專利名稱：三倍體鐵皮石斛的培育方法
技術領域：
本發明涉及一種三倍體鐵皮石斛的培育方法。
背景技術：
鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall, ex Lindl)又稱黑節草，它是一種附生、多年生草本蘭科植物。主要分布在我國云南、貴州、廣西、臺灣等地。年平均氣溫12-18度，相對濕度60-75%，林間透光度60%左右，年降雨量1100-1500mm。生長在常綠闊葉林中，附生于樹干上或石灰巖上。野生鐵皮石斛種子成活率極低，生長緩慢，從種子萌發到進入商品階段需5-7年才能采收，造成其產量很少。近年，由于市埸供不應求，人們過度采挖，再加上環境惡化，鐵皮石斛自然資源已日趨枯竭。鐵皮石斛，加工后俗稱鐵皮楓斗，為傳統名貴中藥材，具有增強免疫力、抗腫瘤、滋陰養胃，清熱生津、潤肺止咳之功效。預測鐵皮石斛將成為21世紀高級護嗓保健飲品。近代藥理藥化研究表明，鐵皮石斛藥物化學成分主要是多糖類、生物堿和抗腫瘤活性物質。多糖含量達18. 2% -22. 27%，這些多糖類是免疫增強劑，具有增強T細胞及巨噬細胞免疫活性作用。鐵皮石斛含有兩種抗癌菲類化合物，具有對肝癌和艾氏腹水癌細胞的抑制作用。鐵皮石斛滋陰清熱生津作用主要與-ATP酶活性有關。國家“十一五”和“十二五”計劃均提出“種質資源的挖掘、保存、創新和新品種的定向培育”的任務。為貫徹、落實這項任務，我們提出應用“基因組多倍化與雜交相結合”的方法，可以實現種質資源的創新和新品種的定向培育的目的。
發明內容
本發明的目的是提供一種三倍體鐵皮石斛的培育方法，應用“基因組多倍化與雜交相結合”的方法，培育三倍體鐵皮石斛，可以實現種質資源的創新和新品種的定向培育的目的。它是首先將自然界存在的二倍體鐵皮石斛人工誘變成同源四倍體，然后，四倍體鐵皮石斛與二倍體雜交，產生三倍體鐵皮石斛，即4x早Xh $ — 3x,由此可知，三倍體鐵皮石斛是由雜交產生的，具有雜交優勢，同時，三倍體是多倍體亦具有多倍體優勢，所以，三倍體具有雜交種和多倍體雙重優勢。同時，形成三倍體后，在“空間上”與其他物種形成了生殖隔離，不能形成后代，沒有后代分離，其雜交第一代是永久雜種(可記為永久F1)，固定了雜種優勢。因此，三倍體鐵皮石斛藥材產量和主要藥物成分含量方面具有超強的優勢，具有重要應用價值。本發明三倍體鐵皮石斛的培育方法包括以下步驟1)首先從種質資源中選出優良鐵皮石斛品種；2)對選出的優良鐵皮石斛進行人工誘變，獲得同源四倍體鐵皮石斛；3)以四倍體鐵皮石斛為母本與二倍體鐵皮石斛為父本進行有性雜交，獲得三倍體鐵皮石斛種子；4)對三倍體鐵皮石斛種子進行非共生萌發培養；5)對三倍體鐵皮石斛種子原球莖(PLBs)進行誘導與分化培養；
6)三倍體鐵皮石斛成苗分化；7)三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽與按常規鐵皮石斛進行成苗栽培管理。本發明提供的一種三倍體鐵皮石斛的培育方法包括以下步驟1) 二倍體鐵皮石斛按常規方法進行栽培管理，在開花后的5-10天內進行同株異花授粉，授粉后的鐵皮石斛植株，放在通風、半透光條件下，保持30-50%濕度，15-20°C溫度。2)在人工授粉后120-160天，剪下鐵皮石斛蒴果，在超凈工作臺內用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將淡黃色鐵皮石斛種子接種在1/2MS液體培養基中，60次/分振動或靜止非共生萌發培養約40-50天，至種子類原球莖(PLBs)發育成球形。