專利名稱：防治溫室黃瓜白粉病木霉可濕性粉劑的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種農業病蟲害防治技術領域藥物的制備及其應用，具體是一種防治溫室黃瓜白粉病木霉可濕性粉劑的制備方法及其用途。
背景技術：
據FAO統計，自1970年以來，我國黃瓜栽培面積逐年增加，而且一直居世界首位。 2000年，我國黃瓜的栽培面積從1970年的24. 3萬hm2增加到100. 4萬hm2，增加了 3. 1倍， 占世界總栽培面積的56. 50%。由于日光溫室目前復種指數過高，土壤鹽漬化嚴重，病原過度積累，濕度過高，給白粉病的發生創造了有利條件。白粉病屬世界性病害，是由子囊亞門單絲殼屬真菌/Wigiflea)引起的黃瓜Wucumis sativus L.)葉部病害， 在黃瓜整個生長期都能產生危害，以中、后期發病較重。黃瓜白粉病由于具有潛育期短，再侵染頻繁、流行性強和周年發生等特點，常造成減產20% 40%。在我國，白粉病每年都給春季保護地和夏秋露地黃瓜帶來嚴重的經濟損失。我國南方和北方不論溫室、大棚及露地栽培的瓜地均有發生，且多發生在結果期及成熟期，若不及時防治，會導致植株葉片枯焦， 致使果實早期生長緩慢，植株早衰，嚴重影響瓜的品質和產量，是黃瓜生產上的三大病害之一。在武威市，白粉病是日光溫室蔬菜上的主要病害，常年發生面積在466. 7hm2左右，危害損失達50t，給武威市日光溫室蔬菜生產造成較大威脅。上海地區2011年黃瓜病害發生趨勢預報顯示，黃瓜白粉病屬中等偏重發生年概率60%，中等發生年概率40%。目前，國內對黃瓜白粉病的防治主要有以下四種措施
(一)選用抗病品種。在近年來國內推介的近50個黃瓜品種中，對白粉病表現抗耐病的有津研4號，津雜3號，津春4號，90-5、津春2號，津春1號、中農2號，中農8號，碧春、 春香，中農6號，中農1101，早抗(江蘇)，山西農大1號，露地3號(遼寧)，魯黃7號，華早1 號(湖北)，早春2號(廣東)。抗霜霉的品種一般都抗白粉病，如津研2號、津研4號、津綠4 號、津旺67、匯贏65等黃瓜品種。(二)加強栽培管理。在培育壯苗的基礎上，要施底肥，每667平方米施5000千克腐熟有機肥，50 80千克復合肥。定植后加強水肥管理，膜下暗灌，注意通風、透光，控制溫度，降低濕度，防止徒長和早衰。發病初期，要及時打藥防治，及時摘除病葉帶出田外深埋。 瓜拉秧后，徹底清除病殘體，深翻減少病害的侵染來源。(三)熏蒸防治及高溫消毒。在定植前，在20°C溫度上下的條件下用硫磺粉熏蒸， 或者用45%的百菌清煙劑閉棚熏蒸；
(四)藥劑防治。趙毅(浙江海正化工有限公司)等人創制微生物源殺菌劑長川素，該成分配制的各種制劑對黃瓜灰霉病、白粉病等菌病害有較好的防治效果。毛竹等用6%嘧肽菌凈水劑防治黃瓜白粉病，相對防效達83. 85%，顯著優于對照藥劑15%三唑酮粉劑300mg/L， 并且對黃瓜安全。浙江省亞熱帶作物研究所明確了洲的武夷菌素水劑在黃瓜白粉病上的防治效果，并指出防治成本較低。張少武等人發明了一種含嘧菌酯的農用殺菌劑，有效活性成分含量為1 60%，對黃瓜白粉病、葡萄霜霉病、蘋果黑星病有特效。辛增英等人文選用了安徽華星化工股份有限公司生產的30%百美懸浮劑進行試驗，結果表明該藥劑防治黃瓜白粉病效果好、安全性高。王麗等通過室內盆栽和田間藥效試驗，研究了唑菌酯對黃瓜白粉病的防治效果并證明效果良好。陳定花等用苯醚菌酯.戊唑醇防治黃瓜白粉病，效果明顯。楊桂秋等用具有殺菌活性的嘧啶取代丙烯酸酯類化合物，對黃瓜霜霉病具有很高的活性，同時對黃瓜白粉病也有一定的活性。杜學林等用植物乳油防治黃瓜白粉病，結果證明棉籽油、豆油、花生油、玉米油、芝麻油和葵花油6種植物油乳油稀釋至10、5m 1/L對黃瓜白粉病具有較好的防治作用。