一株羅伊氏乳桿菌及其應用的制作方法

專利名稱：一株羅伊氏乳桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株羅伊氏乳桿菌及其應用。
背景技術：
飼料中添加抗生素對集約化畜牧業(yè)發(fā)展做出重大貢獻的同時，其產(chǎn)生的副作用如內(nèi)源性感染和二重感染、耐藥性的產(chǎn)生、腸道正常菌群的破壞和畜產(chǎn)品及環(huán)境中的殘留等對養(yǎng)殖業(yè)、動物以及人類食品安全帶來嚴重威脅，因此研究開發(fā)替代抗生素的新型綠色安全添加劑是目前飼料發(fā)展的重要方向。羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)是一種棲息于人和動物的腸道中，具有腸道表皮粘附能力的專性異型乳酸發(fā)酵菌，也是乳酸菌中重要的種群之一。美國食品和藥品管理協(xié)會(FDA)于1989年將羅伊氏乳桿菌列為安全的微生物菌種，并得到廣泛的應用。 我國衛(wèi)生部于2003年批準羅伊氏乳桿菌可用于保健食品的益生菌種。目前國內(nèi)羅伊氏乳桿菌主要用于人類酸奶食品中，且報道數(shù)量較少，而用于動物領域更鮮有報道，主要原因可能是該菌從分離鑒定到產(chǎn)品制備以及動物生產(chǎn)中的應用沒有系統(tǒng)的研究，從而限制了該菌種在動物領域的應用。因此，根據(jù)目前畜牧業(yè)的需求，研制開發(fā)一種羅伊氏乳桿菌制劑，具有廣闊的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri) RI021及其應用。本發(fā)明所提供的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 4650。該羅伊氏乳桿菌抗逆性強、抗雜菌能力強、具有益生特性。羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021具有以下生物學特性(1)在pH2. 0處理4小時之后的存活率為72% ；(2)在75°C水浴中加熱15min后的存活率為31. 7% ；(3)室溫下放置1個月后的存活率為85.6%;(4)接種在肉湯培養(yǎng)基于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22小時生長濃度最高，接近 1010cfu/ml (圖 1)。本發(fā)明的另一個目的是提供一種羅伊氏乳桿菌制劑，該制劑能夠替代現(xiàn)有的飼用抗生素，并具有抗病、促生長，改善腸道健康，提高免疫力的作用。本發(fā)明所提供的羅伊氏乳桿菌制劑，它的活性成分為所述的羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)RI021。所述制劑具有下述至少一種用途1)制備調(diào)節(jié)動物腸內(nèi)微生態(tài)平衡的產(chǎn)品；2)制備增強非特異性免疫的產(chǎn)品；
3)提高動物飼料轉(zhuǎn)化效率；4)促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收；5)制備降低動物腹瀉發(fā)病率的產(chǎn)品；6)制備提高動物生產(chǎn)性能的產(chǎn)品。上述羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021或制劑可用于制備大腸桿菌抑制劑。所述大腸桿菌抑制劑中的大腸桿菌具體可為大腸桿菌K88、大腸桿菌K99或大腸桿菌987P。所述提高動物生產(chǎn)性能可為提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，具體體現(xiàn)為提高仔豬平均日增重和/或仔豬平均日采食量。所述降低動物腹瀉發(fā)病率具體可體現(xiàn)為降低大腸桿菌感染仔豬腹瀉率；所述降低腹瀉率具體可體現(xiàn)為降低大腸桿菌感染仔豬腹瀉指數(shù)。所述制劑具體可由所述羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021和載體組成；所述載體具體可為稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精、麩皮中的至少一種。所述載體可經(jīng)過微粉化處理。經(jīng)過微粉化處理后，90%的粉體粒徑小于100 μ m，平均粒徑小于50 μ m,所述平均粒徑為50%粉體粒徑。所述制劑具體可為下述A) -F)中的任一種A)由所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑A，所述羅伊氏乳桿菌制劑A中，二者的配比為8克所述載體=IOltlCfu所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮的質(zhì)量比為2 :2:2:1;B)由所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑B，所述羅伊氏乳桿菌制劑B中，二者的配比為0. 