專利名稱：一種篩選能夠提高農作物抗真菌病害能力內生真菌的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種篩選能夠提高農作物抗真菌病害能力內生真菌的方法。
背景技術：
農作物指農業上栽培的各種植物。包括糧食作物、經濟作物(油料作物、蔬菜作物)、工業原料作物、飼料作物，藥用作物等，因而與人類的衣食住行息息相關。但是，由于農作物是單一品種的大規模種植，因而很容易感染各種植物病害，其中主要是真菌病害(陳宏波，王偉，2009)，如灰霉病，白粉病，霜霉病，枝枯病，黑斑病和銹病等。真菌病害危害性十分巨大，其中，有的真菌病害發病率很高，范圍很廣，危害也很大，嚴重時會對農作物造成毀滅性打擊，嚴重影響其產量甚至是大面積死亡。又因其多數可以靠風雨傳播且其菌絲體或孢子可以在病枝、病葉、病落葉甚至是土壤中過冬(譚鵬等，2006)，因此傳染性、潛伏性強，殺滅難度大。由于目前對農作物真菌病害尚無非常行之有效的殺滅方法，所以主要以預防為主，一旦發病也主要采取及時剪除病枝病葉、甚至是病株，集中銷毀，冬春季徹底清除枯枝落葉這類消極方法。化學防治也只能作為輔助手段，且在連續使用化學藥劑的情況下，病菌逐漸產生了抗藥性，預防效果逐年下降。科學家們也嘗試了許多非農藥的防治方法，如用大蒜、辣椒和生姜防治黑斑病，幾丁聚糖控制霜霉病(孫彤，2002)，小蘇打和高錳酸鉀防治白粉病等方法，但效果都一般且防治效果不穩定，更重要的是其成本太高，不宜于大規模的推廣應用。內生真菌是指在其生活史中某一段時期內，生活于植物組織內部，而對宿主沒有引起明顯傷害的一類真菌(Petrini，1991)。自1898年Vogl從黑麥草(Zo/i腫temuIenturn L.)種子內分離出第一株內生真菌至今，關于內生真菌的研究已有一百多年的歷史 (Wilson，1996)，但是只有近二十多年來，內生真菌的研究才被廣泛地開展起來，主要的研究工作大都集中在具有重要經濟價值的植物上(Bacon and White，2000)。內生真菌廣泛存在于不同地域、不同種類的植物組織內，從目前的研究報道結果看，所有被研究過的植物都有內生真菌的存在(Redlin and Carris, 1996 ；Bacon and White, 2000)o內生真菌長期生活在植物體內的特殊環境中，并與宿主協同進化，在演化過程中二者形成了互惠共生關系， 一方面內生真菌可從宿主中吸收營養供自己生長需要，另一方面內生真菌在宿主的生長發育和系統演化過程中起重要的作用(郭良棟，2001)。例如，增強植物對氮元素的吸收，促進植物生長，增強植物對不利環境的耐受能力和抗病蟲害能力等(Mei and Flirm，2010)。因為內生真菌在植物生長發育過程中的重要角色和相對于化學藥劑其對環境的友好性，正越來越多地用于解決農作物生產中的各種問題。
發明內容
本發明的目的在于，提供一種篩選能夠提高農作物抗真菌病害能力內生真菌的方法，該方法通過病原真菌感染接種特定內生真菌的農作物脫毒苗并評價該內生真菌對該種真菌病害的防治效果，以達到篩選能夠提高農作物抗真菌病害能力內生真菌。為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案
一種篩選能夠提高農作物抗真菌病害能力內生真菌的方法，其特征在于，按以下步驟進行
1)采集生長健康的植物根、莖或葉，用75%乙醇和3.5%次氯酸鈉進行表面消毒處理， 在解剖鏡下切成組織塊或取其芽源基部分，然后接種在含6-BA和NAA的MS半固體培養基上培養，所述的6-BA的濃度的范圍是1-3 mg/L, NAA的濃度的范圍是0. 1-1 mg/L，等形成叢生芽后，將生長2. 5cm以上的芽切割下來，轉接到含IBA的1/2MS固體培養基上培養，所述IBA的濃度的范圍是0. 2-1 mg/L,當芽的底部形成健壯的根，再將試管苗進行馴化，移栽到溫室培養，得到無任何病害的植物脫毒移栽苗；
2)將采集的植物材料每部分切成直徑約5mm組織塊，表面消毒，然后把消毒的植物組織放到有麥芽汁固體培養基的平皿內培養，在25°C，自然光照條件下，定期觀察，將從植物組織內長出的真菌菌株轉接至斜面保存；
3 )將分離到的各株內生真菌制備成內生真菌孢子懸液，不產生孢子的內生真菌制成菌絲懸液；
4)接種內生真菌孢子或菌絲懸液至脫毒移栽苗，以不接種內生真菌的移栽苗作為對眧.