3)進行四倍體鐵皮石斛人工誘導，將發育成球形的種子原球莖(原胚期)轉入含有0. 02%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中，誘變處理150-180小時，4)將誘變處理后的鐵皮石斛原球莖轉入1/2MS固體培養基上繼續培養，直至鐵皮石斛成苗形成，至成苗分化；取幼苗的根尖，先進行染色體前處理，然后進行染色體倍性鑒定，選取染色體數目2n = 76的幼苗，是加倍成的同源四倍體鐵皮石斛；所述的繼續培養是在光照下，光周期14小時/天，光強度3000LUX，室溫25°C ；所述的染色倍性體鑒定方法按株編號，取幼苗新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中前處理3-4h，然后放入體積比3 1的甲醇與冰醋酸固定液中，4°C冰箱中保存備用；用卡寶品紅染色液染色，壓片法制備染色體標本；400倍以上顯微鏡觀察染色體數目，選取染色體數目為2n = 76的幼苗，是加倍成的同源四倍體鐵皮石斛；5)四倍體鐵皮石斛的栽培管理，將加倍成功的鐵皮石斛幼苗進行移栽，按常規的鐵皮石斛進行栽培管理，直至開花；6)當四倍體鐵皮石斛開花后，以人工誘變的同源四倍體鐵皮石斛為母本，二倍體鐵皮石斛為父本，進行有性雜交，所結的鐵皮石斛種子全部為三倍體鐵皮石斛，即 4χ 早 Χ2χ 古一3χ ；三倍體鐵皮石斛與二倍體鐵皮石斛相比，其主要形態性狀基本相同，但其莖、葉、 花表現出明顯的增大，藥材產量與石斛多糖含量顯著提高。三倍體具有多倍體和雜交種雙重優，其雜交一代是“永久F1”，即永久雜種，固定了雜種優勢。7)對三倍體鐵皮斛種子進行非共生萌發培養、原球莖誘導、成苗分化、成苗移栽， 按常規鐵皮石斛進行栽培管理。本發明提供了一種鐵皮石斛新品種的培育方法，特別是鐵皮石斛三倍體的培育方法，可以實現種質資源的創新和新品種的定向培育的目的。通過基因組三倍化，可以獲得具有多倍體和雜交種雙重優勢的三倍體，其優勢表現出具有巨大性和不可替代性，可以大幅度提高鐵皮石斛藥材產量，同時，三倍體鐵皮石斛是永久雜種，可以固定雜種優勢。三倍體鐵皮石斛具有雜交種和多倍體雙重優勢。同時，形成三倍體后，在“空間上”與其他物種形成了生殖隔離，不能形成后代，沒有后代分離，其雜交第一代是永久雜種(可記為永久F1)， 即固定了雜種優勢。因此，三倍體鐵皮石斛藥材產量和主要藥物成分含量方面具有超強的優勢，具有重要應用價值。
圖1
圖2
圖3
圖4PLBs0
圖5
圖6
圖7
圖8
二倍體鐵皮石斛親本，染色體數目為2n = h = 38。 四倍體鐵皮石斛親本，染色體數目為2n =虹=76。 二倍體與四倍體鐵皮石斛雜交Fl正、反交果實。
二倍體與四倍體雜交Fl鐵皮石斛種子非共生萌發培養，剪頭為放大的萌發
三倍體鐵皮石斛的成苗分化培養。
三倍體鐵皮石斛瓶苗培養，箭頭為放大的瓶苗。
三倍體鐵皮石斛的倍性鑒定，2η = 3χ = 57。
三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽前煉苗(a)與移栽后苗床培養(b)。
具體實施例方式本發明突出的特點和顯著進步可從下述實例中得以體現，但不會對本發明作任何限制。本發明三倍體鐵皮石斛的培育方法包括以下步驟1)首先從種質資源中選出優良二倍體鐵皮石斛品種；2)對選出的優良二倍體鐵皮石斛進行人工誘變，獲得同源四倍體鐵皮石斛，參照 ZL200710061225. 8誘導四倍體的方法；3)以四倍體鐵皮石斛為母本、二倍體鐵皮石斛為父本進行有性雜交，獲得三倍體鐵皮石斛種子；4)對三倍體鐵皮石斛種子進行非共生萌發培養；5)對三倍體鐵皮石斛種子原球莖(PLBs)進行誘導與分化培養；6)三倍體鐵皮石斛成苗分化誘導培養；