5克所述載體107cfu所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮的質(zhì)量比為2 :2:2:1;C)由所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑C，所述羅伊氏乳桿菌制劑C中，二者的配比為0. 5克所述載體=IO8Cfu所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮的質(zhì)量比為2 :1:1:1;D)由所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑D，所述羅伊氏乳桿菌制劑D中，二者的配比為0. 4克所述載體109cfu所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮的質(zhì)量比為1 :1:1:1;E)由所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑E，所述羅伊氏乳桿菌制劑E中，二者的配比為0. 4克所述載體107cfu所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021 ；所述載體由脫脂奶粉和麩皮組成，所述脫脂奶粉和麩皮的質(zhì)量比為1:1;F)由所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑F，所述羅伊氏乳桿菌制劑F中，二者的配比為0. 4克所述載體=IOltlCfu所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉和麩皮的質(zhì)量比為1 1 1。本發(fā)明所述羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021或所述制劑可以作為添加劑用于制備動物飼料，其中的動物包括但不限于豬、牛、羊、雞等各種動物。該飼料具有與抗生素飼料類似的功能，但無抗生素飼料的副作用。所述動物飼料中，每克所述動物飼料中具體可含有IO7CFU以上的所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)RI021。本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌及其羅伊氏乳桿菌制劑主要作為動物飼料的添加劑，可替代現(xiàn)有動物日糧中的抗生素，調(diào)節(jié)動物腸內(nèi)微生態(tài)平衡，從而具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養(yǎng)因子、促進營養(yǎng)物的消化吸收、降低腹瀉、促進動物生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率、提高斷奶仔豬以及生長育肥豬的生產(chǎn)性能。本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌及其羅伊氏乳桿菌制劑對防治動物消化系統(tǒng)疾病起到保健作用，同時對幼年動物可刺激其胃腸道發(fā)育，所以將之作為飼料添加劑應用在飼料中能起到抗病促生長的作用。同時，本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌及其羅伊氏乳桿菌制劑無耐藥性和藥物在動物產(chǎn)品中殘留，不會對人類的健康產(chǎn)生潛在的危害，是一種有前途的綠色飼料添加劑。下面結合具體實施例詳細描述本發(fā)明，所述實施例用于理解而不是限制本發(fā)明。保藏說明菌種名稱羅伊氏乳桿菌拉丁名 Lactobacillus reuteri菌株編號RI021保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期2011年3月11日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 4650


圖1為羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021的生長曲線。圖2為平皿挖溝法測定乳桿菌培養(yǎng)物對大腸桿菌的抑制。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri RI021，可先接種于Rogosa SL瓊脂的Himgates滾管培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到的種子培養(yǎng)物再接種于Rogosa SL肉湯厭氧培養(yǎng)基里進行培養(yǎng)。其中所述的瓊脂培養(yǎng)基為適合羅伊氏乳桿菌培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，本領域技術人員都知曉何種培養(yǎng)基適合羅伊氏乳桿菌培養(yǎng)。具體可選用Rogosa SL瓊脂的Himgates滾管培養(yǎng)基，這里所述的Rogosa SL瓊脂的Hungates滾管培養(yǎng)基理解為在Rogosa SL完全選擇性培養(yǎng)基的基礎上，適當修改的適合羅伊氏乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基。