專利名稱：一種低成本流水化生產組培苗的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產組培苗的方法，特別涉及一種低成本規模化生產組培苗的方法。
背景技術：
植物組織培養即植物無菌培養技術，是根據植物細胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實等)組織(如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等)或細胞(如大孢子、小孢子、體細胞等)以及原生質體，在無菌和適宜的人工培養基及光照、溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。但是，傳統生產組培苗所使用的玻璃培養容器透光透氣性差、成本高、重量大、有效重量小、搬運困難，易損壞。生產成本較高，生產效率較低，可以有更進一步低成本規模化生產組培苗技術的改進。
發明內容
本發明的目的在于提供一種易于推廣的低成本組織培養容器，建立一種簡便、低成本、流水化的組織培養方法。為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下 本發明包括以下步驟
(一)培養基的配制
(1)稱取以下重量分數的藥品分別置于燒杯中 KH2PO4 3. 75 NH4NO3 36.43 KNO3 41.94 CaCl2 · 2H20 9. 71 MgSO4 · 7H20 8. 17
在各燒杯中分別加入藥品總重量33-34倍重的純凈水溶解后，按照所列各藥品先后順序將溶液緩慢混合入更大的燒杯中，同時不斷攪拌，待用；
(2)稱取以下重量分數的藥品，藥品總質量為(1)中藥品總質量的1/22
MnSO4 · 4H2010. 8ZnSO4 · 7H204.17H3BO33. 00KI0.40Na2MoO4 · 2H200. 12CoCl2 · 6H200.012CuSO4 · 5H200. 012FeSO4 · 7H2013 47Na2-EDTA18. 07煙酸0.24維生素B60. 24維生素Bl0.05甘氨酸0. 97其余為肌醇
將以上藥品置于燒杯中，加藥品總重量1000倍重的純凈水溶解，緩慢倒入(1)中配制好的溶液中，攪拌混勻后，待用；
(3)配制濃度為0.2mg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)溶液；
(4)稱取(2)中藥品總重量30倍的瓊脂、150倍的蔗糖倒入(1)步驟中的溶液中攪拌， 加熱沸騰后，根據不同植物的試管苗加入不同體積的(3)配制的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)溶液，最后按(1)中藥品總重量計，每4. 53g定容到IOOOmL,再逐滴滴入氫氧化鉀溶液(1N)調節培養基的PH值到5. 8 ；
(二)分裝與滅菌
將配制好的培養基趁熱分裝入聚丙烯薄膜袋中，用小夾子固定在一個用鐵絲做成的簡易框架上使其直立，然后放入高壓滅菌鍋消毒，滅菌時間在121°C保持18 20min即可； (三)無菌操作
(1)無菌操作實驗器具和材料的準備包括超凈工作臺的無菌處理，消毒雙手及切割刀和鑷子等操作工具；
(2)滅菌結束后，將簡易架子放在超凈工作臺上，整理薄膜袋使其能夠直立，用塑料袋封口機封住袋口，薄膜袋靜置至培養基凝固，待用；
(3)流水作業進行外植體的分離與接種裝有試管苗的培養袋、操作器具、培養皿及塑料袋封口機等用新潔爾滅或75%酒精擦拭消毒后放入超凈工作臺內；1號組培技術工人在超凈工作臺內將試管苗從培養袋中取出，置無菌濾紙上，用切割刀按照不同試管苗的繁殖要求對待繁殖的試管苗進行切割；同時2號技術工人剪開已灌裝培養基且培養基已凝固的薄膜袋封口處，用消毒過并冷卻的鑷子將1號組培技術工人切割的繁殖的試管苗夾入薄膜袋內；3號組培技術工人將2號組培技術工人放入的塊莖或莖段微插入培養基中，若是葉柄水平放置；4號組培技術工人將3號組培技術工人做好的薄膜袋，用塑料袋封口機將其薄膜袋封口并編號，放置于培養室中的培養架上；