7)三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽與按常規鐵皮石斛進行成苗栽培管理。具體應用實施例2005年4月從云南省文山引入二倍體鐵皮石斛Qn = 38)，如圖1，于當年5月 20日進行同株異花人工授粉，授粉后的鐵皮石斛在25°C，50%自然光照條件下，至2005年 11月22日，剪下蒴果，在超凈工作臺內，先用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞消毒10 分鐘，無菌水沖洗5遍，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向切開，將鐵皮石斛種子接種在1/2MS 液體培養基中，25°C條件下振蕩培養，約30天后，轉入含有0. 01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中，誘變處理130小時，后轉入1/2MS固體培養基上，在光周期14小時/天，光強度 3000LUX，室溫25°C條件下繼續培養，直至鐵皮石斛成苗分化。在瓶苗移栽時，按株分別取新生長的根尖，用壓片法制備染色體標本，選取加倍成功的鐵皮石斛幼苗On = 76)，進行移栽，按常規鐵皮石斛的栽培條件進行栽培管理。2008年5月30日四倍體鐵皮石斛第一次開花，如圖2。在開花一周以內，以原文山二倍體鐵皮石斛為父本，誘變成功的四倍體鐵皮石斛為母本，進行人工授粉，至2008年 10月20日將雜交獲得的接近成熟的三倍體鐵皮石斛蒴果(143天)剪下，如圖3，在超凈工作臺內，先用75 %酒精消毒1分鐘，再用0. 1 %升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗5遍，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向切開，將鐵皮石斛種子接種在1/2MS液體培養基中，25°C條件下振蕩培養3-4周，轉入靜置培養，直至種子萌發形成種子原球莖，如圖4 ；然后轉入1/2MS固體培養基中，在光周期14小時/天，光強度3000LUX，室溫25°C條件下進行三倍體鐵皮石斛成苗分化培養，如圖5 ；接著繼續瓶苗培養，如圖6 ；在瓶苗生長至瓶口 1/2-2/3高度、葉片3-4片、新根生長旺盛時，打開瓶口進行煉苗，如圖8a ；移栽前進行染色體倍性鑒定，如 圖7，2n = 57為雜交轉育成的三倍體鐵皮石斛，可進行瓶苗移栽，如圖Sb。
三倍體鐵皮石斛成苗栽培管理與一般二倍體鐵皮石斛栽培管理條件基本一致，成苗移植按常規的鐵皮石斛栽培管理條件，直至開花和藥材采收。
權利要求
1.一種三倍體鐵皮石斛的培育方法，其特征在于包括以下步驟1)首先從種質資源中選出優良鐵皮石斛品種；2)對選出的優良鐵皮石斛進行人工誘變，獲得同源四倍體鐵皮石斛；3)以四倍體鐵皮石斛為母本與二倍體鐵皮石斛為父本進行有性雜交，獲得三倍體鐵皮石斛種子；4)對三倍體鐵皮石斛種子進行非共生萌發培養；5)對三倍體鐵皮石斛種子原球莖(PLBs)進行誘導與分化培養；6)三倍體鐵皮石斛成苗分化；7)三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽與按常規鐵皮石斛進行成苗栽培管理。
