 等，2000，Trends Plant Sci.， 5 199-206)。WRKY基因家族是植物特有的超級基因家族，在其蛋白質N-端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和CX 4-5 CXnHXH/C(X為任一氨基酸)，屬于鋅指型轉錄調控因子。 WRKY蛋白質能特異地結合靶基因啟動子的DNA特異序列TTGACC(W盒)，從而調節基因表達(Eulgem T 等，2000，Trends Plant Sci. ,5 199-206 ；Yu 等 2001，The Plant Cell,13 1527-1539)。目前已知WRKY基因家族各成員基因的分子生物學功能主要參與并調控植物生長發育、形態建成、代謝調控和抗逆境信號轉導途徑建立。由此推測，隨著植物從低等到高等和從水生環境向陸生環境的演化，植物面臨著一系列與其生長發育、形態建成、代謝調控和抵抗逆境因子脅迫相關的信號轉導途徑的建立，WRKY基因家族可能是為了滿足植物上述信號轉導途徑建立所需而迅速擴增。多個WRKY基因家族的成員都參與了對生物脅迫的響應(Yu 等 2001，The Plant Cell，13 :1527_1539 ;Chen 等 2010，Mol Plant-Micro Interactions, 23 =558-565) 近年來，越來越多的證據證明WRKY基因家族成員在各種非生物逆境中起著關鍵的作用(Miller 等 2008，Physiologia Plantarum, doi 10. 1111/ j. 1399-3054. 2008. 01090. χ. )WRKY53通過跟ESR/ESP的拮抗作用在擬南芥的衰老中起重要作用(Ying Miao 和 Ulrike Zentgraf，2007，The Plant cell，19 :819_830)，WRKY53 組蛋白甲基化引起的表觀遺傳重編程控制擬南芥的衰老過程(Nicole等2009，The Plant Journal, 58 333-346). WRKY63 (AB03)介導了擬南芥對ABA的響應和對干旱的耐受性(Ren 等2010，The Plant Journal,63 417-429).另外，擬南芥的WRKY75蛋白調節了植物對磷的吸收和對根的發育過程(Ballachanda 等 2007，Plant Physiology, 143 1789-1801). WRKY10 (MINI3)跟HAIKU2的相互作用在調節種子大小過程中起著關鍵的作用(Luo等 2005，PNAS, 102 17531-17536).擬南芥WRKY44蛋白質協同整合植物體表毛發生和種子外表皮發育等兩條信號轉導途徑的建立(Johnson等，2002，The Plant Cell，14 :1359_1375)。 沙漠豆科植物Retama raetam的WRKY基因協同整合豆科植物抗旱性和種子休眠等兩條信號轉導途徑的建立(Pnueli L.等，2002，Plant J. ,31 :319_330)，而來源于灌叢(Larrea tridentate)的UWRKY21蛋白質作為植物激素ABA信號轉導途徑的激活因子參與ABA介導的灌叢抗旱性建立(Zou X.，等，2004，J. of Biological Chem.，279 :55770_55779)。但是，迄今為止擬南芥WRKY57基因的功能還沒有被真正揭示；關于WRKY57基因提高植物抗干旱能力的研究尚未見報導；該基因的功能還未被闡明。
發明內容
本發明是基于這樣一種發現而完成的，本發明人的最新研究工作證實，WRKY57基因的啟動子處的一個T-DNA插入突變體Salk-117358能顯著提高植物對干旱脅迫的抗性； 高表達相應的擬南芥WRKY57基因既能顯著地提高轉基因植物對植物逆境相關激素ABA的反應水平，又能提高轉基因植物的抗干旱水平。植物生長所處的周圍環境時刻多變，經常受到多個逆境因子的協同脅迫，對多個逆境因子脅迫適應性建立無疑是一個綜合協同整合過程，并與植物形態發生、發育和形態建成密切相協調。轉錄調控因子WRKY基因家族在這個綜合協同整合過程之中發揮十分重要的分子生物學功能，是植物對多個逆境因子脅迫適應性建立與植物形態建成協調整合的根本機制所在。從目前的基礎研究成果來看，轉錄調控因子WRKY基因能有效地增強植物對逆境因子脅迫的適應能力。因此，利用WRKY基因培育抗逆境能力顯著提高的農作物、園藝植物和牧草新品種將成為可能。因此，本發明的目的在于提供一種擬南芥WRKY57基因。本發明的另一目的在于提供所述基因的制備方法。