一種甜角快速繁殖方法

專利名稱：一種甜角快速繁殖方法
技術領域：
本發明屬于植物離體組織培養方法技術領域，特別涉及植物甜角的快速繁殖方法。
背景技術：
酸角又名羅望子、羅晃子、酸角(Tamarindus indica Lirm.)、酸豆等(中國植物志，北京 1988. 39)，屬蘇木科(Caesalpiniaceae)酸豆屬(Tamarindus Linn.)的一種常綠大喬木，是單屬種植物。酸角原產于非洲東部和亞洲的熱帶地區，在熱帶地區和南亞熱帶地區分布很廣，我國南方各省如臺灣、海南、福建、廣東、廣西、四川、云南、貴州等地均有分布，尤以海南為多，國內的酸角絕大部分處于零星的野生或半野生狀態，面積估算不到830 公頃，大量老酸角樹遭到砍伐，資源毀壞嚴重。甜角是酸角的一種，果實味道酸甜，香味濃， 營養價值甚高，果肉中總糖含量45. 90% 50.沈％，還原糖含量33. 66% 46. 94%，遠高于含糖量較高的柑桔；粗蛋白和Vc含量接近梨和蘋果等，果實中還含有17種氨基酸，其中7種人體必需氨基酸占氨基酸總量的45. 85% (趙一鶴等，《泰國甜角不同品種果實營養成分分析》植物資源與環境學報，2005，14 (3))，還富含多種礦質元素，其鈣、磷等微量元素的含量明顯高于一般水果，且比例平衡(Ca:P=l:l)。有研究表明甜角果肉具有抑制細菌、降血糖、 抗突變和抗致癌物、保護細胞損傷等作用(趙一鶴等，《世界酸角研究現狀及進展》云南農業大學學報，2005 (1));甜角種子中的羅望子膠含量達58. 5% 65. 0%，為一種類似果膠但性能又優于果膠的良好食品增稠劑和穩定劑，用于改善調味汁的口感及穩定性、增強制品的稠厚感和甜味、使顆粒不易沉降等具有良好的效果，世界上很多發達國家的食品、醫藥、 紡織、乳膠、建筑、木材、粘合劑、炸藥、造紙、油脂及日化等行業都越來越廣泛地應用羅望子膠(王元蘭等，《羅望子膠及其在食品工業中的應用》食品研究與開發，2006 (9));甜角的種皮可以提取抗氧化劑和食品添加色素；種子中蛋白質含量達16. 85% 19. 50%，可用于加工豆蛋白飼料；甜角葉可作飲水漂白劑，也可作蔬菜食用；甜角木材質地堅硬致密，邊材黃白色，心材黑紫帶棕色，被譽為“馬德拉紅木”；甜角樹樹型優美，枝葉常綠，花量大，花期長，4 8月均不斷開花，是一種理想的庭院觀賞喬木，若對幼樹施以園藝盆景技術，是一種上好的盆景制作材料和觀賞樹，栽植在公園、庭院、城市街道、農村道路旁，起到觀賞和遮蔭的作用(趙一鶴等，《泰國甜角引種栽培試驗》浙江林業科技，2005(1))。甜角做為集果用、 葉用、材用和觀賞于一體的多用途的資源植物，已經越來越受到人們的關注。目前甜角的繁殖多采用實生繁殖或嫁接繁殖，實生繁殖方法存在兩方面的問題， 一是酸角種子在自然條件下不能長期貯存，易遭受蟲害，堅硬的外種皮使其發芽率很低且發芽時間長，二是實生繁殖的方法受季節限制的影響，繁殖速度也較慢，像泰國甜角實生育苗需10 12年才能掛果，并且存在結實晚、產量不穩定、果莢品質退化，且樹枝高大、采摘不易等問題，另外，實生苗的后代分離也是一個大問題。甜角的嫁接繁殖技術研究始于20 世紀90年代，專家對甜角的嫁接方法、嫁接時間和苗齡效應等方面有所研究，是目前甜角繁殖的主要途徑，其特點是可以保持母本優良性狀和速生等，嫁接繁殖造林與實生繁殖相比，可提前幾年掛果，但不同地區由于品種、氣候等原因，嫁接技術也存在差異，不同嫁接時期和嫁接方法，嫁接成活率存在較大差異。在華南地區的氣候條件下，以春季切接法較好， 嫁接成活率約為80%，夏秋高溫干旱季節成活率較低；而單芽腹接由于羅望子生物堿含量較高，皮層薄、芽體小，削芽及剝皮均不易，因此，嫁接成活率較低，肖艷、趙一鶴等對泰國甜角的嫁接實驗顯示，效果最好的切接法嫁接繁殖的平均成活率也僅達到75. 