5 )用病原真菌感染接種了內生真菌的移栽苗和不接種內生真菌的移栽苗，一個月后觀察其防治效果，防治效果大于80%的內生真菌是能夠提高該種農作物抗真菌病害能力的內生真菌。通過查新，尚未見有本發明的方法大規模篩選能夠提高農作物抗真菌病害能力內生真菌的報道。
具體實施例方式申請人:發現用病原真菌感染接種特定內生真菌的農作物脫毒苗能夠有效的檢測該內生真菌是否能夠提高該農作物的抗真菌病害能力。本申請所使用的術語“農作物”是指農業上栽培的各種植物。所述的“內生真菌” 是指其生活史中某一段時期內，生活于植物組織內部，而對宿主沒有引起明顯傷害的一類真菌。所述的“病原真菌”是指寄生于植物并引致病害的真菌。農作物可以是糧食作物、 經濟作物(油料作物、蔬菜作物)、工業原料作物、飼料作物和藥用作物等。例如小麥、蘋果、 油菜、咖啡、金銀花等等。本發明的篩選能夠提高農作物抗真菌病害能力內生真菌的方法，按以下步驟進行
1)采集生長健康的植物根、莖或葉，用75%乙醇(質量濃度)和3. 5%次氯酸鈉(質量濃度)進行表面消毒處理，在解剖鏡下切成組織塊或取其芽源基部分，然后接種在含6-BA和 NAA的MS半固體培養基上培養，所述的6-BA的濃度的范圍是1_3 mg/L，NAA的濃度的范圍是0. 1-lmg/L，等形成叢生芽后，將生長2. 5cm以上的芽切割下來，轉接到含IBA的V2MS 固體培養基上培養，所述IBA的濃度的范圍是0. 2-1 mg/L,當芽的底部形成健壯的根，再將試管苗進行馴化，移栽到溫室培養，得到無任何病害的植物脫毒移栽苗；2)將采集的植物材料每部分切成直徑約5mm組織塊，表面消毒，然后把消毒的植物組織放到有麥芽汁固體培養基的平皿內培養，在25°C，自然光照條件下，定期觀察，將從植物組織內長出的真菌菌株轉接至斜面保存；
3 )將分離到的各株內生真菌制備成內生真菌孢子懸液，不產生孢子的內生真菌制成菌絲懸液；
4)接種內生真菌孢子或菌絲懸液至脫毒移栽苗，以不接種內生真菌的移栽苗作為對
照；
5 )用病原真菌感染接種了內生真菌的移栽苗和不接種內生真菌的移栽苗，一個月后觀察其防治效果，防治效果大于80%的內生真菌是能夠提高該種農作物抗真菌病害能力的內生真菌。在具體實施中，內生真菌孢子懸液的濃度是106/ml。在具體實施中，內生真菌制成菌絲懸液是通過稱取IOg菌絲加入IOml無菌水，勻漿機IOOOOrpm勻質lmin，打碎菌絲片段，制成懸液。在各種具體實施中，接種內生真菌孢子或菌絲懸液至脫毒移栽苗是挑選健康的移栽兩個月的植物脫毒移栽苗，于晚上7點左右，用噴霧器把上述孢子或菌絲懸液均勻噴在植株上，使每個葉片上都有可見的水珠為止，每種內生真菌有15個植株作為重復，每組均有噴灑無菌水的無菌苗作為對照，噴完后立即套上保鮮袋保濕，并進行暗培養。次日早上8 點去除保鮮袋，將植株于溫室內25°C，光照14小時每日，培養一個月。一個月后，采集上述接種內生真菌的移栽苗的根、莖和葉，重新進行表面消毒后再于PDA培養基上培養，如果能夠重新分離接種用的內生真菌，說明該移栽苗被成功接種該種內生真菌。在具體實施中，病原真菌可以是灰霉病，白粉病，霜霉病，枝枯病，黑斑病和銹病等。在具體實施中，防治效果按下列公式計算
防治效果(％)=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數。病情指數按下列公式計算
病情指數(％)=Σ (病情等級代表數值X該等級株數)/ (各級株數總和X最重一級的代表數值)。病情等級是將發病情況分為以下五級 0級無病害；