羅彩虹通過2年兩地的試驗，明確了 5%己唑醇SC對黃瓜安全、 對白粉病防治效果較好、持效期較長，藥后7天和14天校正防效均在80%以上，具有較好的推廣應用前景。范詠梅等人對5種殺菌劑，即80%成標(硫磺水分散劑)、50%翠貝(醚菌酯)、25%阿米西達SC、50%多菌靈WP、75%百菌清(寧可霜)，進行溫室黃瓜白粉病防效試驗，結果表明80%成標和50%翠貝能有效防治黃瓜白粉病，并有較強的保護作用。雷瓊實驗證明，25%烯肟菌脂乳油對黃瓜白粉病具有一定防治效果。周俊等用25%乙嘧酚懸浮劑噴施黃瓜，通過葉片和根吸收，產生內吸保護作用，起到防治白粉病的作用。喬康等選用50% 硫磺懸浮劑防治黃瓜白粉病，結果證明，二次用藥后白粉病防效均在70%以上。此外，由于保護地特殊的生態環境、蔬菜較高的經濟價值以及病害發生的頻率較高，研究者們正在試驗多種方法用來控制白粉病，除了不斷開發和尋求新型低毒低殘留化學藥劑外，人們還致力于天然植物和微生物源農藥的開發和應用，如唐蕊等人的研究表明大黃提取液對黃瓜的白粉病有很好的防治效果，于淑玲也發現一些中草藥的提取液對黃瓜白粉病有較好的防治效果。代光輝教授等用刺槐莖葉中提取物制得控制黃瓜白粉病發生的水劑，無公害、無污染、無殘留。石延霞等發現嗜線蟲致病桿菌代謝產生的抗菌素一帕克素對黃瓜白粉病也有很好的防治效果，此外劉彥良等研究了寧南霉素和多抗霉素對黃瓜白粉病的控制作用。然而，無論是農業防治、化學防治還是生物防治均存在一些難題急需解決。 據文獻報道，黃瓜高抗白粉病品種較少，保護地黃瓜抗病能力普遍較差。過度使用化學農藥易引起抗藥性和藥害。白粉病黃瓜栽培環境較難控制，在管理粗放，施肥、灌水不當，枝葉過密，通風不良，光照不足等情況下極易迅速發病、傳播。。目前生產上主要靠化學藥劑來控制白粉病，但黃瓜白粉病病原菌對化學藥劑的抗性速度上升較快，且短時間多次用藥殘毒較大。由于在白粉病防治中，長期、單一、大量采用三唑酮，致使病菌已對其產生抗藥性。曾有實驗表明，粉銹寧在黃瓜、豇豆發病中、盛期(發病率均95%以上)進行葉面噴霧，各種濃度對白粉病均有顯著的防治效果。但是目前已證明粉銹寧會嚴重抑制黃瓜生長，使用后30 天內生長特別緩慢，直接影響其經濟效益。常選用的甲基托布津、腈菌唑等防治黃瓜白粉病，但其效果均不夠理想，急需篩選更有效的藥劑。盡管化學農藥用量在逐年增大，但防效卻不斷下降。因此，構建對環境友好的生物防治技術不僅可以有可持續防治該病害，同時減少化學農藥的使用和對環境的污染，對農產品安全和綠色農業的發展具有重要意義。目前國內利用生防菌防治白粉病已有一些報道，楊文香等用三株鏈霉菌進行對黃瓜白粉病的防效及植株促生試驗，菌株M63防效明顯，具有應用前景。曹峰等用1000億個/ g枯草芽孢桿菌防治黃瓜白粉病，效果較好。馬華升等人用高產胞壁降解酶和抗菌肽的綠色木霉菌株發明了一種生防制劑，對黃瓜白粉病等蔬菜病害有較好的田間防效，顯著提高了蔬菜、瓜果的產品質量，減少了化學農藥的施用量，改善生態環境，提高食品安全性，顯示出廣闊的發展前景。目前除了楊春林、劉和現、馬華升等人報道過木霉菌防治黃瓜白粉病的實例及申請相關專利外，木霉菌對黃瓜白粉病防治的應用還不是很多。但是楊春林等的報道還處于學術理論研究，尚未有成品，應用推廣還尚需時日；劉和現等人的專利發明為木霉菌和毛殼菌的混合培養物，是在實驗室室內條件下的茄瓶中制成，大規模的生產還存在一定的局限，并且部分抗病效果的驗證是從室內平板對峙而來，大田效果未曾驗證；馬華升等人所申專利中，發酵培養基成份復雜，步驟繁瑣，不易規模生產。木霉菌作為國際公認的生防真菌，不僅能對至少四個屬18種的病原菌產生拮抗作用，并且已證明還能促進作物生長、 改良土壤環境、提高農產品品質。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術存在的上述不足，提供一種防治溫室黃瓜白粉病木霉可濕性粉劑的制備方法及其用途。本發明的可濕性粉劑是以哈茨木霉SH2303 {Trichoderma harzianum、為極心；該木霉菌株為華東地區分離的野生菌株，對蔬菜田微生物菌群無生態威脅；產孢量大，發酵培養基成分簡單，工藝容易優化，菌劑制備成本低；成分為厚垣孢子，耐儲藏，活性含量高。本發明的目的是通過以下技術方案實現的