所述適合羅伊氏乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以為現(xiàn)有技術任何適合羅伊氏乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，這為本領域技術人員所知曉，具體可為胰蛋白胨l_20g，牛肉膏l(xiāng)_20g，酵母浸粉l_15g，葡萄糖l_20g，阿拉伯糖l_15g，蔗糖l_15g，醋酸鈉5-25g，枸櫞酸鈉l_10g，磷酸二氫鉀l_15g，七水硫酸鎂 0. 1-1. 5g，四水硫酸錳 0. 1-1. 5g，硫酸亞鐵 0. 01-0. IOg,吐溫-80 0. 1-2. OmL，瓊脂 5_20g， 蒸餾水100-2500mL ；優(yōu)選為胰蛋白胨5_15g，牛肉膏5_15g，酵母浸粉3_10g，葡萄糖5_15g， 阿拉伯糖3-10g，蔗糖3-10g，醋酸鈉10-20g，枸櫞酸鈉l_5g，磷酸二氫鉀l_10g，七水硫酸鎂 0. Ι-lg，四水硫酸錳0. Ι-lg，硫酸亞鐵0. 01-0. 05g，吐溫-80 0. 5-1. 5mL，瓊脂10_15g，蒸餾水500-2000mL ；更優(yōu)選為胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g， 蔗糖5g，醋酸鈉15g，枸櫞酸鈉2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g,吐溫-801mL，瓊脂13g，蒸餾水1000mL。其中的液體培養(yǎng)基為適合羅伊氏乳桿菌培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，本領域技術人員也知曉這種液體培養(yǎng)基，其中可優(yōu)選肉湯厭氧培養(yǎng)基，這里所述的肉湯厭氧培養(yǎng)基理解為在普通肉湯厭氧培養(yǎng)基的基礎上，適當修改的培養(yǎng)基，所述適當修改的培養(yǎng)基可以為現(xiàn)有技術任何適合羅伊氏乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，這為本領域技術人員所知曉，優(yōu)選Rogosa SL肉湯厭氧培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨5-15g，酵母浸粉3-10g，葡萄糖5-15g，阿拉伯糖 3-10g，蔗糖3-10g，醋酸鈉10-20g，枸櫞酸鈉l_5g，磷酸二氫鉀l_10g，七水硫酸鎂0. I-Ig, 四水硫酸錳0. Ι-lg，硫酸亞鐵0. 01-0. 05g,吐溫-80 0. 5-1. 5mL,蒸餾水500_2000mL ；優(yōu)選為胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸鈉15g，枸櫞酸鈉2g， 磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g,吐溫-80 ImL,蒸餾 7jC 1 OOOmL。應用上述培養(yǎng)基，本領域技術人員一般都知曉具體培養(yǎng)過程，這里優(yōu)選為上述 Rogosa SL瓊脂培養(yǎng)基的Himgates滾管中培養(yǎng)，優(yōu)選在培養(yǎng)箱中，37°C下，培養(yǎng)15-72小時； 其中的羅伊氏乳桿菌擴大培養(yǎng)優(yōu)選在Rogosa SL肉湯厭氧培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)15-80小時。上述培養(yǎng)基的PH值可為6-7。所述的羅伊氏乳桿菌CGMCC No. 4650菌種液為經(jīng)過一次發(fā)酵、二次發(fā)酵或三次發(fā)酵所得的菌種液。其中所述的一次發(fā)酵、二次發(fā)酵或三次發(fā)酵的培養(yǎng)基中碳氮磷比為5 100 3 12 0.5 5;優(yōu)選 100 10 3。所述的羅伊氏乳桿菌制劑培養(yǎng)基，為任何適合制作羅伊氏乳桿菌制劑的培養(yǎng)基， 其培養(yǎng)基成分優(yōu)選為糖蜜、蔗糖、葡萄糖，三者的重量比為20-60份10-70份10-40 份。所述的羅伊氏乳桿菌制劑培養(yǎng)基，為任何適合制作羅伊氏乳桿菌制劑的培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基成分在上述培養(yǎng)基的基礎上還包括蛋白胨，其與糖蜜的重量比為10-30 份10-60 份。所述的羅伊氏乳桿菌制劑培養(yǎng)基，為任何適合制作羅伊氏乳桿菌制劑的培養(yǎng)基， 其培養(yǎng)基成分在上述培養(yǎng)基的基礎上還包括磷酸和/或可溶性磷酸鹽，其與糖蜜的重量比為 10-30 份10-60 份。所述的后處理為將羅伊氏乳桿菌菌液經(jīng)過一次、二次、三次發(fā)酵擴繁，將發(fā)酵菌液加入磷酸鹽緩沖液中，噴霧干燥即可，所述的磷酸鹽緩沖液的pH為6. 5 6. 7。本發(fā)明的動物飼料包括常用動物飼料和本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌制劑。其中羅伊氏乳桿菌制劑的含量至少為0. 001%，優(yōu)選為0. 