0% 76. 4%。利用離體組織培養的方法對甜角進行快速繁殖，可以不受自然條件的影響進行工廠化生產，可以打破季節的限制，快速獲得變異小、遺傳穩定性高的再生植株，世界上有45 萬種植物，其中高等植物約有20余萬種，我國有高等植物3萬余種。目前組培試驗成功的只有幾百種，不同種類，不同品種以及基因型稍微不同，組培各個階段所用的基本培養基、 植物激素的種類以及配比亦不相同，如何使甜角的組織培養既高效又實用是甜角進行組織培養快速繁殖的技術關鍵。

發明內容
本發明的目的在于提供一種甜角離體組織培養及快速繁殖的方法，使甜角實現大規模工廠化生產。本發明采用的技術方案是先將選洗干凈的甜角種子冷藏滅菌處理，然后將種子接種于無菌苗培養基，培養基組分為MS基本培養基+6-BA 0. 8 1. 2mg/L+NAA0. 1 0. 5mg/L,培養無菌苗，無菌苗的子葉切塊兒接種到誘導愈傷-分化培養基，培養基組分為 MS基本培養基+6-BA7 10mg/L+椰汁18 22ml/L，誘導產生愈傷組織并分化出分化芽，得到的分化芽轉入增殖培養基，培養基組分為MS基本培養基+6-BA0. 8 1. 2mg/L+IBA0. 3 0. 8mg/L+活性炭0. 3 0. 5g/L，培養出不定芽，較小的不定芽切成1_2節的小段兒，再次接種于增殖培養基，繼續培養分化不定芽，較大的不定芽接入生根培養基，培養基組分為 1/2MS+ ΝΑΑ0. 3 0. 5mg/L+活性炭0. 3 0. 5g/L，生根培養得到生根苗，生根苗通過煉苗、 移栽形成再生植株。甜角種子的冷藏處理為在3 6°C冷藏室內冷藏15天。甜角種子滅菌方法為將選洗、冷藏后的種子用自來水沖洗3 4h，用75%體積分數的酒精溶液浸泡2 3min，取出后用無菌水沖洗3 5次，再用0. 1%質量分數的升汞溶液浸泡10 15min，取出后用無菌水沖洗5次。無菌苗培養、分化芽培養、不定芽培養和生根培養的培養條件相同培養溫度 23 26°C，光照時間11 13h/d，光照強度2500Lux。煉苗時保持濕度80 90%、溫度22 士 2°C。無菌苗培養時間為20-23d，分化芽培養時間為20-25d，不定芽培養時間為 35-45d，生根培養時間為^-32d，煉苗時間2-3d。本發明技術方案通過以下步驟實現
步驟一，種子處理將選出的甜角種子除去果肉，用水沖洗干凈，放置在3 6°C冷藏室內冷藏15天后取出。步驟二，種子滅菌將選洗、冷藏后的種子用自來水沖洗3 4h，用75%體積分數的酒精溶液浸泡2 3min，取出后用無菌水沖洗3 5次，再用0. 1%質量分數的升汞溶液浸泡10 15min，取出后用無菌水沖洗5次。
步驟三，無菌苗培養將滅菌后的種子接種于無菌苗培養基，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BA 0. 8 1. 2mg/L+NAA0. 1 0. 5mg/L,培養條件為溫度23 ，光照時間11 13h/d，光照強度2500LUX，培養出無菌苗，培養時間20 23d。步驟四，分化芽培養無菌苗生長3-5天后，取子葉切成0. 3 0. 5cm的小塊，接種在誘導愈傷-分化培養基上，培養基組分為MS基本培養基+6-BA 7 10mg/L+椰汁18 22ml/L，培養條件同步驟三，誘導產生愈傷組織并分化出分化芽，培養時間20-25d，每塊愈傷可得到2-4個分化芽。步驟五，不定芽培養將分化芽轉入增殖培養基，培養基組分為MS基本培養基 +6-BA0. 8 1. 2mg/L+IBA0. 3 0. 8mg/L+活性炭0. 3 0. 