1級病斑面積占整個葉或根面積10%以下； 2級病斑面積占整個葉或根面積11%_20% ； 3級病斑面積占整個葉或根面積21%-50% ； 4級病斑面積占整個葉或根面積50%以上。在具體實施中，6-ΒΑ濃度范圍是1-3 mg/L。在各種實施方式中，NAA的濃度的范圍是 0. 1-1 mg/LO在具體實施中，IBA濃度范圍是0. 2-1 mg/L。以下是發明人給出的實施例，需要說明的是，這些實施例是較優的實例，主要用于對本發明進一步理解，本發明不限于這些實施例。實施例1 采集健康月季帶葉的莖，在實驗室用75%乙醇(質量濃度)和3. 5%次氯酸鈉(質量濃度) 進行表面消毒處理，取枝條頂芽，在解剖鏡下切取約2mm的芽源基部分，然后接種在含:3mg/ L 6-BA和0. 1 mg/L NAA的MS半固體培養基上培養，等形成叢生芽后，將生長2. 5cm以上的芽切割下來，轉接到含有0.5mg/L的IBA的1/2MS固體培養基上培養，當芽的底部形成健壯的根，再將試管苗進行馴化，移栽到溫室培養。同時，將采集的月季帶葉的莖切成直徑約5mm組織塊，用75%乙醇和3. 5%次氯酸鈉進行植物組織表面消毒，然后把消毒的植物組織塊放到有麥芽汁固體培養基的平皿內培養(25°C，自然光照)，定期觀察，從植物組織內長出的真菌菌株分離到斜面中保存。將分離到的內生真菌用PDA培養基培養兩周后，用無菌水沖洗培養基表面的內生真菌培養物獲得孢子，將沖洗液用8層紗布過濾后，SOOOrpm離心lOmin，用0. 5 ml無菌水重新懸浮孢子，用血球計數板計數孢子濃度，將孢子懸液的濃度調整為106/ml。不產孢的菌株稱取IOg菌絲加入IOml無菌水，勻漿機IOOOOrpm勻質lmin，打碎菌絲片段，制成菌絲懸液。挑選健康的移栽兩個月的月季脫毒移栽苗，于晚上7點左右，用噴霧器把上述孢子或菌絲懸液均勻噴灑在植株上，使每個葉片上都有可見的水珠為止，每種內生真菌有15 個植株作為重復，每組均有噴灑無菌水的無菌苗作為對照，噴完后立即套上保鮮袋保濕，并進行暗培養。次日早上8點去除保鮮袋，250C，光照14小時每日，培養一個月。一個月后，采集上述接種內生真菌的移栽苗的根、莖和葉，重新進行表面消毒后再于PDA培養基上培養， 如果能夠重新分離接種用的內生真菌，說明該移栽苗被成功接種內生真菌。用106/ml的月季白粉病病原真菌薔薇單囊殼菌(^MaeroiAeca rosae)的孢子感染接種各種月季內生真菌的移栽苗。方法是用噴霧器把上述病原孢子懸液均勻噴在植株上，使每個葉片上都有可見的水珠為止，選取每種接種內生真菌的10個植株作為重復，每組均有噴灑無菌水的接種內生真菌的移栽苗作為對照，噴完后立即套上保鮮袋，并進行暗培養。24h后去除保鮮袋，將植株于溫室內25°C、光照14小時培養一個月。其中，接種內生
Fnsariim sp.防治效果為86%，是能夠提高月季抗真菌病害能力的內生真菌。實施例2
采集健康小麥帶葉的莖，在實驗室用75%乙醇(質量濃度)和3. 5%次氯酸鈉(質量濃度) 進行表面消毒處理，取枝條頂芽，在解剖鏡下切取約2mm的芽源基部分，然后接種在含:3mg/ L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS半固體培養基上培養，等形成叢生芽后，將生長2. 5cm以上的芽切割下來，轉接到含有0.5mg/L的IBA的1/2MS固體培養基上培養，當芽的底部形成健壯的根，再將試管苗進行馴化，移栽到溫室培養。同時，將采集的小麥帶葉的莖切成直徑約5mm組織塊，用75%乙醇和3. 5%次氯酸鈉進行植物組織表面消毒，然后把消毒的植物組織塊放到有麥芽汁固體培養基的平皿內培養(25°C，自然光照)，定期觀察，從植物組織內長出的真菌菌株分離到斜面中保存。將分離到的內生真菌用PDA培養基培養兩周后，用無菌水沖洗培養基表面的內生真菌培養物獲得孢子，將沖洗液用8層紗布過濾后，SOOOrpm離心lOmin，用0. 5 ml無菌水重新懸浮孢子，用血球計數板計數孢子濃度，將孢子懸液的濃度調整為106/ml。不產孢的菌株稱取IOg菌絲加入IOml無菌水，勻漿機IOOOOrpm勻質lmin，打碎菌絲片段，制成菌絲懸液。挑選健康的移栽兩個月的小麥脫毒移栽苗，于晚上7點左右，用噴霧器把上述孢子或菌絲懸液均勻噴灑在植株上，使每個葉片上都有可見的水珠為止，每種內生真菌有15個植株作為重復，每組均有噴灑無菌水的無菌苗作為對照，噴完后立即套上保鮮袋保濕，并進行暗培養。次日早上8點去除保鮮袋，25 °C，光照14小時每日，培養一個月。一個月后， 采集上述接種內生真菌的移栽苗的根、莖和葉，重新進行表面消毒后再于PDA培養基上培養，如果能夠重新分離接種用的內生真菌，說明該移栽苗被成功接種內生真菌。