001-3%，更優(yōu)選0.01% -2%，最優(yōu)選 0. 05% -0.2%。本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌制劑可以同目前市面上任何常用動物飼料進行配合，即本發(fā)明所述動物飼料保護范圍不為配合的常用動物飼料種類所限制。然而其中的常用動物飼料可優(yōu)選為日糧，進一步優(yōu)選為豬用日糧、雞用日糧、反芻動物用日糧和水產(chǎn)動物用日糧。對于不同的動物，其日糧的配方各不相同，但是，現(xiàn)有技術中公開的任何日糧都可以作為本發(fā)明的動物飼料，其配方都是該領域的公知常識。下述實施例中所用的培養(yǎng)基配方如下1、Rogosa SL 肉湯培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸鈉 15g，枸櫞酸鈉2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g,吐溫-80 lmL，用蒸餾水定容至1L。2、Rogosa SL 瓊脂培養(yǎng)基IL Rogosa SL肉湯培養(yǎng)基中加瓊脂13g。3、MRS肉湯培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，磷酸氫二鉀2g，枸椽酸二銨2g，葡萄糖20g， 七水硫酸鎂0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，醋酸鈉5g，用蒸餾水定容至1L。4、MRS瓊脂培養(yǎng)基IL MRS肉湯培養(yǎng)基中加瓊脂14g。5、葡萄糖營養(yǎng)肉湯蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，葡萄糖2. 5g，用蒸餾水定容至1L。實施例1、羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021的分離鑒定本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌是從豬胃腸道粘膜中提取、分離、篩選、純化得到的。(一 )羅伊氏乳桿菌的分離與純化1. 1試驗材料取健康仔豬胃腸道粘膜5cm2(胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結腸)，在滅菌杯中，用無菌生理鹽水沖洗粘膜上的食糜，將粘膜浸入裝有15mL HEPES緩沖液的燒杯中，用鑷子來回搖動粘膜5min后，得到上清液。1. 2菌株的分離培養(yǎng)用無菌注射器吸取0. 2mL上清液注入裝有Rogosa SL瓊脂培養(yǎng)基的Hungates滾管中，用手輕輕滾動使上清液均勻分布在管中瓊脂表面。放入5% 0)2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)72h 之后，在生物安全柜里無菌操作將白色針尖大小的菌落用針頭挑取轉(zhuǎn)移到厭氧無菌Rogosa 肉湯培養(yǎng)基里進行培養(yǎng)，觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的放置4°C冰箱貯藏備用。1.3革蘭氏染色用無菌注射器吸取少量Rogosa SL肉湯培養(yǎng)物，滴在載玻片上，在酒精燈火焰上輕輕烘干固定。滴加結晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革蘭氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 7)脫色30s，水洗；滴加沙黃染色液復染lmin， 水洗，待干，在普通光學顯微鏡上觀察，菌體呈紅色為陰性，紫色的為陽性。呈革蘭氏陽性形態(tài)一致的桿菌，進一步進行接觸酶試驗。1. 4接觸酶試驗做Rogosa SL斜面培養(yǎng)基，取培養(yǎng)物約0.2mL注入裝有Rogosa SL瓊脂培養(yǎng)基斜面，5% 0)2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)Mh，長出菌落后，將3%過氧化氫溶液滴加到菌落上，若沒有氣泡產(chǎn)生說明是陰性，若有氣泡產(chǎn)生說明是陽性。通過Rogosa SL上厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)物經(jīng)革蘭氏染色陽性和接觸酶試驗陰性可初步認為是乳桿菌屬(Lactobacillus)。2結果與討論本試驗從健康仔豬胃腸道粘膜中利用經(jīng)過鹽酸校正后Rogosa SL完全選擇性培養(yǎng)基篩選出6790株乳桿菌。將仔豬胃腸道粘膜在HEPES緩沖液中搖動5min，用無菌注射器吸取0. 2mL上清液裝入含Rogosa SL瓊脂培養(yǎng)基的滾管中培養(yǎng)Mh，再挑去白色菌落在厭氧無菌的Rogosa SL肉湯培養(yǎng)基里進行培養(yǎng)。經(jīng)過革蘭氏染色和接觸酶試驗，證明乳桿菌是健康仔豬胃腸道的優(yōu)勢菌群，說明經(jīng)鹽酸校正的Rogosa SL瓊脂培養(yǎng)基適合分離胃腸道粘膜乳桿菌。菌種的篩選是及其煩瑣的過程。