本發明涉及一種防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，包括以下步驟 步驟一，種子液的制備，哈茨木霉菌株rricAoifeiTsa harzianum SH2303 CGMCC NO. 4963 在PDA培養基上培養2 3d，用打孔器打菌餅，以3片/瓶的接菌量，將菌餅接入種子培養基5 7d ；
步驟二，厚垣孢子液的發酵，將步驟一所得木霉菌株SH2303種子菌接入產孢培養基中，在發酵罐中優化培養條件下發酵5 7d，厚壁孢子達6 7X IO8個/mL ；
步驟三，制備厚垣孢子粉，將步驟二所得發酵液經真空泵抽濾，得含厚垣孢子濕菌塊， 將其置于低溫、干燥、通風廚里，干燥M 36h，粉碎，得木霉厚垣孢子粉；
步驟四，將步驟三得到的木霉厚垣孢子粉與載體、分散劑、穩定劑和保護劑混合，制得防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑。優選的，步驟一中所述的PDA培養基成份為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g， 7jC 1 OOOmL。優選的，步驟一中所述的種子培養基成份為玉米粉4g，水IOOmL;所述種子培養基PH值為4。優選的，步驟二中所述的產孢培養基成份為玉米粉40g/L、NH4H2P04 140g/L、牛肉膏 540g/L、Na3P04 340g/L、CuS04. 5H20 0. 0640g/L、ZnS04. 7H20 0. 0640g/L、MnS04. H20 0.0240g/Lo優選的，步驟二中所述的優化培養條件為轉速M0r/m，溫度^°C，pH 4，溶氧量 80mg/Lo優選的，步驟四中所述的載體為高嶺土或硅藻土 ；所述的分散劑為聚乙二醇、聚乙烯醇、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或亞甲基雙荼磺酸鈉；所述的保護劑為卵磷脂、甲基纖維素、脫脂奶粉或腐植酸；所述穩定劑為硝酸鉀。優選的，所述的載體為高嶺土 ；所述的分散劑為亞甲基雙荼磺酸鈉；所述的保護劑為卵磷脂；所述穩定劑為硝酸鉀。
優選的，所述各組分的重量百分比含量為木霉厚垣孢子粉1 10%、高嶺土 80 90%、卵磷脂0. 5 1%、硝酸鉀0. 1 1%、亞甲基雙荼磺酸鈉8 10%。優選的，所述各組分的重量百分比含量為木霉厚垣孢子粉1%、高嶺土 89%、卵磷脂0.65%、硝酸鉀0.25%、亞甲基雙荼磺酸鈉9. 1%。本發明還涉及一種上述制備方法制得的可濕性粉劑在制備防治溫室黃瓜白粉病藥劑中的用途。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明制得的可濕性粉劑防治黃瓜白粉病效果良好，且易于商業化大規模推廣，尤其適用于初生鹽漬化或連作障礙而真菌病害嚴重的設施菜田，具有很高的田間普遍使用價值。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。以下實施例中涉及的木霉菌具體為哈茨木霉菌harzianum菌株 SH2303，是從華東地區農田土壤分離、純化、篩選而來的，其保藏信息為該菌株已于2011 年6月17日遞交CGMCC中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為NO. 4963 ；保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所 100101。實施例1、木霉厚垣孢子粉的制備木霉厚垣孢子粉的制備包括以下步驟