用106/ml的小麥黑斑病病原小麥鏈格孢菌(Wteraaria triticina)的孢子感染接種了各種小麥內生真菌的移栽苗。方法是用噴霧器把上述病原孢子懸液均勻噴在植株上，使每個葉片上都有可見的水珠為止，選取每種接種內生真菌的10個植株作為重復，每組均有噴灑無菌水的接種內生真菌的移栽苗作為對照，噴完后立即套上保鮮袋，并進行暗培養。24h后去除保鮮袋，將植株于溫室內25 °C、光照14小時培養一個月。其中，接種內 ^MMNeotyphodium sp.防治效果為80%，是能夠提高小麥抗真菌病害能力的內生真菌。實施例3
采集健康雪蓮葉片，在實驗室用75%乙醇(質量濃度)和3. 5%次氯酸鈉(質量濃度)進行表面消毒處理，在解剖鏡將葉片切成約0. 5cmX0. 5cm的組織塊，然后接種在含:3mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA的MS半固體培養基上培養，等形成叢生芽后，將生長2. 5cm以上的芽切割下來，轉接到含有0. 2mg/L的IBA的1/2MS固體培養基上培養，當芽的底部形成健壯的根， 再將試管苗進行馴化，移栽到溫室培養。同時，將采集的雪蓮帶葉的莖切成直徑約5mm組織塊，用75%乙醇和3. 5%次氯酸鈉進行植物組織表面消毒，然后把消毒的植物組織塊放到有麥芽汁固體培養基的平皿內培養(25 °C，自然光照)，定期觀察，從植物組織內長出的真菌菌株分離到斜面中保存。將分離到的內生真菌用PDA培養基培養兩周后，用無菌水沖洗培養基表面的內生真菌培養物獲得孢子，將沖洗液用8層紗布過濾后，SOOOrpm離心IOmin，用0. 5 ml無菌水重新懸浮孢子，用血球計數板計數孢子濃度，將孢子懸液的濃度調整為106/ml。不產孢的菌株稱取IOg菌絲加入IOml無菌水，勻漿機IOOOOrpm勻質lmin，打碎菌絲片段，制成菌絲懸液。挑選健康的移栽兩個月的雪蓮脫毒移栽苗，于晚上7點左右，用噴霧器把上述孢子或菌絲懸液均勻噴灑在雪蓮植株上，使每個葉片上都有可見的水珠為止，每種內生真菌有15個植株作為重復，每組均有噴灑無菌水的無菌苗作為對照，噴完后立即套上保鮮袋保濕，并進行暗培養。次日早上8點去除保鮮袋，25°C，光照14小時每日，培養一個月。一個月后，采集上述接種內生真菌的移栽苗的根、莖和葉，重新進行表面消毒后再于PDA培養基上培養，如果能夠重新分離接種用的內生真菌，說明該移栽苗被成功接種內生真菌。用106/ml的雪蓮白粉病病原的孢子感染接種了各種雪蓮內生真菌的移栽苗。方法是用噴霧器把上述病原孢子懸液均勻噴在植株上，使每個葉片上都有可見的水珠為止， 選取每種接種內生真菌的10個植株作為重復，每組均有噴灑無菌水的接種內生真菌的移栽苗作為對照，噴完后立即套上保鮮袋，并進行暗培養。24h后去除保鮮袋，將植株于溫室內25°C、光照14小時培養一個月。其中，接種內生真菌Wteraaria sp.防治效果為80%， 能夠提高雪蓮抗真菌病害能力的內生真菌。
權利要求
1.一種篩選能夠提高農作物抗真菌病害能力內生真菌的方法，其特征在于，按以下步驟進行1)采集生長健康的植物根、莖或葉，用75%乙醇和3.5%次氯酸鈉進行表面消毒處理， 在解剖鏡下切成組織塊或取其芽源基部分，然后接種在含6-BA和NAA的MS半固體培養基上培養，所述的6-BA的濃度的范圍是1-3 mg/L，NAA的濃度的范圍是0. 1-lmg/L，等形成叢生芽后，將生長2. 5cm以上的芽切割下來，轉接到含IBA的1/2MS固體培養基上培養，所述 IBA的濃度的范圍是0. 2-1 mg/L，當芽的底部形成健壯的根，再將試管苗進行馴化，移栽到溫室培養，得到無任何病害的植物脫毒移栽苗；2)將采集的植物材料每部分切成直徑約5mm組織塊，表面消毒，然后把消毒的植物組織放到有麥芽汁固體培養基的平皿內培養，在25°C，自然光照條件下，定期觀察，將從植物組織內長出的真菌菌株轉接至斜面保存；3 )將分離到的各株內生真菌制備成內生真菌孢子懸液，不產生孢子的內生真菌制成菌絲懸液；4)接種內生真菌孢子或菌絲懸液至脫毒移栽苗，以不接種內生真菌的移栽苗作為對眧. 