專利名稱：小豹斑鵝膏菌絲體快速繁殖的方法
技術領域：
本發明涉及一種野生毒菌小豹斑鵝膏菌絲體室內快速培養的方法，屬于生物技術領域，具體地說是屬于有毒大型真菌室內培養范疇。
背景技術：
鵝膏菌屬―)隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鵝膏菌科 teceae)，是有毒的大型真菌中較特殊、較有價值的一個世界性廣布大屬,其物種多
樣性是非常豐富的。全球已報道近400種，中國已記錄的近100種(含亞種、變種及變型)。據考證，目前中國仍有不少種尚未研究和命名。但是如今隨著全球生態危機的出現，我國的 許多大型真菌資源已告危，處于嚴重衰退及瀕危狀態，而部份種面臨著可能還沒有被人類認識或發現其價值時，就已滅絕的風險。鵝膏菌屬中的大部份種屬于著名劇毒菌，據知，因誤食野生蕈菌中毒死亡者95%是因鵝膏菌所致。科學家們對鵝膏菌真正感興趣的是其毒性，因此，大約在140年前，人們就開始了鵝膏菌毒素的研究。鵝膏菌毒素可分為四類，其中最主要也是最重要的是肽類毒素，肽類毒素又包括鵝膏毒肽(amatoxins)、鬼筆毒肽(phallotoxins)和毒傘素類(virotoxins)三種。目前鵝膏毒素的應用研究主要體現在以下幾方面①可用于研究真核生物基因的表達、調控及細胞定位(amatoxins對真核生物RNA聚合酶II的活性有專一性抑制作用)；②可開發抗菌、抗病毒特效新藥；③可篩選抗腫瘤藥物；④可開發鎮靜、麻醉及其它特效藥；⑤可用于生物防冶。鵝膏菌屬大多屬于外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培。其絕大部份種仍屬于自然界中難培養或未能培養的微生物，難以人工、半人工栽培，難以開發利用。雖然已有少數的種能進行菌絲的純培養，但也存在一些問題，如菌絲生長緩慢、菌絲中毒素含量不高。鵝膏多肽毒素是一種由7-8個被修飾了的稀有氨基酸組成的環肽，可能不是基因編碼的直接產物，而是經過加工后的次級產物，要克隆毒素的基因是復雜而困難的，且其化學合成品也沒有活性。因此，至今國內外還沒有一種能規模化開發的毒素產品。現作為生化試劑的肽類毒素全部來源于歐美的毒鵝膏(Amanita phalloides)子實體，銷價在每克10萬美元以上。鵝膏種群小，個體少，產量低，分布數量極其有限。加之對生境敏感，一旦生境受到破壞，極易消失或滅絕，屬于特殊的致危生物類群，這更增加了其進一步被研究、利用的難度。我國的毒蕈資源，在宋代陳仁玉的菌譜就有了記載，比西方最早的同類研究專著早數百年，可惜由于我們對其研究、保護不夠重視，如今當我們要進一步利用、開發它時，面臨的卻是資源枯竭的危險。面對這些資源的悄然消失，我們還沒有被引起重視，我們還不積極采取各種措施來進行挽救，那這種損失將是無法彌補的。鵝膏的人工馴化或栽培是保證鵝膏資源可持續性利用的前提或關鍵，但此目前仍然屬于難以攻克的問題及盲點，其中菌絲難以誘導，菌絲生長非常緩慢是制約及影響人工培養的重要環節或因素。
小豹斑鵝膏(A. . parvipantherina)屬于漸危種，其種群分布及毒性具有代表性或共性，如以此作為研究對象，研究結果將對其它種群具有較好的借鑒作用。目前已成功分離到了該種的菌絲，但菌絲的生長前期仍然很慢，難以擴繁，本發明征對這個問題進行了重點突破。
發明內容
本發明的目的在于，提供一種簡單，生產成本低，能使鵝膏菌絲快速生長的固體培養方法。 本發明的技術方案，其步驟為
(1)材料的選擇野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘的幼嫩子實體；
(2)材料的消毒及處理將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄；
(3)菌絲體誘導用無菌刀片輕微除去菌蓋的表皮及周圍部份，將余下的菌蓋與菌柄交接的中部組織塊，切成約0. 10 0. 25cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為改良 SPDM培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 I. 00g /UKH2PO40. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，控制PH值為5. 4 5. 6，培養溫度為22 24°C，暗培養38 45天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
(4)菌絲體快速繁殖將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為0. 25cm2左右(最好帶有原子實體組織塊)，將其輕輕嵌入擴大培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /UKH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂12. 00g/L)，補充麥芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，谷氨酸0. 10 0. 25g/L，生長活性物質10 15mg/L，控制PH值為5. 4 5. 6，培養溫度為22 24°C，暗培養10 15天，菌絲長滿試管，換為大容器培養，長勢良好，生長速度很快，可以較大規模地進行固體培養。本發明的有益效果是采用簡單培養基，使菌絲能快速增殖，縮短了生長周期，其特點如下，
(1)操作簡單在改良SPDM培養基基礎上，只添加了麥芽汁、谷氨酸及生長活性物質，即可使菌絲在短時間內大量繁殖，
(2)周期短本發明使培養時間從45天左右縮短到15天左右，周期大大縮短；
(3)生產成本低；本發明的培養基配方中，只額外使用了三種簡單的物質即可以完成整個培養過程。而且這些物質成本比較低，這一點非常重要，否則關系到以后的生產規模及推廣使用等問題。
具體實施例方式以下的實施例子是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實例一
野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘的幼嫩子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄；
用無菌刀片輕微除去菌蓋的表皮及周圍部份，將余下的菌蓋與菌柄交接的中部組織塊，切成約0. 10 0. 25cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 0 波美)150ml，控制PH值為5. 4，培養溫度為22°C，暗培養40天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為0. 25cm2左右(最好帶有原子實體組織塊)，將其輕輕嵌入試管培養基表面，培養基為改良SPDM 培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO40. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(16. 0波美)150ml，谷氨酸0. 10g/L，生長活性物質10mg/L,控制PH值為5. 4，培養溫度 為22°C，暗培養10天，菌絲長滿試管。實例二
野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘的幼嫩子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄；