大多數(shù)乳桿菌的選育過程是從消化道上皮分離益生菌，這樣便可以獲得具有良好定殖效果的菌種。( 二)羅伊氏乳桿菌的抗逆性選育1. 1耐酸性能選育制備pH值分別為2. 0,2. 5,3. 0,3. 5的Rogosa SL肉湯培養(yǎng)基，并分別接種已培養(yǎng) 24h的胃乳桿菌和腸乳桿菌，接種量1 %，于37°C培養(yǎng)24h后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐酸。從接種開始和第他用無菌注射器取出ImL進行梯度稀釋至10_5后，取0. 3mL 稀釋液在MRS瓊脂(pH5. 2)上均勻涂布，平皿放置在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)Mh，計算存活率。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長的乳桿菌菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。1. 2耐膽鹽性能選育 制備含豬膽鹽0. 3 %的麥芽汁培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)24h的菌培養(yǎng)物，接種量1 %，于培養(yǎng)24h后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐膽鹽。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長的乳桿菌菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。1. 3耐高銅性能選育制備含有250mg/kg五水硫酸銅的肉湯培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)Mh的菌培養(yǎng)物，接種量1%，于培養(yǎng)12-7 后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐高銅。然后鏡檢檢查是否染菌。能夠生長的乳桿菌菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。1. 4耐高鋅性能選育制備含有氧化鋅的肉湯厭氧培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)24h的菌培養(yǎng)物，接種量1%， 于培養(yǎng)12-7 后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐高鋅。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長的乳桿菌菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。2.結果與討論2. 1耐酸性能選育通過耐酸性能選育，6790株乳桿菌中，有4753株乳桿菌可以在pH2. O的Rogosa SL 肉湯培養(yǎng)基中生長繁殖，淘汰率為30%。這說明胃腸道的大多數(shù)乳桿菌耐酸性能較好，有70%的乳桿菌可以在仔豬的胃腸道中進行繁殖。乳桿菌一般通過定殖在消化道上皮發(fā)生益生特性。因此，如果菌種對胃酸沒有耐受性，很難對動物的生產(chǎn)性能產(chǎn)生良好的作用。2. 2耐膽鹽性能選育將通過耐酸性能選育的4753株乳桿菌進行耐膽鹽性能選育，有856株乳桿菌可以在含膽鹽0. 3 %的麥芽汁培養(yǎng)基中生長繁殖，淘汰率為82 %。研究表明，膽鹽是腸乳桿菌在動物胃腸道內(nèi)遇到的比胃酸更不利的因素。Chou和Weimer研究發(fā)現(xiàn)用膽鹽選擇性馴化乳桿菌對膽鹽的耐受力是有效的，經(jīng)過幾代膽鹽馴化之后得到的乳桿菌耐膽鹽的能力比親代乳桿菌強，乳桿菌容易對膽鹽性能產(chǎn)生耐受性，且具有一定的遺傳性，選育出耐膽鹽的羅伊氏乳桿菌在生產(chǎn)中具有重要的意義。2. 3耐高銅性能選育將通過耐膽鹽性能選育的856株乳桿菌進行耐高銅性能選育，有257株乳桿菌可以在250mg/kg五水硫酸銅的Rogosa SL肉湯培養(yǎng)基中生長繁殖，淘汰率為70%。證明該乳桿菌具有較強的耐高銅特性。由于高銅日糧具有促生長的作用，目前我國比較普遍使用的日糧，因此選擇具有耐高銅的羅伊氏乳桿菌是極其必要的。2. 5耐高鋅性能選育將通過耐高銅性能選育的257株乳桿菌進行耐高鋅性能選育，有77株乳桿菌可以在含氧化鋅的肉湯厭氧培養(yǎng)基中生長繁殖，淘汰率為70%。高鋅具有防止腹瀉、促進生長的作用，因此在我國利用氧化鋅來配制仔豬飼料，尤其是斷奶仔豬飼料的廠家很多。因此選育出耐高鋅的羅伊氏乳桿菌也是必要的。3.小結通過本試驗獲得77株來源于仔豬胃腸道粘膜，對消化道內(nèi)環(huán)境有一定抵抗能力的乳桿菌菌株，這為以后的選種工作打下了基礎。(三)羅伊氏乳桿菌的益生特性選育1. 1乳桿菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌能力的選育大腸桿菌(K88、K99和987P)購自中國獸藥監(jiān)察所。