專利名稱：利用基因工程技術獲得無種子植株的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種利用基因工程技術獲得無種子植株的方法及其應用；具體地說，本發明是利用NapinB(油菜種子中的一個主要儲藏蛋白)基因啟動子控制的Barnase (核糖核酸酶)基因表達，構建載體轉化植物獲得無種子性狀的方法；其應用是基于該方法產生無種子植株并保持植株的無種子特性不因竄粉雜交而改變。
背景技術：
無籽育種是瓜果育種的一個重要方向，現在已經有很多無籽水果投放市場，如無籽西瓜、無籽葡萄、無籽獼猴桃等。目前，市場上的無籽水果大部分都是通過培育三倍體或誘導單性結實形式獲得。近年來，隨著生物技術的發展，利用基因工程手段研制無籽作物成為可能。與培育三倍體或誘導單性結實相比，使用基因工程手段獲得的無籽植物，克服了傳統無籽育種周期長、代價高等缺點。目前，使用轉基因技術獲得無籽植株的研究主要集中在利用外源基因直接或協同表達調節植物生長素，進而誘導單性結實，獲得無籽果實；或利用種皮特異表達 meganuclease (大范圍核酸酶)等活細胞毒素基因產生無籽果實。但是，這些方法一般都是通過雜交獲得，培育時間相對較長。且使用外源基因控制植物激素表達，由于外源基因的插入位點以及表達量很難控制，很難達到百分之百的單性結實，而且具有單性結實的植株需要去雄或與雄性不育系配套才能獲得無籽果實。Barnase 是解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)產生的一種胞外 RNA 酶，其編碼區長330bp，編碼一條含110個氨基酸殘基的肽鏈。同時，在淀粉芽孢桿菌基因組中還含有一個長273bp編碼Barnase特異性拮抗蛋白Barstar的基因，其產物能與Barnase 以一比一的比例結合，從而使細菌表達的Barnase失去酶活性。作為一種小分子的RNA酶， Barnase在細胞中的表達可以導致胞內RNA的非特異性降解，從而表現為強烈的細胞毒性， 其在特異細胞中的表達通常都會導致宿主細胞死亡。利用這一特性，Barnase已經被用于諸如控制腫瘤細胞的再生以及病毒復制等領域。在轉基因植物領域，Barnase基因最為重要和最為成功的應用還是通過控制其在花粉絨氈層中的特異表達抑制花粉的發育，而獲得轉基因植物雄性不育系。Mariani等通過構建花粉絨氈層特異啟動子PTA^調控Barnase基因表達的轉化載體(pTA^-Barnase)， 并轉化到煙草、甘藍型油菜、萵苣、番茄、棉花、玉米、花椰菜和菊苣等植物中，培育了轉基因雄性不育系。然后將轉基因雄性不育系與轉Barstar基因的轉基因恢復系植株雜交，其Fl 代花粉恢復育性。現在，通過組合使用轉化Barnase基因的雄性不育系、轉Barstar基因的育性恢復系和非轉基因受體育性保持系，已經成功實現了三系配套的雜交育種。目前，含有 Barnase基因的轉基因作物已經在多個國家被批準商業化種植和銷售，如商業化的轉基因雜交油菜雜交品種MSl X RFl、MSl X RF2禾Π MS8 X RF
發明內容
本發明的目的就在于克服現有技術存在的上述缺點和不足，提供一種利用基因工程技術獲得無種子植株的方法及其應用。利用該方法獲得的無種子植物的無種子特性不會因為外來花粉的竄粉雜交而改變，而且，該品種作為雜交親本與任何品系雜交都無種子形成，使得轉基因作物的生物安全性大大增加。本發明的目的是這樣實現的1、利用基因工程技術獲得無種子植物的方法本方法包括下列步驟①克隆或合成種子特異性表達油菜NapinB基因啟動子；②克隆或合成核糖核酸酶Barnase基因片段；③克隆或合成宿主植物肌動蛋白Actin基因內含子；④構建以含有內含子的Barnase基因為靶序列的遺傳轉化載體(如圖1)；⑤轉化并篩選轉基因植株(如圖2)；⑥檢測轉化株自交種子發育情況(如圖3)；⑦檢測轉化株與非轉化株雜交種子發育情況。2、利用基因工程技術獲得無種子植株的方法的應用本方法的應用是①利用以NapinB基因啟動子控制Barnase基因表達的遺傳轉化載體轉化植物獲得無種子轉化株；②利用以上方法獲得的無種子轉化株為親本與非轉化株進行雜交，獲得無種子性狀植物。與現有技術相比，本發明具有如下優點和積極效果①本發明可以轉化有種子植物獲得無種子性狀；②本發明獲得的轉基因品種作親本可以與任何親本(包括種子正常發育親本)雜交獲得無種子雜種；③本發明獲得的轉基因品種在外來花粉竄粉時不影響無種子特性。