5g/L，進行不定芽培養，培養條件同步驟三，培養時間35-45d，選出較大的不定芽直接用于生根培養，較小的不定芽切成1-2 節的小段兒，再次接種于增殖培養基，繼續培養不定芽，可反復得到大量的不定芽。步驟六，生根培養將選出較大的不定芽轉入生根培養基，培養基組分為1/2MS+ NAA0. 3 0. 5mg/L+活性炭0. 3 0. 5g/L，進行生根培養，培養條件同步驟三，培養時間 ^-32d，得到生根苗。步驟七，煉苗、移栽將生根苗瓶口打開，使其與空氣接觸，保持濕度80 90%、溫度22士2°C，煉苗時間2-3d，然后用流水洗去生根苗基部的培養基，用0. 1%質量分數的高錳酸鉀溶液浸泡1 anin后取出，移栽到消毒的栽培基質中培養，栽培基質為泥炭土 蛭石 =2:1，得到再生植株，再生植株成活率達90%以上，從不定芽到再生植株65-80d。使用本發明的組織培養方法對甜角進行快速繁殖，打破了季節的限制，不受自然條件的影響，實現甜角的工廠化生產，技術方案中從種子處理到分化芽培養階段屬于基礎階段；誘導愈傷組織的產生和分化芽的分化一步完成，與常規的誘導愈傷組織和分化芽的分化需要兩次培養的方法相比，減少了一個步驟，明顯縮短了時間；分化芽轉入增殖培養基后，較大的不定芽直接轉入生根培養，較小的不定芽切成1-2節的小段兒，再次接種于增殖培養基，繼續培養不定芽，可反復得到大量的不定芽，從不定芽到再生植株僅需2個半月左右，實現了大量、快速獲得再生植株的目的；再生植株成活率達90%以上，而且具有再生植株變異小和遺傳穩定性高的優點；本發明技術產生的愈傷組織還可作為甜角轉基因的受體，應用本發明中分化芽、不定芽、生根苗和再生植株的培養技術獲得甜角轉基因植株。


圖1為無菌苗圖片； 圖2為分化芽圖片；
圖3為不定芽圖片； 圖4為生根苗圖片。具體實施方法
以下實施例對本發明作進一步說明。實施例1
步驟一，種子處理將選出的甜角種子除去果肉，用水沖洗干凈，放置在3 6°C冷藏室內冷藏15天后取出。
步驟二，種子滅菌將選洗、冷藏后的種子用自來水沖洗3h，用75%體積分數的酒精溶液浸泡2min，取出后用無菌水沖洗3次，再用0. 1%質量分數的升汞溶液浸泡 lOmin，取出后用無菌水沖洗5次。步驟三，無菌苗培養將滅菌后的種子接種于無菌苗培養基，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BAO. 8mg/L + NAAO. 1 mg/L，培養條件為溫度23士 1°C，光照時間13h/d，光照強度2500LUX，培養出無菌苗，培養時間22d，圖1為無菌苗圖片。步驟四，分化芽培養無菌苗生長5天后，取子葉切成0. 3cm的小塊，接種在誘導愈傷-分化培養基上，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BA7mg/L +椰汁18ml/L，培養條件同步驟三，誘導產生愈傷組織并分化出分化芽，培養時間22d，每塊愈傷得到2個分化芽，圖2 為分化芽圖片。步驟五，不定芽培養將分化芽轉入增殖培養基，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BAO. 8mg/L + IBAO. 3mg/L +活性炭0. 3g/L，進行不定芽培養，培養條件同步驟三，培養時間45d，圖3為不定芽圖片。步驟六，生根培養將不定芽轉入生根培養基，培養基組分為1/2MS + NAAO. 3mg/ L +活性炭0. 5g/L，進行生根培養，培養條件同步驟三，培養時間31d，得到生根苗，圖4為生根苗圖片。步驟七，煉苗、移栽將生根苗在溫室內把瓶口打開，使其與空氣接觸，保持濕度 80 85%、溫度22士2°C，煉苗時間3d，然后用流水洗去生根苗基部的培養基，用0. 1%質量分數的高錳酸鉀浸泡Imin后取出，移栽到消毒的栽培基質中培養，栽培基質為泥炭土 蛭石=2:1，得到再生植株，再生植株成活率90%，從不定芽到再生植株用時79天。實施例2