用無菌刀片輕微除去菌蓋的表皮及周圍部份，將余下的菌蓋與菌柄交接的中部組織塊，切成約0. 10 0. 25cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 5 波美)165ml，控制PH值為5. 6，培養溫度為23°C，暗培養42天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為0. 25cm2左右(最好帶有原子實體組織塊)，將其輕輕嵌入試管培養基表面，培養基為改良SPDM 培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO40. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(16. 5波美)170ml，谷氨酸0. 25g/L，生長活性物質13mg/L,控制PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養13天，菌絲長滿試管。實例三
野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘的幼嫩子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄；
用無菌刀片輕微除去菌蓋的表皮及周圍部份，將余下的菌蓋與菌柄交接的中部組織塊，切成約0. 10 0. 25cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(16. 0 波美)180ml，控制PH值為5. 4，培養溫度為24°C，暗培養38天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為0. 25cm2左右(最好帶有原子實體組織塊)，將其輕輕嵌入試管培養基表面，培養基為改良SPDM 培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. OOg /L、KH2PO40. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 0波美)180ml，谷氨酸0. 10g/L，生長活性物質15mg/L,控制PH值為5. 6，培養溫度為24°C，暗培養12天，菌絲長滿試管。實例四
野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘的幼嫩子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄；
用無菌刀片輕微除去菌蓋的表皮及周圍部份，將余下的菌蓋與菌柄交接的中部組織塊，切成約0. 10 0. 25cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 0 波美)170ml，控制PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養45天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為0. 25cm2左右(最好帶有原子實體組織塊)，將其輕輕嵌入500ml三角瓶培養基表面，培養基為改良 SPDM 培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 5波美)180ml，谷氨酸0. 20g/L,生長活性物質15mg/L,控制PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養15天，菌絲長滿三角瓶。實例五
野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘的幼嫩子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄；
用無菌刀片輕微除去菌蓋的表皮及周圍部份，將余下的菌蓋與菌柄交接的中部組織塊，切成約0. I 0. 25cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(16. 5 波美)150ml，控制PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養41天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為
0.25cm2左右(最好帶有原子實體組織塊)，將其輕輕嵌入1000ml三角瓶培養基表面，培養基為改良 SPDM 培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(16. 0波美)180ml，谷氨酸0. 25g/L，生長活性物質15mg/L,控制PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養15天，菌絲長滿三角瓶。權利要求
1.一種野生毒菌(小豹斑鵝膏)菌絲體室內快速培養的方法，其特征為，采用幼嫩的子實體菌褶誘導菌絲，對菌絲體進行優化培養，使其快速地大量繁殖，主要包括下列步驟 (1)材料的選擇野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘的幼嫩子實體； (2)材料的消毒及處理將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位； (3)菌絲體誘導用無菌刀片輕微除去菌蓋的表皮及周圍部份，將余下的菌蓋與菌柄交接的中部組織塊(含菌皺)，切成約0. 10 0. 25cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為改良 SPDM 培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L, CaCl2 I. 00g/UKH2PO4 0. 50g/L,NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，控制PH值為5. 4 5. 6，培養溫度為22 24°C，暗培養38 45天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲； (4)菌絲體快速繁殖將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為0. 25cm2左右(最好帶有原子實體組織塊)，將其輕輕嵌入擴大培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /UKH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂12. 00g/L)，補充麥芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，谷氨酸0. 10 0. 25g/L，生長活性物質10 15mg/L，控制PH值為5. 4 5. 6，培養溫度為22 24°C，暗培養10 15天，菌絲長滿試管，換為大容器培養，長勢良好，生長速度很快，可以較大規模地進行固體培養。
全文摘要
本發明涉及一種野生毒菌小豹斑鵝膏菌絲體室內快速繁殖的方法，屬于大型真菌培養技術領域。其特征為從未開傘的幼嫩子實體菌褶誘導菌絲體，簡單添加麥芽汁、谷氨酸及生長活性物質，使菌絲快速地大量繁殖。本發明培養基簡單，培養周期短，成本低，可較大規模地進行小豹斑鵝膏菌絲的固體培養。鵝膏屬是特殊珍貴的大型經濟真菌，其價值大應用范圍廣，在開發新特效藥如抗腫瘤、抗菌抗病毒、鎮靜或麻醉藥等領域具有潛在地應用，但至今因其資源珍稀、難以人工馴化、毒素的化學合成品無活性等問題尚難以開發應用。本發明征對鵝膏菌絲難以誘導、菌絲生長非常緩慢等制約培養的問題進行了創新性突破，為菌絲規模化培養及今后人工馴化栽培等提供了條件。
文檔編號A01G1/04GK102726207SQ20111028964
公開日2012年10月17日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者何雋, 劉弟, 吳鵬, 周文, 張曦予, 曹杰, 李宗菊, 李彪, 王鵬飛 申請人:云南大學