步驟一，種子液的制備，哈茨木霉菌株Trichoderma harzianum SH2303 CGMCC NO. 4963在PDA培養基上培養2 3d，用直徑為5mm的打孔器打菌餅，以3片/瓶的接菌量， 將菌餅接入種子培養基5 7d ；
步驟二，厚垣孢子液的發酵，將步驟一所得木霉菌株SH2303種子菌接入產孢培養基中，在300L發酵罐中優化培養條件下發酵5 7d，厚壁孢子達6 7 X IO8個/mL ；
步驟三，制備厚垣孢子粉，將步驟二所得發酵液經真空泵抽濾，得含厚垣孢子濕菌塊， 將其置于低溫、干燥、通風廚里，干燥M 36h，粉碎，得木霉厚垣孢子粉。其中，步驟一中所述的PDA培養基成份為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水 IOOOmL ；所述的種子培養基成份為玉米粉4g，水IOOmL ；所述種子培養基pH值為4。步驟二中所述的產孢培養基成份為玉米粉40g/L、NH4H2PO4 140g/L、牛肉膏 540g/L、Na3PO4 340g/L、CuSO4. 5H20 0. 0640g/L、ZnSO4. 7H20 0. 0640g/L、MnSO4. H2O 0. 0240g/L ；所述的優化培養條件為轉速M0r/m，溫度^°C，pH 4，溶氧量80mg/L。實施例2、載體對菌落生長及孢子萌發的影響
步驟一菌絲生長速率測定。將載體以5mg/mL的濃度與融化的PDA培養基混合，滅菌后制成平板。用直徑為5mm的打孔器取生長旺盛、菌齡相同的木霉菌絲塊，接種在混合培養基平板中心，對照為普通的PDA平板，每個處理重復3次，48h后測菌落直徑。處理半徑記作 Rt，對照半徑記作Re，半徑比(％)=Rt / Rc *100。步驟二 孢子萌發率。將載體以5mg/mL的濃度與融化的PDA培養基混合，滅菌后制成平板。取0. ImL濃度為1000個孢子/mL的孢子懸浮液均勻涂布在混合培養基平板上， 以普通PDA平板作為對照，每個處理重復3次，放置于人工氣候箱內1 黑暗12 h光照培養，24 h后計算菌落數。處理孢子數記作Ct，對照半徑記作Ce，萌發率(％) =Ct / Cc *100 ；結果如表1所示。 表1載體對菌落生長及孢子萌發的影響
權利要求
1.一種防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一，種子液的制備，哈茨木霉菌株rricAoifeiTffia harzianum SH2303 CGMCC NO. 4963在PDA培養基上培養2 3d，用打孔器打菌餅，以3片/瓶的接菌量，將菌餅接入種子培養基5 7d ；步驟二，厚垣孢子液的發酵，將步驟一所得木霉菌株SH2303種子菌接入產孢培養基中，在發酵罐中優化培養條件下發酵5 7d，厚壁孢子達6 7X IO8個/mL ；步驟三，制備厚垣孢子粉，將步驟二所得發酵液經真空泵抽濾，得含厚垣孢子濕菌塊， 將其置于低溫、干燥、通風廚里，干燥M 36h，粉碎，得木霉厚垣孢子粉；步驟四，將步驟三得到的木霉厚垣孢子粉與載體、分散劑、穩定劑和保護劑混合，制得防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑。
2.根據權利要求1所述的防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，其特征在于， 步驟一中所述的PDA培養基成份為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。