(四)按(三)所述步驟進行無菌操作，將薄膜袋封裝的試管苗放置于培養室中的培養架上進行組織培養，組織培養的照明光源采用節能燈，優選為11瓦的節能燈。與現有技術相比，本發明的有益效果是
1、采用聚丙烯薄膜袋作為培養容器，其具較玻璃好的透光透氣性，培養物較傳統玻璃容器的青綠、健壯。聚丙烯薄膜傳熱良好，有利于培養物提早煉苗，使之更適應自然溫度，移栽成活率高。2、傳統玻璃容器重量大而有效重量小，一般空瓶重約240克左右，而苗及培養基只有陽克左右，有效重量是空瓶重量的23%左右，玻璃瓶的搬運成了一項比較繁重的體力勞動，若要將組培苗運入溫室移栽，運輸成本增加，且玻璃瓶所占體積較大，放入培養室培養，增加了存放費用。而聚丙烯薄膜袋重量輕，不僅降低了運輸成本，而且減輕了工人的勞動強度，移栽時也方便。3、傳統玻璃容器成本高，一個350ml的玻璃容器需0. 8 1. 0元左右，而且容易破損，需要不斷進行補充，而薄膜袋成本低，僅約0. 035元/個。除此之外，使用傳統玻璃容器清洗與消毒費用高，而聚丙烯薄膜袋作為容器免去了清洗費用且消毒費也降低了。4、薄膜袋透光性好，再加上改進光源，使用節能燈，在培養室中若放置在 1. OmX 2. Om培養架上，僅需共44瓦的節能燈，培養物即可正常生長。5、本發明建立的組培技術簡便且易于掌握。流水化的接種步驟，提高了工作效率，采用此種方法不僅降低了組培苗的生產成本，而且提高了組培苗的生產效率，與傳統方法相比起到了事半功倍的效果。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明的上述發明內容作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發明上述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發明的范圍內。實施例1
本實施例為培養基的配制 (1)稱取 KH2PO4 170mg，NH4NO3 1650mg，KNO3 1900mg，CaCl2 ·2Η20 440mg，MgSO4 · 7Η20 370mg，分別置于200mL的燒杯中，加純凈水150 mL溶解后，按照所列各藥品先后順序將溶液緩慢混合入2000mL的燒杯中，同時不斷攪拌，待用。(2)稱取 MnSO4 ·4Η20 22. 3 mg, ZnSO4 · 7H20 8.6 mg, H3BO3 6. 2 mg , KI 0. 83 mg, Na2MoO4 ·2Η20 0. 25 mg，CoCl2 ·6Η20 0.025 mg，CuSO4 ·5Η20 0.025 mg，FeSO4 · 7H20 27. 8 mg, Na—EDTA 37.3 mg，煙酸 0.5 mg，維生素 B6 0. 5mg，維生素 Bl 0. lmg,甘氨酸 2.0 mg, 肌醇100 mg于500mL的燒杯中，加純凈水200 mL溶解后，緩慢倒入1中的2000mL的燒杯
中，攪拌混勻后，待用。(3)配制濃度為0. 2mg/ml的6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)溶液；
(4)準確稱取瓊脂6g、蔗糖30g倒入1步驟中的2000mL的燒杯中攪拌，加熱沸騰后，根據不同植物的試管苗加入不同體積的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)溶液，最后加純凈水至燒杯刻度IOOOmL處，再逐滴滴入氫氧化鉀溶液調節培養基的PH值到5. 8。實施例2
本實施例為分裝與滅菌
將配制好的培養基趁熱分裝入聚丙烯薄膜袋中。用小夾子固定在一個用鐵絲做成的簡易框架上使其直立，然后放入高壓滅菌鍋消毒，滅菌121°C保持20min。實施例3 本實施例為無菌操作
