專利名稱：提高棉花衣分含量的Gbyucca10基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠提高棉花衣分含量的(ibyuccaio基因及其編碼的多肽。
背景技術：
棉花衣分是除鈴數、鈴重之外的棉花產量的一個重要構成因素。衣分含量是指籽棉纖維的重量與籽棉重量的比值，通常用百分率來表示。衣分含量的高低是評定棉花品種優劣的一條重要標準。大量的研究證明提高棉花纖維的衣分含量能夠顯著提高棉花的產量。通過基因工程方法提高棉花衣分含量，使之更加適應生產的需要是當前棉花纖維遺傳改良的重要方向。但是，有關利用基因工程方法提高棉花衣分含量目前未見報道。棉花纖維的發育歷經纖維起始、纖維伸長、次生壁增厚及脫水成熟四個階段形成成熟纖維。研究證明在纖維發育起始階段，增加胚表皮的IAA(生長素)含量能夠提高單位面積中胚表皮細胞的突起數目，從而提高衣分的含量。研究證明植物通常有2條不同的IAA合成途徑(1)色氨酸經過色氨酸脫氨酶、色氨酸脫羧酶合成吲哚乙酸的代謝通路。 (2)色氨酸經過通過YUCCa、CYP79B2/3、CYP83B2等合成吲哚乙酸的代謝通路。經過研究發現，在棉花的胚表皮中第二條代謝途徑十分重要，對于保持胚表皮細胞中的IAA濃度十分關鍵。近期的研究進一步也表明，胚特異表達細菌IAA合成相關的酶類(IAAM)有助于提高胚表皮細胞的突起數目(Zhang Mi et al. , Nature Biotechnology，2011 :453-459)。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的能夠提高棉花衣分含量的基因，并得到所述基因表達的蛋白產物。本發明首次采用分子克隆方法，從構建的海島棉cDNA庫中分離獲得了新的 (ibyuccalO基因，并且通過轉基因實驗證實了它具有高提高棉花衣分含量的功能，從而達到了發明目的。本發明利用胚特異表達啟動子在棉花中特異表達(GbyuccalO基因提高棉花的胚表皮細胞的突起數目，從而提高棉花的衣分含量。本發明包括以下內容1、提供了一種新的分離出的(ibyuccalO蛋白質多肽，包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽；(b)將 SEQ ID NO :2氨基酸序列經過一個或多個(較佳地1-20個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花衣分含量功能的(GbyuccalO蛋白質活性的由(a)衍生的多肽。2、提供了編碼上述多肽的多核苷酸，選自(a)編碼上述(ibyuccalO蛋白質多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO 1中M2-1183位的序列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-1406位的序列。
3、提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。4、提供了制備上述(ibyuccalO蛋白質多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有活性的多肽。5、提供了上述多核苷酸和(ibyuccalO蛋白質多肽的用途，S卩，在培育提高棉花衣分含量的棉花品種方面的應用。6、提供了一種提高棉花衣分含量的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸，所述的(ibyuccalO選自下組(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花衣分含量的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使(ibyuccalO基因編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入(ibyuccalO基因的DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。在本發明中，術語“(ibyuccalO蛋白質”、“(ibyuccalO多肽”、“IAA合成酶”或“提高棉花衣分含量蛋白”可互換使用，都指具有提高棉花衣分蛋白(ibyuccalO氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的(ibyuccalO蛋白質。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的(ibyuccalO蛋白或多肽”是指(ibyuccalO多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化(^byuccalO蛋白質。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主， 本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括(ibyuccalO蛋白質的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然(ibyuccalO蛋白質相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。 根據本文所述，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發明中，術語“(ibyuccalO多肽”指具有生長素合成酶功能能夠提高棉花衣分含量的SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術語還包括具有與(ibyuccalO蛋白質相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C 末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括(ibyuccalO蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹程度條件下能與(ibyuccalO雜交的DNA、cDNA所編碼的蛋白、以及利用抗(ibyuccalO多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含 (ibyuccalO多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了 (ibyuccalO 多肽的可溶性片段。通常，該片段具有(ibyuccalO多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。發明還提供(ibyuccalO蛋白質或多肽的類似物。這些類似物與天然(ibyuccalO多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到。表 權利要求
1.一種分離的(ibyuccaio蛋白質多肽，包含具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽， 或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.權利要求1所述的多肽，所述保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一個或多個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花衣分含量功能的多肽。
3.權利要求1或2所述的多肽在提高棉花衣分含量方面的功能與應用。
4.一種分離的多核苷酸，包含(a)編碼權利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)與(a)互補的多核苷酸。
5.權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，其序列選自(a)具有SEQID NO :1中242-1183位的序列；或(b)具有SEQ ID NO :1 中 1-1406 的序列。
6.權利要求4或5所述的多核苷酸在提高棉花衣分含量方面的功能與應用。
7.一種載體，其特征在于含有權利要求4或5所述的多核苷酸。
8.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于含有權利要求7所述的載體。
9.權利要求1或2所述多肽的制備方法，包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求8所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有(ibyuccalO蛋白質活性的多肽。
10.一種提高棉花衣分含量的方法，包括(a)提供攜帶權利要求7所述的表達載體的農桿菌；(b)將植物細胞或組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使所攜帶的表達載體中的DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(c)選擇出轉入有(ibyuccalO蛋白質的DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(d)將步驟(c)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發明提供了一種能夠提高棉花衣分含量的Gbyucca10基因及其編碼的Gbyucca10蛋白質多肽，以及經重組技術產生這種Gbyucca10蛋白質的方法。本發明還公開了Gbyucca10基因在提高棉花衣分含量方面的功能與應用。
文檔編號A01H5/00GK102304497SQ20111025353
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日
發明者左開井, 王勁, 陳強, 陳繼軍 申請人:左開井, 王勁