Κ88在中國醫(yī)學細菌保藏管理中心的保藏號為CMCC44742，K99在中國醫(yī)學細菌保藏管理中心的保藏號為CMCC44820， 987P在中國醫(yī)學細菌保藏管理中心的保藏號為CMCC44317。乳桿菌77株耐酸、耐膽鹽、耐高銅和耐高鋅的乳桿菌。培養(yǎng)基麥康凱(MacConkay)培養(yǎng)基(購自北京天壇生物制品股份有限公司)。在Hungates管里加MRS肉湯培養(yǎng)基約15mL，充二氧化碳，制成無菌厭氧MRS肉湯。每個管中分別接種從健康仔豬胃里分離到的77株耐酸、耐膽鹽、耐高銅和耐高鋅的乳桿菌，乳桿菌經(jīng)1 培養(yǎng)后按1 %接種于肉湯中，在37°C培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h后，置4°C冰箱保存?zhèn)溆?。抑制大腸桿菌試驗制作麥康凱培養(yǎng)基，加熱溶解后在121°C高壓滅菌15min后， 無菌傾倒平皿。用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區(qū)域，每個區(qū)域用接種棒劃線接種大腸桿菌培養(yǎng)液G.0X108CFU/mL)于培養(yǎng)基表面，然后在距平皿中線約3cm的地方挖一寬為0. 5cm的溝，溝與接種劃線垂直，用熱接種棒補底，如圖2所示。分別用不同的乳桿菌培養(yǎng)物將溝填滿(不能溢出)，置普通培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)1 后，觀察出現(xiàn)大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離。每個乳桿菌作兩個平行樣，以平均值表示結果。1. 2乳桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)抑制作用選育大腸桿菌(K88、K99和987P)來源與1. 1節(jié)同。乳桿菌65株腸代謝產(chǎn)物對大腸桿菌具有較強抑制作用的乳桿菌。大腸桿菌的檢測培養(yǎng)基麥康凱(MacConkay)培養(yǎng)基與1. 1同。乳桿菌接種于厭氧無菌MRS肉湯中，37 °C培養(yǎng)24h后，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 2. 1不同濃度乳桿菌對大腸桿菌的抑制隨機選擇一株乳桿菌，取5mL培養(yǎng)物(8. 2X109CFU/mL)分別與5、10、15mL營養(yǎng)肉湯混合，制成3個含不同乳桿菌培養(yǎng)物濃度的營養(yǎng)肉湯，接種大腸桿菌，接種量為培養(yǎng)液的 5%，置37°C，5% (X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4、8和1 后，分別用無菌注射器取出培養(yǎng)液，培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋成10_2 10_5后，每個稀釋度作4個平行樣，取0. 3mL稀釋液，用“L”棒均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上，置于37°C，普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，取菌落數(shù)在50 150個的平皿計數(shù)， 以平均值表示結果，計算每毫升培養(yǎng)液中大腸桿菌的數(shù)量。1. 2. 2含1/4乳桿菌的營養(yǎng)肉湯中乳桿菌與大腸桿菌的數(shù)量關系取5mL乳桿菌培養(yǎng)物(108CFU/mL)分別與15mL營養(yǎng)肉湯混合，接種24h大腸桿菌培養(yǎng)物，接種量分別為培養(yǎng)液的10% (107CFU/mL)，起始混合液中乳桿菌的數(shù)量為大腸桿菌的10倍，用0. IM NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH為7. 0，置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，分別用無菌注射器取出培養(yǎng)液，培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋至10_5，ΙΟ"6, ΙΟ"7后，取0. 3mL稀釋液用“L”棒均勻涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，每個梯度的培養(yǎng)液作3個平行樣，MRS瓊脂培養(yǎng)基(pH5. 4)置 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，取菌落數(shù)在50 150個的平皿計數(shù)，以平均值表示乳桿菌的數(shù)量，計算每毫升培養(yǎng)液中乳桿菌的數(shù)量。培養(yǎng)24h后直接用無菌注射器取ImL培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋至10_2后，取0. 3mL稀釋液置于麥康凱瓊脂上，用“L”棒均勻涂布，每個管做3個平行樣，將平板置于37°C，普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，計算每個平板的大腸桿菌菌落數(shù)，以平均值表示結果。