圖1是含有內含子的Barnase基因遺傳轉化載體拼接示意圖，其中Napin Promoter為油菜種子特異性表達儲藏蛋白NapinB基因啟動子；Tobacco Actin Intron 為煙草 Actin 基因內含子；Barnase為解淀粉芽孢桿菌胞外RNA酶基因。圖2是轉化株PCR結果檢測圖，其中1-17樣為轉基因植株；P為質粒對照；N為非轉化株對照；M 為分子量 Marker。結果顯示全部轉基因植株都成功導入了構建體。圖3-轉化株種子形成過程中的花器官發育形態圖；結果顯示轉化株(A)和非轉化株(B)在花器官發育時期無明顯區別，但是轉化株
4不能正常發育形成種子，非轉化株可以正常發育形成種子。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例詳細說明本發明擬采取農桿菌介導的轉基因方法實現預期目標。具體方法如下1、基因片段克隆(I)NapinB(油菜種子中的一個主要儲藏蛋白)基因啟動子序列克隆根據NapinB基因上游非翻譯區序列(Genbank登錄號X14492)，設計并合成PCR 引物Pl =TCC TGC GTT ATC CCC TGA TTC TG禾口P2 :ATA ACT TCG TAT AAT GTATGC TAT ACG AAC GGT ATC GTG TAT GTT TTT AAT CTT GTT TG。以油菜中油 821 的基因組 DNA 為模板， 克隆NapinB基因的啟動子序列。擴增的序列稱為片段1。O) Barnase (核糖核酸酶)基因片段克隆由于Barnase在原核生物中的滲漏表達會造成宿主細胞的死亡，因此不能直接克隆至質粒載體。本發明采用在Barnase基因中間插入內含子的方法在大腸桿菌和農桿菌中穩定Barnase基因。根據Barnase基因的序列設計并合成PCR擴增引物P3 :TAC GCT AGC ATG GCACAG GTT ATC AAC ACG T 禾口 P4 :TGC GGG ACT CTA ATC ATA AAA ACC，P5 :CAC AAGCCC TCG GCT GGG T 禾口 P6:CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC。以含有 Barnase 和 Barstar 基因的質粒 pZA PNap Barstar L Barnase為模版，用引物組合P3/P4、P5/P6分兩段克隆Barnase基因。 擴增的兩段序列分別稱為片段2和片段3。(3)Actin(肌動蛋白)基因內含子序列克隆根據煙草Actin基因內含子的序列(GenBank登錄號X63603)設計引物P7 =ATC AGA TCT ATG GCC AAT TTA CTG ACC GTA CA 禾口 P8 :CTA CGT AAC ATT AAA ACATCT GAT GTT AAA GCA。以煙草基因組DNA為模版進行PCR擴增，克隆煙草Actin基因的內含子。擴增的片段稱為片段4。(4) PCR 反應體系模板 DNAl μ LUO XBuffer, lmmol/L Mg MgS04，0. 2mmol/L dNTPs,0. 5ymol/L Primers, 1UK0D Plus 高保真 DNA 聚合酶，加水至 50 μ 1。PCR 反應程序 94°C預變性anin ；94°C變性30s，64_60°C退火30s (每個循環降0. 5°C )，根據目標擴增產物長度，每1KB 68°C延伸lmin，循環8次；94°C變性30s，60°C退火30s，根據目標擴增產物長度，每1KB 68°C延伸lmin，循環25次；最后68°C補充延伸anin。2、片段拼接PCR產物純化后，利用連接PCR拼接目標片段。首先，利用T4多核苷酸激酶分別將PCR擴增得到的片段1和片段3磷酸化。然后把磷酸化后的片斷1和片段2混合，加入 T4DNA連接酶連接。連接完畢，以連接產物為模板，用引物組合P1/P4進行PCR擴增，獲得連接片段I ；利用同樣方法連接片段3和片段4，獲得連接片段II。最后，將連接片段I酸化后與連接片段II混合，用T4 DNA連接酶連接，以連接產物為模板，用引物組合P1/P6擴增出完整目標片段(圖1)。PCR反應體系和反應程序同上。3、測序(1)將四個基因片段拼接后的連接產物連接到測序載體