(1)無菌操作實驗器具和材料的準備用新潔爾滅或75%酒精擦拭超凈工作臺，開超凈工作臺和室內紫外燈，殺菌20 30min。工作臺面上的用品不能放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果；用新潔爾滅或75%酒精擦臺面并消毒雙手及試驗用具，打開接種消毒器，溫度達290°C 300°C時把操作工具(切割刀和鑷子)放入消毒約2分鐘，取出，放在工具架上冷卻。(2)滅菌結束后，立即將簡易架子放在超凈工作臺上，整理薄膜袋使其能夠直立， 用塑料袋封口機封住袋口，薄膜袋靜置至培養基凝固，待用。(3)流水作業進行外植體的分離與接種裝有試管苗的培養袋、操作器具、培養皿及塑料袋封口機等用新潔爾滅或75%酒精擦拭消毒后放入超凈工作臺內。1號組培技術工人在超凈工作臺內將試管苗從培養袋中取出，置無菌濾紙上，用切割刀按照不同試管苗的繁殖要求對待繁殖的試管苗進行切割若是莖段切為1cm，若是塊莖縱切為Icm3，若是葉柄切段1 1. 2cm，若是葉片切成IcmX Icm的方塊；同時2號技術工人剪開已灌裝培養基且培養基已凝固的薄膜袋封口處，用消毒過并冷卻的鑷子將1號組培技術工人切割的繁殖的試管苗夾入薄膜袋內；3號組培技術工人將2號組培技術工人放入的塊莖或莖段微插入培養基中，若是葉柄水平放置；4號組培技術工人將3號組培技術工人做好的薄膜袋(袋內有繁殖的試管苗)，用塑料袋封口機將其薄膜袋封口，寫上培養的試管苗編號，放置于置培養室中的培養架上。實施例4 本實施例為組織培養
按照實施例3介紹的無菌操作方法進行組織培養，將薄膜袋封裝的試管苗放置于培養室中的培養架上進行組織培養，對照明光源進行改進照明光源采用11瓦的節能燈替代原40瓦的日光燈管。實施例5
本實施例是對實施例1-4所述的技術的經濟效果評價
(1)配制1萬瓶(傳統玻璃容器250ml)培養基需500升，以培養基成分成本3元/升計算，需1500元。配制1萬袋(聚丙烯薄膜袋)培養基需400L，以培養基成分成本3元/升計算，需 1200 元。(2)配制1萬瓶(傳統玻璃容器350ml)培養基，以50ml/瓶計算，需500升，一個工人一天可以配制15升，人工費40元/天，總共需1340元。配制1萬袋(聚丙烯薄膜袋)培養基，以40ml/袋計算，需400升，一個工人一天可以配制15升，人工費40元/天，總共需1070元。(3)120L立式壓力蒸汽滅菌鍋一次可消毒150個玻璃瓶，而袋子可消毒200袋。同樣一次滅菌需12度電，一度電一元錢，共計12元。一個工人一天可以消毒15升的培養基， 人工費40元/天。消毒1萬玻璃瓶，人工費1340元，電費消耗800元，共計2140元；消毒 1萬薄膜袋，人工費1070元，電費消耗600元，共計1670元。(4)玻璃瓶封口膜0. 10元/個，1萬瓶培養基需1000元。聚丙烯薄膜袋0. 035元 /個，1萬個薄膜袋350元。(5)接種每袋(瓶)接種18苗，一個工人工資40元/天，使用玻璃瓶，一人一天接種120瓶，使用薄膜袋，可接種200袋，接種1萬瓶試管苗需人工費3334元。接1萬袋試管苗需人工費2000元。(6)若使用玻璃瓶，則需清洗瓶子。一個工人一天洗300個玻璃瓶，工資40元/ 天，1萬瓶需1340元。(7)光照培養電費核算1. OmX 2. Om培養架可放325袋培養基，由于薄膜袋透光性好，使用4個功率不同的節能燈共計44瓦，組培苗即可正常培養，照此計算，1萬袋組培苗光照培養30天，一天照明時間10小時，耗電410度，電費410元(1度電按1元計算)；同樣， l.OmX 2. Om培養架放置160瓶培養基，需三支40瓦日光燈管，耗電2268度，電費沈68元。(8)總成本采用薄膜袋做培養容器，生產18萬試管苗的成本是6700元，平均每苗成本0. 0372元，采用玻璃瓶做培養容器，生產18萬試管苗的成本是13322元，平均每苗成本0. 0744元。采用薄膜袋做培養容器，節約生產成本6622元，試管苗每苗成本是玻璃瓶做培養容器的二分之一。(9)運輸費載重1. OL的貨車，平均2元/公里，一車可裝20000袋，而若采用玻璃瓶，一車僅裝7200瓶。按使用1. OL貨車運輸一公里計算，5萬袋試管苗運輸費5元錢，而5 萬瓶試管苗則需14元，節約9元，采用薄膜袋做培養容器的運輸成本是采用玻璃瓶做培養容器運輸成本的35. 7%。綜上所述，本發明中所使用的聚丙烯薄膜袋培養容器透光透氣性好、成本低、重量輕、有效重量大、搬運更簡單。通過本發明的技術，使得組培苗生產的成本降低，生產效率顯者提尚。