3.根據權利要求1所述的防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，其特征在于， 步驟一中所述的種子培養基成份為玉米粉4g，水IOOmL ；所述種子培養基pH值為4。
4.根據權利要求1所述的防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，其特征在于，步驟二中所述的產孢培養基成份為玉米粉40g/L、NH4H2P04 140g/L、牛肉膏540g/L、 Na3P04 340g/L、CuS04. 5H20 0. 0640g/L、ZnS04. 7H20 0. 0640g/L、MnS04. H20 0. 0240g/L。
5.根據權利要求1所述的防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，其特征在于， 步驟二中所述的優化培養條件為轉速M0r/m，溫度^°C，pH 4，溶氧量80mg/L。
6.根據權利要求1所述的防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，其特征在于， 步驟四中所述的載體為高嶺土或硅藻土 ；所述的分散劑為聚乙二醇、聚乙烯醇、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或亞甲基雙荼磺酸鈉；所述的保護劑為卵磷脂、甲基纖維素、脫脂奶粉或腐植酸；所述的穩定劑為硝酸鉀。
7.根據權利要求6所述的防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，其特征在于， 所述的載體為高嶺土 ；所述的分散劑為亞甲基雙荼磺酸鈉；所述的保護劑為卵磷脂；所述的穩定劑為硝酸鉀。
8.根據權利要求7所述的防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，其特征在于， 所述各組分的重量百分比含量為木霉厚垣孢子粉1 10%、高嶺土80 90%、卵磷脂0. 5 1%、硝酸鉀0. 1 1%、亞甲基雙荼磺酸鈉8 10%。
9.根據權利要求8所述的防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑的制備方法，其特征在于， 所述各組分的重量百分比含量為木霉厚垣孢子粉1%、高嶺土 89%、卵磷脂0. 65%、硝酸鉀 0. 25%、亞甲基雙荼磺酸鈉9. 1%。
10.根據權利要求1所述的制備方法制得的可濕性粉劑在制備防治溫室黃瓜白粉病藥劑中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種防治溫室黃瓜白粉病可濕性粉劑及其制備方法和用途。制備方法為哈茨木霉菌株TrichodermaharzianumSH2303CGMCCNO.4963在PDA培養基上培養2～3d，用打孔器打菌餅，以3片/瓶的接菌量，將菌餅接入種子培養基5～7d；再接入產孢培養基中，在300L發酵罐中優化培養條件下發酵5～7d，厚壁孢子達6～7×108個/mL；將所得發酵液經真空泵抽濾，得含厚垣孢子濕菌塊，將其置于低溫、干燥、通風廚里，干燥約24～36h，粉碎，得木霉厚垣孢子粉；將其與載體、分散劑、穩定劑和保護劑混合，制得可濕性粉劑。本發明的可濕性粉劑采用的木霉菌株對蔬菜田微生物菌群無生態威脅；產孢量大，發酵培養基成分簡單，工藝容易優化，菌劑制備成本低；成分為厚垣孢子，耐儲藏，活性含量高。
文檔編號A01N63/04GK102388922SQ20111032295
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者孫興全, 李雅乾, 王秉麗, 陳捷 申請人:上海交通大學