1.3乳酸產(chǎn)量的選育乳桿菌63株抗大腸桿菌能力強的乳桿菌。MRS肉湯培養(yǎng)基用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5. 4，混合后裝進Hungates管，每管裝IOmL肉湯，趁熱充1.5% CO2 lmin，封口，高壓滅菌，制成厭氧無菌肉湯，63株乳桿菌分別經(jīng)該厭氧無菌肉湯培養(yǎng)24h后，再按接種于MRS肉湯中培養(yǎng)20h。取2mL培養(yǎng)液，3500rpm離心 15min，取上清液，用超純水稀釋10倍后，用D-乳酸檢測試劑盒(編號K-DATE，上海寶曼生物科技有限公司)和Technicon RA 100生化儀酶法測定上清液中的乳酸濃度。每個菌株測兩個平行樣，以平均值表示結果。2 結果2. 1乳桿菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌的選育乳桿菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌的效果以離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離為指標，距離越大，說明抑菌效果越好。本試驗所采用的平皿挖溝法是對經(jīng)典的平皿挖孔法的改進，基本原理是放置在溝中的抗菌物質(zhì)能滲透過瓊脂來抑制大腸桿菌，隨著離溝距離的增大，能滲透過去的抗菌物質(zhì)的濃度就越小。大腸桿菌菌落與小溝的距離越大，說明乳桿菌代謝產(chǎn)物所含抗菌物質(zhì)的抑菌能力越強。用平皿挖溝法在同一平皿可以同時測定乳桿菌代謝產(chǎn)物對3株大腸桿菌的抑制作用，而用平皿挖孔法在同一平皿只能測定對一株大腸桿菌的抑制作用。有65株乳桿菌對大腸桿菌K88和K99的抑菌距離在1. 0 2. 7cm之間，進一步研究它們與大腸桿菌混合培養(yǎng)的數(shù)量關系。其中，乳桿菌RI021對大腸桿菌K88、 987P和K99的抑菌距離分別為2. lcm、2. 2cm、1. 9cm。2. 2乳桿菌與大腸桿菌體外培養(yǎng)的數(shù)量關系2. 2. 1不同比例乳桿菌RI021培養(yǎng)液與大腸桿菌在混合培養(yǎng)條件下的數(shù)量關系。結果見表2。表2營養(yǎng)肉湯中含不同比例乳桿菌RI021培養(yǎng)液對大腸桿菌的抑制作用(單位 CFU/mL)
權利要求
1.羅伊氏乳桿菌(LactcAacillusreuteri)RI021，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 4650。
2.—種羅伊氏乳桿菌制劑，其特征在于所述制劑的活性成分為權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)RI021。
3.根據(jù)權利要求2所述的制劑，其特征在于所述制劑具有下述至少一種用途1)制備調(diào)節(jié)動物腸內(nèi)微生態(tài)平衡的產(chǎn)品；2)制備增強動物非特異性免疫的產(chǎn)品；3)提高動物飼料轉(zhuǎn)化效率；4)促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收；5)制備降低動物腹瀉發(fā)病率的產(chǎn)品；6)制備提高動物生產(chǎn)性能的產(chǎn)品。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的制劑，其特征在于所述制劑由權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021和載體組成；所述載體為稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮中的至少一種。
5.根據(jù)權利要求4所述的制劑，其特征在于所述制劑中，權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri) RI021 和所述載體的配比為(IO7-IOiq) cfu (0. 4-8)克載體；所述制劑具體可為A)-F)中的任意一種A)由權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillusreuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑A，所述羅伊氏乳桿菌制劑A中，二者的配比為8克所述載體 IOltlCfu權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮的質(zhì)量比為 2 · 2 · 2 ·B)由權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillusreuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑B，所述羅伊氏乳桿菌制劑B中，二者的配比為0. 