步驟一，種子處理將選出的甜角種子除去果肉，用水沖洗干凈，放置在3 6°C冷藏室內冷藏15天后取出。步驟二，種子滅菌將選洗、冷藏后的種子用自來水沖洗4h，用75%體積分數的酒精溶液浸泡3min，取出后用無菌水沖洗5次，再用0. 1%質量分數的升汞溶液浸泡15min，取出后用無菌水沖洗5次。步驟三，無菌苗培養將滅菌后的種子接種于無菌苗培養基，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BA1. 2mg/L + NAAO. 5 mg/L，培養條件為溫度25士 1°C，光照時間llh/d，光照強度2500LUX，培養出無菌苗，培養時間23d。步驟四，分化芽培養無菌苗生長4天后，取子葉切成0. 5cm的小塊，接種在誘導愈傷-分化培養基上，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BA10 mg/L +椰汁22ml/L，培養條件同步驟三，誘導產生愈傷組織并分化出分化芽，培養時間25d，每塊愈傷得到3個分化芽。步驟五，不定芽培養將分化芽轉入增殖培養基，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BA1. 2mg/L + IBAO. 8mg/L +活性炭0. 5g/L，進行不定芽培養，培養條件同步驟三，培養時間40d，選出較大的不定芽用于生根培養，較小的不定芽切成1-2節的小段兒，再次接種于增殖培養基，繼續培養不定芽。步驟六，生根培養將選出較大的不定芽轉入生根培養基，培養基組分為1/2MS + NAAO. 5mg/L +活性炭0. 3g/L，進行生根培養，培養條件同步驟三，培養時間為32d，得到生根苗。步驟七，煉苗、移栽將生根苗在溫室內把瓶口打開，使其與空氣接觸，保持濕度85 90%、溫度22士2°C，煉苗時間2d，然后用流水洗去生根苗基部的培養基，用0. 1%質量分數的高錳酸鉀浸泡anin后取出，移栽到消毒的栽培基質中培養，栽培基質為泥炭土 蛭石=2:1，得到再生植株，再生植株成活率92%，從不定芽到再生植株用時74天。實施例3
步驟一，種子處理將選出的甜角種子除去果肉，用水沖洗干凈，放置在3 6°C冷藏室內冷藏15天后取出。步驟二，種子滅菌將選洗、冷藏后的種子用自來水沖洗4h，用75%的體積分數酒精溶液浸泡3min，取出后用無菌水沖洗5次，再用0. 1%質量分數的升汞溶液浸泡12min，取出后用無菌水沖洗5次。步驟三，無菌苗培養將滅菌后的種子接種于無菌苗培養基，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BA1. Omg/L + NAAO. 4mg/L,培養條件為溫度對士 1°C，光照時間12h/d，光照強度2500LUX，培養出無菌苗，培養時間20d。步驟四，分化芽培養無菌苗生長3天后，取子葉切成0. 4cm的小塊，接種在誘導愈傷-分化培養基上，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BA9 mg/L +椰汁20ml/L，培養條件同步驟三，誘導產生愈傷組織并分化出分化芽，時間20d，每塊愈傷得到4個分化芽。步驟五，不定芽培養將分化芽轉入增殖培養基，培養基組分為MS基本培養基+ 6-BA1. Omg/L + IBAO. 5mg/L +活性炭0. 5g/L，進行不定芽培養，培養條件同步驟三，培養時間35d，選出較大的不定芽用于生根培養，較小的不定芽切成1-2節的小段兒，再次接種于增殖培養基，繼續培養不定芽。步驟六，生根培養將選出較大的不定芽轉入生根培養基，培養基組分為1/2MS + NAAO. 4mg/L +活性炭0. 5g/L，進行生根培養，培養條件同步驟三，培養時間觀山得到生根