權利要求
1. 一種低成本流水化生產組培苗的方法，包括以下步驟 (一)培養基的配制(1)稱取以下重量分數的藥品分別置于燒杯中 KH2PO4 3. 75 NH4NO3 36.43 KNO3 41.94 CaCl2 · 2H20 9. 71 MgSO4 · 7H20 8. 17在各燒杯中分別加入藥品總重量33-34倍重的純凈水溶解后，按照所列各藥品先后順序將溶液緩慢混合入更大的燒杯中，同時不斷攪拌，待用；(2)稱取以下重量分數的藥品，藥品總質量為(1)中藥品總質量的1/22 MnSO4 · 4H2010. 8ZnSO4 · 7H204.17H3BO33. 00KI0.40Na2MoO4 · 2H200. 12CoCl2 · 6H200.012CuSO4 · 5H200. 012FeSO4 · 7H2013 47Na2-EDTA18. 07煙酸0.24維生素B60. 24維生素Bl0.05甘氨酸0. 97其余為肌醇將以上藥品置于燒杯中，加藥品總重量1000倍重的純凈水溶解，緩慢倒入(1)中配制好的溶液中，攪拌混勻后，待用；(3)配制濃度為0.2mg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)溶液；(4)稱取(2)中藥品總重量30倍的瓊脂、150倍的蔗糖倒入(1)步驟中的溶液中攪拌， 加熱沸騰后，根據不同植物的試管苗加入不同體積的(3)配制的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)溶液，最后按(1)中藥品總重量計，每4. 53g定容到IOOOmL,再逐滴滴入氫氧化鉀溶液(1N)調節培養基的PH值到5. 8 ；(二)分裝與滅菌將配制好的培養基趁熱分裝入聚丙烯薄膜袋中，用小夾子固定在一個用鐵絲做成的簡易框架上使其直立，然后放入高壓滅菌鍋消毒，滅菌時間在121°C保持18 20min即可； (三)無菌操作(1)無菌操作實驗器具和材料的準備包括超凈工作臺的無菌處理，消毒雙手及切割刀和鑷子等操作工具；(2)滅菌結束后，將簡易架子放在超凈工作臺上，整理薄膜袋使其能夠直立，用塑料袋封口機封住袋口，薄膜袋靜置至培養基凝固，待用；(3)流水作業進行外植體的分離與接種裝有試管苗的培養袋、操作器具、培養皿及塑料袋封口機等用新潔爾滅或75%酒精擦拭消毒后放入超凈工作臺內；1號組培技術工人在超凈工作臺內將試管苗從培養袋中取出，置無菌濾紙上，用切割刀按照不同試管苗的繁殖要求對待繁殖的試管苗進行切割；同時2號技術工人剪開已灌裝培養基且培養基已凝固的薄膜袋封口處，用消毒過并冷卻的鑷子將1號組培技術工人切割的繁殖的試管苗夾入薄膜袋內；3號組培技術工人將2號組培技術工人放入的塊莖或莖段微插入培養基中，若是葉柄水平放置；4號組培技術工人將3號組培技術工人做好的薄膜袋，用塑料袋封口機將其薄膜袋封口并編號，放置于培養室中的培養架上；(四)按(三)所述步驟進行無菌操作，將薄膜袋封裝的試管苗放置于培養室中的培養架上進行組織培養，組織培養的照明光源采用節能燈。
2.根據權利要求1所述的一種低成本流水化生產組培苗的方法，其特征在于組織培養的照明光源采用11瓦的節能燈。
全文摘要
本發明公開了一種低成本流水化生產組培苗的方法包括培養基的配制、培養基的分裝與滅菌、無菌操作進行外植體的分離與接種、組織培養等步驟，采用了聚丙烯薄膜袋代替傳統玻璃容器，并改善了組織培養的照明光源。本發明中所使用的聚丙烯薄膜袋培養容器透光透氣性好、成本低、重量輕、有效重量大、搬運更簡單。通過本發明的改進，使得組培苗生產的成本降低，生產效率顯著提高。
文檔編號A01H4/00GK102349445SQ20111022938
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月11日 優先權日2011年8月11日
發明者何俊蓉, 劉菲, 卓碧萍, 文利, 李世元, 楊桂蓉, 王躍華, 蔣彧 申請人:四川省農業科學院園藝研究所