將擴展出來的完整目標片段和載體pZer0++Amp分別用I^st I和EcoRI進行酶切， 酶切反應體系分別為①酶切Buffer 10 μ 1，BSA 1μ l,Pst I和EcoRI各2 μ 1，85 μ 1回收純化 PCR 連接產物；②酶切 Buffer 5 μ 1，BSA 1 μ 1，PstI 禾口 EcoRI 各 1 μ 1，載體 pZero++Amp 5 μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ 1，兩個酶切體系分別置于37°C水浴鍋中酶切2小時。酶切后的產物通過iMDNA連接酶連接，連接反應體系為2. 5μ 1 IOx Fast-Link Ligation buffer、 22μ 1 回收純化PCR和 pZero++Amp 酶切產物、0. 5μ 1 Fast-Link DNA ligase，22°C 連接 2h。(2)轉化大腸桿菌獲得重組克隆制備大腸桿菌TOPlO感受態細胞。將上述連接產物與已經在冰上溶化的TOPlO感受態細胞混合均勻，置于冰上30min，42°C熱激90s，在冰上冷卻3min，將其轉至2ml離心管中，加900 μ L已經在37°C培養箱中預熱的LB培養基，放于37°C搖床，先150rpm搖15min， 再200rpm搖45min，搖完后將菌液在離心機上以5000rpm的轉速離心3min，棄上清，留下大約10 μ L與沉淀混勻，將其涂在含有氨芐青霉素的LB培養基上，37°C過夜。從過夜培養平板上挑取單克隆于100 μ L液體LB培養基中，放于37°C搖床200rpm搖2 3小時，以菌液為模版，用引物P3和P4進行PCR檢測。PCR反應程序為-MV 2min變性，94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30、25個循環，再721延伸&1^1。根據PCR結果鑒定目標基因是否裝入載體pZero 上。(3)拼接的基因片段的同源序列測序根據PCR結果，篩選陽性克隆，將獲得的陽性克隆委托北京三博遠志公司測序。4、轉化載體構建(1)利用計算機軟件blastN與clustalX等對測序產生的序列進行比對分析， 將序列比對無誤的陽性克隆中的基因片段通過Kpn I和EcoRI酶切組裝到植物轉化載體 ρΒΙ1οχΡ2 上，酶切體系為酶切 Buffer 5 μ 1, BSA 1 μ 1，KpnI 和 EcoRI 各 1 μ 1，載體ρΒΙ1οχΡ2質粒或陽性克隆質粒各5 μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ 1，分別置于37°C水浴鍋中酶切2小時，將酶切產物混合純化，最后用22 μ 1無菌雙蒸水洗脫后，加入2. 5μ 1 IOx Fast-Link Ligation buffer 禾口 0· 5 μ 1 Fast-Link DNA ligase，22°C連接 2h。(2)構建出重組載體 pBI IoxP2PNap TAibarnase05、遺傳轉化與組織再生以煙草為受體，利用農桿菌介導的葉盤法進行遺傳轉化。6、篩選轉化株在選擇培養基上篩選轉化株。待生長至一定大小后取葉片，采用CTAB法小量提取葉片基因組DNA，根據轉基因作物檢測標準進行PCR篩選驗證(圖2)。7、轉化株功能驗證檢測并統計分析轉化株種子形成過程中花器官發育情況，統計結果見表1，花器官各時期發育形態如圖3。表1轉基因和非轉基因煙草花器官發育不同時期對比分析Tablel The different stage of flower from transgenic and normal tobacco
權利要求
1.利用基因工程技術獲得無籽植物的方法，其特征在于包括下列步驟①克隆或合成種子特異性表達油菜NapinB基因啟動子；②克隆或合成核糖核酸酶Barnase基因片段；③克隆或合成宿主植物肌動蛋白Actin基因內含子；④構建以含有內含子的Barnase基因為靶序列的遺傳轉化載體；⑤轉化并篩選轉基因植株；⑥檢測轉化株自交種子發育情況；⑦檢測轉化株與非轉化株雜交種子發育情況。
2.按權利要求1所述利用基因工程技術獲得無籽植物品種的方法的應用，其特征在于①利用以NapinB基因啟動子控制Barnase基因表達的遺傳轉化載體轉化植物獲得無種子轉化株；②利用以上方法獲得的無種子轉化株為親本與非轉化株進行雜交，獲得無種子性狀植物。
全文摘要
本發明公開了一種利用基因工程技術獲得無種子植株的方法及其應用，涉及基因工程技術領域。本方法主要是①克隆或合成種子特異性表達油菜NapinB基因啟動子；②克隆或合成核糖核酸酶Barnase基因片段；③克隆或合成宿主植物肌動蛋白Actin基因內含子；④構建以含有內含子的Barnase基因為靶序列的遺傳轉化載體；⑤轉化并篩選轉基因植株。本發明可以轉化有種子植物獲得無種子性狀；獲得的轉基因品種作親本可以與任何親本雜交獲得無種子雜種；獲得的轉基因品種在外來花粉竄粉時不影響無種子特性。
文檔編號A01H5/00GK102352372SQ20111032691
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者盧長明, 吳剛, 武玉花, 草應龍, 陳桂敏 申請人:中國農業科學院油料作物研究所