田ο步驟七，煉苗、移栽將生根苗在溫室內把瓶口打開，使其與空氣接觸，保持濕度 83 88%、溫度22士2°C，煉苗時間2d，然后用流水洗去生根苗基部的培養基，用0. 1%體積濃度的高錳酸鉀浸泡anin后取出，移栽到消毒的栽培基質中培養，栽培基質為泥炭土 蛭石=2:1，得到再生植株，再生植株成活率93%，從不定芽到再生植株用時65天。
權利要求
1.一種甜角快速繁殖方法，其特征在于一種甜角快速繁殖方法，其特征在于先將選洗干凈的甜角種子冷藏滅菌處理，然后將種子接種于無菌苗培養基，培養基組分為MS基本培養基+6-BA 0. 8 1. 2mg/L+NAA0. 1 0. 5mg/L，培養無菌苗，無菌苗的子葉切塊兒接種到誘導愈傷-分化培養基，培養基組分為MS基本培養基+6-BA7 10mg/L+椰汁18 22ml/ L，誘導產生愈傷組織并分化出分化芽，得到的分化芽轉入增殖培養基，培養基組分為MS基本培養基+6-BA0. 8 1. 2mg/L+IBA0. 3 0. 8mg/L+活性炭0. 3 0. 5g/L,培養出不定芽， 較小的不定芽切成1-2節的小段兒，再次接種于增殖培養基，繼續培養分化不定芽，較大的不定芽接入生根培養基，培養基組分為1/2MS+ ΝΑΑ0. 3 0. 5mg/L+活性炭0. 3 0. 5g/L， 生根培養得到生根苗，生根苗通過煉苗、移栽形成再生植株。
2.如權利要求1所述的一種甜角快速繁殖方法，其特征在于所述甜角種子的冷藏處理為在3 6°C冷藏室內冷藏15天。
3.如權利要求1所述的一種甜角快速繁殖方法，其特征在于所述甜角種子滅菌方法為將選洗、冷藏后的種子用自來水沖洗3 4h，用75%體積分數的酒精溶液浸泡2 3min， 取出后用無菌水沖洗3 5次，再用0. 1%質量分數的升汞溶液浸泡10 15min，取出后用無菌水沖洗5次。
4.如權利要求1所述的一種甜角快速繁殖方法，其特征在于所述無菌苗培養、分化芽培養、不定芽培養和生根培養的培養條件相同培養溫度23 ^TC,光照時間11 13h/d， 光照強度2500LUX。
5.如權利要求1所述的一種甜角快速繁殖方法，其特征在于無菌苗培養時間為 20-23d，分化芽培養時間為20-25d，不定芽培養時間為35_45d，生根培養時間為^-32d，煉苗時間2-3d。
6.如權利要求1所述的一種甜角快速繁殖方法，其特征在于所述煉苗、移栽的方法為一將生根苗瓶口打開，使其與空氣接觸，保持濕度80 90%、溫度22士2°C，煉苗時間 2-3d，然后用流水洗去生根苗基部的培養基，用0. 1%質量分數的高錳酸鉀溶液浸泡1 aiiin后取出，移栽到消毒的栽培基質中培養，得到再生植株。
7.如權利要求6所述的一種甜角快速繁殖方法，其特征在于所述栽培基質為泥炭土 蛭石=2:1。
全文摘要
一種甜角快速繁殖方法。將選洗干凈的甜角種子冷藏滅菌處理后接種于無菌苗培養基誘導產生無菌苗，無菌苗的子葉接入愈傷誘導分化培養基培養，得到分化芽再轉入增殖培養基，增殖培養形成不定芽后接入生根培養基進行生根培養，得到生根苗經過煉苗得到甜角再生植株，本發明可高效誘導不定芽，具有再生植株變異小和遺傳穩定性高的優點，再生植株成活率達90%以上，達到快速繁殖的目的。
文檔編號A01H4/00GK102405834SQ20111024150
公開日2012年4月11日 申請日期2011年8月22日 優先權日2011年8月22日
發明者張先云, 李長看, 胡述龍 申請人:鄭州師范學院