5 )用病原真菌感染接種了內生真菌的移栽苗和不接種內生真菌的移栽苗，一個月后觀察其防治效果，防治效果大于80%的內生真菌是能夠提高該種農作物抗真菌病害能力的內生真菌。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料是農業上栽培的各種植物。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的各種植物為糧食作物、油料作物、蔬菜作物、工業原料作物、飼料作物或藥用作物的植物。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述不產生孢子的內生真菌制成菌絲懸液是稱取IOg菌絲加入IOml無菌水，勻漿機IOOOOrpm勻質lmin，打碎菌絲片段，制成懸液。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述接種內生真菌孢子或菌絲懸液至脫毒移栽苗是挑選健康的移栽兩個月的月季脫毒移栽苗，于晚上7點用噴霧器把上述孢子或菌絲懸液均勻噴灑在植株上，使每個葉片上都有可見的水珠為止，每種內生真菌有15個植株作為重復，每組均有噴灑無菌水的無菌苗作為對照，噴完后立即套上保鮮袋保濕，并進行暗培養，次日早上8點去除保鮮袋，將植株于25°C條件下，每日光照14小時，培養一個月；一個月后，采集上述接種內生真菌的移栽苗的根、莖和葉，重新進行表面消毒后再于PDA培養基上培養，如果能夠重新分離接種用的內生真菌，說明該移栽苗被成功接種該種內生真菌。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原真菌感染接種了內生真菌的移栽苗和不接種內生真菌的移栽苗的方法是，用噴霧器將上述病原孢子懸液均勻噴灑在接種了內生真菌的移栽苗和不接種內生真菌的移栽苗植株上，使每個葉片上都有可見的水珠為止，每種內生真菌有10個植株作為重復，每組均有噴灑無菌水的接種內生真菌的移栽苗作為對照，噴完后立即套上保鮮袋，并進行暗培養，24h后去除保鮮袋，將植株于25°C條件下、 光照14小時，培養一個月。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原真菌是指寄生于植物并引致病害的真菌，包括灰霉病，白粉病，霜霉病，枝枯病，黑斑病或銹病。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述防治效果按下列公式計算防治效果(％)=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數； 所述病情指數按下列公式計算病情指數(％)=Σ (病情等級代表數值X該等級株數)/ (各級株數總和X最重一級的代表數值)；所述病情等級是將發病情況分為以下五級 0級無病害；1級病斑面積占整個葉或根面積10%以下； 2級病斑面積占整個葉或根面積11%_20% ； 3級病斑面積占整個葉或根面積21%-50% ； 4級病斑面積占整個葉或根面積50%以上。
全文摘要
本發明公開了一種篩選能夠提高農作物抗真菌病害能力內生真菌的方法，其步驟為1)采集植物材料，獲得無任何病害的植物脫毒移栽苗；2)從植物中分離內生真菌；3)將分離到的各株內生真菌制備成內生真菌孢子懸液，不產生孢子的內生真菌制成菌絲懸液；4)接種內生真菌孢子或菌絲懸液至脫毒移栽苗，以不接種內生真菌的移栽苗作為對照；5)用病原真菌感染接種了內生真菌的移栽苗和不接種內生真菌的移栽苗，一個月后觀察其防治效果，防治效果大于80%的內生真菌是能夠提高該種農作物抗真菌病害能力的內生真菌。
文檔編號A01H4/00GK102283118SQ201110188288
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月6日 優先權日2011年7月6日
發明者付洪冰, 徐玲玲, 郭斌, 陶貴榮 申請人:西安文理學院