本發明進一步的目的是提供利用所述基因在提高農作物抗旱能力方面的應用。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。☆除非另有說明，本發明中所采用的百分數均為質量百分數。A.本發明提供了一種從擬南芥中分離出的WRKY57基因，該基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID Na 1所述；該基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID Na 2所述。B.本發明提供了一種所述的WRKY57基因的制備方法，該方法采用下述步驟(1)將生長3周的Col-O野生型苗，采用Logemarm等(1987)的修改方法，提取總 RNA。(2) DNA 消化采用 Fermentas 公司的 DNaseI 進行 DNA 消化。取 3 μ 1 (約 3-5 μ g) RNA 樣品，2·5μ1 DNaseI, 2. 5 μ 1 IOX buffer for DNaseI,0. 5μ 1 RNase inhibitor, 16. 5 μ 1 DEPC-H20,混勻后37°C放置45min后放于冰上。加入2. 5 μ 1 2. 5mM的EDTA，混勻后65°C放置IOmin終止反應。(3)第一鏈的合成米用 Inventrogen 公司的 Reverse Transcription System Kit。加入1-3 μ 1經消化后的RNA樣品，1 μ 1的寡核苷酸，1 μ 1的3’ PCR primer,混勻后于70°C 溫浴 5min，然后置于冰上2min 后加入2μ 1 的 5 X first-strand buffer, 1 μ 1 DTT, 1 μ 1 dNTP Mix和1 μ 1的反轉錄酶，混勻后42°C放置Ihr后放于冰上。(4) cDNA的擴增將2 μ 1第一鏈合成產物與9 μ 1的脫離子的無菌水， 3μ IlOXExtaq PCR buffer, 2 μ 1 50 X dNTP Mix. 2 μ 1 5' PCR primer, 2 μ 1 3' PCR primer，和 0· 25 μ 1 Extaq Polymerarse 至 30 μ 1，稍離心進行 PCR。取 5μ1 PCR 產物進行瓊脂糖膠檢測。(5) cDNA的克隆與測定采用試劑盒所提供的載體，16°C連接過夜，轉化后提取質粒進行測序。C.本發明提供了利用所述基因在提高農作物抗旱能力方面的應用，主要進行了以下幾方面的研究工作(1)本發明獲得的擬南芥WRKY57基因，構建了相應的植物表達載體，轉化相應的
4農桿菌；(2)利用重組農桿菌介導農作物的外源基因轉化，將擬南芥WRKY57基因導入相應農作物，獲得相應的轉基因植物；(3)進行相應的農作物轉基因植物的抗干旱能力評估。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果1.本發明首次成功地從擬南芥中分離出WRKY57基因，并且確定了它的核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列；2.通過基因功能分析，揭示了擬南芥WRKY57基因能顯著地提高植物的抗干旱能力；3.由模式植物擬南芥內所證實的基因功能，也能有效地在其它重要經濟農作物內得到驗證和生產應用，預示著廣闊的應用前景。
圖1是擬南芥WRKY57的核苷酸序列；圖2是擬南芥WRKY57的氨基酸序列；圖3是高表達WRKY57轉基因植株的篩選；圖4是對WRKY57抗旱功能的比較；圖5是WRKY57植株與野生型植株失水率的比較圖；圖6是轉基因植株的抗旱水平顯著提高的效果的圖；圖7是轉基因植株與野生型植株失水率的比較圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例，對本發明作進一步清楚地說明，但它們并不是對本發明保護范圍的限定。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出的變形或者是等同的技術手段，均屬于本發明的保護范圍。實施例1-WRKY57cDNA 的克隆擬南芥總RNA的提取采用Logemann等(1987)的修改方法。根據Ferments公司的 Reverse Transcription System Kit 說明得到 WRKY57cDNA。根據擬南芥 WRKY57 基因核苷酸序列設計相應的引物，進行PCR擴增，獲得特異基因片段。隨后，將RT-PCR擴增產物克隆到pMDIS-T載體(大連TaKaRa公司)上，并測序和預測氨基酸序列，具體見圖1、圖2所示。