2.一種三倍體鐵皮石斛的培育方法，其特征在于包括以下步驟1)二倍體鐵皮石斛按常規方法進行栽培管理，在開花后的5-10天內進行同株異花授粉，授粉后的鐵皮石斛植株，放在通風、半透光條件下，保持30-50%濕度、15-20°C溫度。2)在人工授粉后120-160天，剪下鐵皮石斛蒴果，在超凈工作臺內用75%酒精消毒1 分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將淡黃色鐵皮石斛種子接種在1/2MS液體培養基中，50-80轉/分，振動或靜止非共生萌發培養約40-50天，至種子類原球莖(PLBs)發育成球形；3)進行四倍體鐵皮石斛人工誘導，將發育成球形的種子原球莖(原胚期)轉入含有 0. 02%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中，誘變處理150-180小時，4)將誘變處理后的鐵皮石斛原球莖轉入1/2MS固體培養基上繼續培養，直至鐵皮石斛成苗形成，至成苗分化；取幼苗的根尖，先進行染色體前處理，然后進行染色體倍性鑒定，選取染色體數目2n = 76的幼苗，是加倍成功的同源四倍體鐵皮石斛；5)四倍體鐵皮石斛的栽培管理，將加倍成功的鐵皮石斛幼苗進行移栽，按常規的鐵皮石斛進行栽培管理，直至開花；6)當四倍體鐵皮石斛開花后，以人工誘變的同源四倍體鐵皮石斛為母本，二倍體鐵皮石斛為父本，進行有性雜交，所結的鐵皮石斛種子全部為三倍體鐵皮石斛，即 4χ 早 Χ2χ 古一3χ ；三倍體鐵皮石斛與二倍體鐵皮石斛相比，其主要形態性狀基本相同，但其莖、葉、花表現出明顯的增大，藥材產量與石斛多糖含量顯著提高。三倍體具有多倍體和雜交種雙重優， 其雜交一代是“永久F1”，即永久雜種，固定了雜種優勢。7)對三倍體鐵皮斛種子進行非共生萌發培養、原球莖誘導、成苗分化，成苗移栽，按常規鐵皮石斛進行栽培管理。
3.按照權利要求2所述的培育方法，其特征在于步驟4)所述的繼續培養是在光照下， 光周期14小時/天，光強度3000LUX，室溫25°C。
4.按照權利要求2所述的培育方法，其特征在于步驟4)所述的染色體倍性鑒定方法 按株編號，取幼苗新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中前處理3-4h，然后放入體積比3 1的甲醇與冰醋酸固定液中，4°C冰箱中保存備用；用卡寶品紅染色液染色，壓片法制備染色體標本；400倍以上顯微鏡觀察染色體數目，選取染色體數目為2n = 76的幼苗，是加倍成的同源四倍體鐵皮石斛。
全文摘要
本發明涉及一種三倍體鐵皮石斛的培育方法，該方法包括①首先對鐵皮石斛種質資源進行廣泛收集，從中選出優良鐵皮石斛；②對選出的優良鐵皮石斛進行人工誘變，獲得同源四倍體鐵皮石斛；③以四倍體鐵皮石斛為母本與二倍體鐵皮石斛為父本進行有性雜交，獲得三倍體鐵皮石斛種子；④對三倍體鐵皮石斛種子進行非共生萌發培養；⑤對三倍體鐵皮石斛種子原球莖(PLBs)進行誘導與分化培養；⑥三倍體鐵皮石斛成苗分化；⑦三倍體鐵皮石斛瓶苗移栽；⑧三倍體鐵皮石斛成苗栽培管理。本發明通過基因組三倍化，可以獲得具有多倍體和雜交種雙重優勢的三倍體，其優勢表現出具有巨大性和不可替代性，可以大幅度提高鐵皮石斛藥材產量，同時，三倍體鐵皮石斛是永久雜種，可以固定雜種優勢。
文檔編號A01H4/00GK102257964SQ20111017788
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者李秀蘭, 陳力, 陳瑞陽 申請人:南開大學