5克所述載體 IO7Cfu權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮的質(zhì)量比為 2 · 2 · 2 ·C)由權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillusreuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑C，所述羅伊氏乳桿菌制劑C中，二者的配比為0. 5克所述載體 IO8Cfu權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮的質(zhì)量比為 2:1:1:1;D)由權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillusreuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑D，所述羅伊氏乳桿菌制劑D中，二者的配比為0. 4克所述載體 IO9Cfu權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉、麥芽糊精和麩皮的質(zhì)量比為 1:1:1:1;E)由權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillusreuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑E，所述羅伊氏乳桿菌制劑E中，二者的配比為0. 4克所述載體: IO7Cfu權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri) RI021 ；所述載體由脫脂奶粉和麩皮組成，所述脫脂奶粉和麩皮的質(zhì)量比為1 1;F)由權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021和所述載體組成的羅伊氏乳桿菌制劑F，所述羅伊氏乳桿菌制劑F中，二者的配比為0. 4克所述載體 IOltlCfu權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021 ；所述載體由稻殼粉、脫脂奶粉和麩皮組成，所述稻殼粉、脫脂奶粉和麩皮的質(zhì)量比為1 1 1。
6.含有權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillusreuteri)RI021和權利要求 2-5中任一所述制劑的動物飼料。
7.根據(jù)權利要求6所述的動物飼料，其特征在于所述動物飼料中，每克所述動物飼料中含有IO7Cfu以上的權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillus reuteri)RI021。
8.權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillusreuteri)RI021和權利要求2-5 中任一所述制劑的下述至少一種用途1)制備調(diào)節(jié)動物腸內(nèi)微生態(tài)平衡的產(chǎn)品；2)制備增強動物非特異性免疫的產(chǎn)品；3)提高動物飼料轉(zhuǎn)化效率；4)促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收；5)制備降低動物腹瀉發(fā)病率的產(chǎn)品；6)制備提高動物生產(chǎn)性能的產(chǎn)品。
9.權利要求1所述的羅伊氏乳桿菌(LactcAacillusreuteri)RI021或權利要求2-5 中任一所述制劑在制備大腸桿菌抑制劑中的應用。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用，所述大腸桿菌抑制劑中的大腸桿菌為大腸桿菌K88、 大腸桿菌K99或大腸桿菌987P。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株羅伊氏乳桿菌及其應用。該羅伊氏乳桿菌為Lactobacillus reuteri RI021，2011年3月11日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號CGMCC No.4650。本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌及其羅伊氏乳桿菌制劑主要作為動物的飼料添加劑，可用于調(diào)節(jié)動物腸內(nèi)微生態(tài)平衡，從而具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養(yǎng)因子、促進營養(yǎng)物的消化吸收、促進動物生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率。
文檔編號A23K1/16GK102304489SQ20111028572
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權日2011年9月23日
發(fā)明者宋維平, 宋青龍, 王洪彬, 譙仕彥 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 北京龍科方舟生物工程技術中心