實施例2——高表達WRKY57轉基因植株的篩選將獲得的WRKY57全長cDNA克隆到p0CA30中。構建好的質粒轉化到農桿菌GV3101 中，采用活體植株農桿菌浸花法進行轉化，得到的轉基因種子采用含有卡那霉素(50yg πιΓ1)的MS培養基進行篩選獲得T1轉基因植株，進一步利用Northern blot analysis進行確認。試驗結果如圖3所示。實施例3
——抗干旱性分析生長4周的WRKY57突變體與野生型擬南芥植株，飽和給水ld，然后連續干旱3周， 試驗結果如圖4所示。生長4周的高表達WRKY57與野生型擬南芥植株，飽和給水ld，然后連續干旱3周， 試驗結果如圖6所示。實施例4——葉片蒸騰速率的測定取生長時間和大小相似的野生型和WRKY57突變體植株的葉片剪下后放在稱量盤中，置于實驗桌上，室內溫度為20°C，相對濕度為 50%，自然脫水，分別在0、20、40、60、 80、100、120、140、160、180、200分鐘進行稱量，試驗結果如圖4所示。取生長時間和大小相似的野生型和轉基因植株的葉片剪下后放在稱量盤中，置于實驗桌上，室內溫度為20°C，相對濕度為 50%，自然脫水，分別在0、20、40、60、80、100、 120、140、160、180、200分鐘進行稱量，試驗結果如圖7所示。
權利要求
1.一種從擬南芥中分離出的WRKY57基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID Na 1所述。
2.一種從擬南芥中分離出的WRKY57基因，其特征在于，該基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID Na 2所述。
3.—種權利要求1所述的WRKY57基因的制備方法，其特征在于采用下述順序的步驟(1)將生長3周的Col-O野生型苗，采用Logemarm的修改方法，提取總RNA；(2)DNA消化采用Fermentas公司的DNaseI進行DNA消化；取3_5 μ gRNA樣品，2. 5 μ 1 DNaseI,2. 5 μ 1 IOX buffer for DNaseI，0. 5μ 1 RNase inhibitor,16. 5 μ 1 DEPC-H20，混勻后37°C放置45min后放于冰上；加入2. 5 μ 1 2. 5mM的EDTA，混勻后65°C放置IOmin終止反應；(3)第一鏈的合成米用Inventrogen公司的Reverse Transcription System Kit ；力口入1-3 μ 1經消化后的RNA樣品，1 μ 1的寡核苷酸，1 μ 1的3’PCR primer,混勻后于70°C溫浴5min，然后置于冰上2min后加入2μ 1 的5Xfirst-strand buffer, 1 μ 1 DTT，1 μ 1 dNTP Mix和1 μ 1的反轉錄酶，混勻后42°C放置Ihr后放于冰上；(4)cDNA的擴增將2μ 1第一鏈合成產物與9μ 1的脫離子的無菌水，3 μ IlOXExtaq PCR buffer, 2 μ 1 50 X dNTP Mix. 2 μ 1 5' PCR primer, 2 μ 1 3' PCR primer,和 0· 25 μ 1 Extaq Polymerarse M 30 μ 1，稍離心進行PCR ；取5 μ 1 PCR產物進行瓊脂糖膠檢測；(5)cDNA的克隆與測定采用試劑盒所提供的載體，16°C連接過夜，轉化后提取質粒進行測序。
4.權利要求1或2所述的WRKY57基因在培育抗旱性植物品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種擬南芥WRKY57基因及其制備方法和應用。本發明的研究揭示了所述的WRKY57基因啟動子處的一個T-DNA插入而導致該基因高表達的突變體(Salk_117358)能顯著提高植物對干旱脅迫的抗性；高表達相應的擬南芥WRKY57基因也能顯著提高轉基因植物的抗干旱水平。因此，利用該基因培育抗干旱能力顯著提高的農作物新品種將成為可能。
文檔編號A01H5/00GK102358904SQ20111033508
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月30日 優先權日2011年10月30日
發明者余迪求, 姜艷娟 申請人:中國科學院西雙版納熱帶植物園