專利名稱：以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法。
背景技術：
花生是世界重要的油料作物之一，我國的花生產量居世界首位。一些生物及非生物脅迫都會影響花生的產量，尤其是地下害蟲、真菌及細菌病害。盡管傳統的雜交育種可以得到一些抗蟲抗病的品系(Garcia et al.，2006)，但是花生栽培品種遺傳多樣性低 (Kochert et al.，1991)，雜交育種周期長，育成的抗病性狀通常與其他非預期的性狀連鎖，因此，目前通過分子育種手段培育花生品種，改良花生品質具有明顯的優勢。再生體系的效率是基因轉化成功與否的關鍵，植物再生體系就是利用細胞的全能性，通過組織培養途徑或其他非組織培養途徑，在外源激素的作用下經過器官發生或胚體細胞高效、穩定地得到再生植株。外植體的選擇要求有較強的再生能力、對抗生素敏感、適宜外源基因的導入及整合。花生的組織培養開始于20世紀40年代，我國則起始于70年代， 但再生效率很低。建立一個高效的花生再生體系，對改良花生品質、提高花生產量具有重要的意義。
發明內容
針對上述領域中的缺陷，本發明提供一種以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法，該方法的芽誘導率能達到40%左右，芽伸長率達79 %，繼代生長良好，可成為基因轉化的良好的再生體系。以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法，包括如下步驟(1)選取幼嫩的葉片，剪去葉緣后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽誘導培養基上光照培養出芽，TDZ的濃度為O-Imgr1 ；NAA的濃度為0. 5-angr1，所述TDZ的濃度不高于NAA的濃度，且NAA的濃度與TDZ的濃度差值不大于Imgr1 ；(2)將產生的不定芽繼代，轉移到含有6-BA和NAA的伸長培養基上，誘導芽伸長至 2cm ；6-BA 的濃度為 4-Smgr1，NAA 的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(3)將伸長的不定芽轉到含有NAA的生根培養基上培養生根，NAA的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常規方法移植栽培。所述芽誘導培養基為MS基礎培養基。所述芽誘導培養基的TDZ的濃度為0. SmgF1 ；NAA的濃度為0. Smgr1，步驟(1)培養時間為五周。所述伸長培養基為MS基礎培養基。所述伸長培養基的6-BA的濃度為Smgl^NAA的濃度為0. Smgr1，步驟⑵培養時間為兩周。
所述生根培養基為MS基礎培養基。所述生根培養基的NAA的濃度為0. Smgr1，步驟(3)培養時間為兩周。所述幼葉為完整胚的子葉在基本培養基上培養5天后長出的幼嫩葉片。所述完整胚的子葉在培養前需對花生作無菌處理。所述無菌處理的方法為花生去殼，放置于75%乙醇中lmin，棄乙醇，0. 升汞中放置％iin，滅菌水洗3次，放置于無菌紙上至晾干。本發明采用幼葉作為花生再生體系的外植體，在含有TDZ和NAA的芽誘導培養基上誘導出芽后，再在含有6-BA和NAA的伸長培養基上促進不定芽伸長，再于含有NAA的生根培養基上培養生根，得到生根小苗，可以按常規方法移植栽培。本發明建立的再生體系， 其芽誘導率高達40%左右，芽伸長率達79%。繼代生長良好，可成為基因轉化的良好的再生體系。
圖1以幼葉為外植體的花生組織培養A 幼葉外植體B 不定芽C 誘導芽D 芽伸長E 生根F 移栽及結實
具體實施例方式芽誘導培養基為MS基礎培養基，TDZ (即噻苯隆)的濃度為O-Imgr1 ；NAA(即萘乙酸)的濃度為0. 5-2mgr1伸長培養基為MS基礎培養基，6_BA(即6_芐氨基嘌呤)的濃度為4-Smgr1，NAA 的濃度為0. 5-lmgr1 ；生根培養基為MS基礎培養基，NAA的濃度為0. 5-lmgr1MS基礎培養基可以市售，也可按配方自行配制。花生為市售的任一品種。實施例11.以幼葉為外植體芽誘導培養基及伸長培養基的確定1.花生去殼，放置于75%乙醇中lmin，棄乙醇，0. 1 %升汞中放置％iin，滅菌水洗 3次，放置與無菌紙上至吹干；2.用無菌的手術刀，將花生兩個子葉分開，含有完整胚的子葉放置在基本培養基上，光照培養；3.選取培養不同時間幼嫩的葉片，剪去葉緣后，正面朝上放置在含有TDZ、6_BA和 NAA的芽誘導培養基上(表1)，光照培養，每種培養基放置35個左右外植體；表1芽誘導培養基正交實驗設計
權利要求
1.以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法，包括如下步驟(1)選取幼嫩的葉片，剪去葉緣后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽誘導培養基上光照培養出芽，TDZ的濃度為O-Imgr1 ；NAA的濃度為0. 5-angr1，所述TDZ的濃度不高于NAA 的濃度，且NAA的濃度與TDZ的濃度差值不大于Imgr1 ；(2)將產生的不定芽繼代，轉移到含有6-BA和NAA的伸長培養基上，誘導芽伸長至 2cm ；6-BA 的濃度為 4-Smgr1，NAA 的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(3)將伸長的不定芽轉到含有NAA的生根培養基上培養生根，NAA的濃度為 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常規方法移植栽培。
2.根據權利要求1所述的方法，所述芽誘導培養基為MS基礎培養基。
3.根據權利要求2所述的方法，所述芽誘導培養基的TDZ的濃度為0.SmgF1 ；NAA的濃度為0. Smgr1，步驟(1)培養時間為五周。
4.根據權利要求1所述的方法，所述伸長培養基為MS基礎培養基。
5.根據權利要求4所述的方法，所述伸長培養基的6-BA的濃度為Smgl—1，NAA的濃度為0. δπ^Γ1，步驟(2)培養時間為兩周。
6.根據權利要求1所述的方法，所述生根培養基為MS基礎培養基。
7.根據權利要求6所述的方法，所述生根培養基的NAA的濃度為0.Smgl—1，步驟(3)培養時間為兩周。
8.根據權利要求1所述的方法，所述幼葉為完整胚的子葉在基本培養基上培養5天后長出的幼嫩葉片。
9.根據權利要求5所述的方法，所述完整胚的子葉在培養前需對花生作無菌處理。
10.根據權利要求9所述的方法，所述無菌處理的方法為將花生去殼，放置于75%乙醇中lmin，棄乙醇，0. 升汞中放置％iin，滅菌水洗3次，放置于無菌紙上至晾干。
全文摘要
本發明涉及以幼葉為外植體花生再生體系的建立方法，屬于生物技術領域。本發明采用幼葉作為花生再生體系的外植體，在含有TDZ和NAA的芽誘導培養基上誘導出芽后，再在含有6-BA和NAA的伸長培養基上促進不定芽伸長，再于含有NAA的生根培養基上培養生根，得到生根小苗，可以按常規方法移植栽培。本發明建立的再生體系，其芽誘導率高達40％左右，芽伸長率達79％。繼代生長良好，可成為基因轉化的良好的再生體系。
文檔編號A01H4/00GK102257965SQ201110179839
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者宋福平, 張 杰, 束長龍, 耿麗麗, 黃大昉 申請人:中國農業科學院植物保護研究所