專利名稱：春石斛蘭多倍體復合體的人工培育及種苗工廠化生產方法
技術領域：
本發明涉及蘭花人工培育方法及其種苗工廠化生產技術，特別是一種春石斛蘭 (Dendrobium Nobile)人工多倍體復合體的培育及種苗工廠化生產方法。
背景技術：
石斛蘭(Dendrobium)，是世界四大觀賞洋蘭之一。目前國際上已培育出大量石斛蘭觀賞品種，2010年在東京召開的世界蘭花大會上，一株開了 2000多朵花的石斛蘭獲得金獎，石斛蘭新品種培育已成為世界花卉育種的新熱點。然而，迄今為止，世界石斛蘭花新品種的培育多采用品種間雜交獲得。例如CN200710160571. 1和CN200710160572. 6公開了一種春石斛組織培養快繁方法和工廠化栽培方法。這些方法存在品種間雜交變異范圍窄，新品種選育頻率低的問題。
發明內容
本發明的目的是提供一種春石斛蘭人工多倍體復合體的培育及種苗工廠化生產方法，可以克服一般品種間雜交變異范圍窄，新品種選育頻率低的缺陷。它是通過“基因組多倍化與雜交相結合”的方法。首先，將普通二倍體春石斛蘭人工誘變成同源四倍體春石斛，然后，與二倍體春石蘭雜交，創造出三倍體春石斛蘭新種質，在此基礎上，再將三倍體春石斛蘭人工誘變成六倍體春石斛蘭。三倍體、六倍體春石斛蘭都是迄今為止在自然界不存在的品種，是人工創造的新物種，具有極強的生命力和應用價值。本發明同時還建立了通過春石斛蘭種子類原球莖(PLBs)進行春石斛蘭多倍體復合體種苗工廠化生產技術，種苗生產可達100萬株/年以上，為春石斛蘭新品種推廣奠定了基礎。本發明提供的一種春石斛蘭花人工多倍體復合體的培育及其種苗工廠化生產方法包括以下步驟在普通二倍體春石斛蘭開花期進行人工授粉，取收獲的蒴果，將種子接種在1/2MS 液體培養基中進行非共生萌發培養，將原胚期種子原球莖移入含有0.01%秋水仙堿的 1/2MS液體培養基中進行誘變培養，后轉入1/2MS固體培養基光照培養，直至春石斛蘭成苗，選取染色體數目2n = 76的四倍體幼苗進行開花培養，開花后，以四倍體為母本，二倍體為父本Gx ^ X2x $ )或以二倍體為母本，四倍體為父本Qx ^ X4x $ )雜交，獲得三倍體春石斛蘭。三倍體春石斛蘭雜交種子形成早期(原胚期)再移入含有0.01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行六倍體人工誘變處理，處理150-180h后，轉入1/2MS固體培養基光照培養，直至春石斛蘭成苗，選取染色體數目2η = 114的幼苗，為加倍成功的六倍體春石斛蘭。然后進行瓶苗移栽。按常規的春石斛蘭栽培管理，直至開花。本發明提供的一種春石斛蘭花人工多倍體復合體的培育及其種苗工廠化生產方法包括以下步驟1、四倍體春石斛蘭培育方法步驟如下1) 二倍體春石斛蘭的開花與人工授粉按常規方法進行春石斛蘭的栽培管理，每年春天4-5月份，在春石斛蘭開花后一周內，進行自花或同株異花人工授粉，授粉后的春石斛蘭要精心管理，放在通風、半透光，室溫20-25°C，濕度30-50%條件下，防止落花落果，收獲成功授粉后，生長4-5個月后的蒴果。2)春石斛蘭種子非共生萌發培養取上述授粉后4-5個月得到的蒴果，在超凈臺內用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向切開，將春石斛蘭種子接種在1/2MS液體培養基中，間歇振蕩，進行種子非共生萌發培養20-60天。至種子類原球莖(PLBs)發育成球形。3)四倍體春石斛蘭的人工誘變將發育成球形的種子原球莖(原胚期)移入含有 0. 01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行誘變處理，處理150-180小時后轉入1/2MS固體培養基上繼續培養，室溫25°C，培養30-60天在光周期14小時/天，光強度3000Lux，直至春石斛蘭成苗移栽。4)四倍體春石斛蘭染色體鑒定在瓶苗移栽時，按株編號，取新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中前處理4小時，后將根尖轉入體積比為3 1的甲醇與冰醋酸固定液中固定4小時以上，4°C冰箱中保存備用。用卡寶品紅染色液染色，壓片法制備染色體標本，400倍以上顯微鏡觀染色體數目，選取染色體數目2n = 76的幼苗，為加倍成功的四倍體春石斛蘭，其他染色體數目的幼苗，不能使用。5)四倍體春石斛蘭的栽培管理四倍體春石斛蘭除植株健壯，葉片加厚，花大，抗病性提高外，其他與二倍體春石斛蘭基本相同，栽培管理條件也相同。2、三倍體春石斛蘭的雜交轉育三倍體春石斛蘭是由四倍體春石斛蘭與二倍體春石斛蘭雜交產生的，以四倍體為母本，二倍體為父本Gx ^ Χ2Χ $ )或以二倍體為母本，四倍體為父本Qx早X^ $ )都能獲得三倍體春石斛蘭。3、六倍體春石斛蘭的人工誘變在三倍體春石斛蘭雜交種子形成早期(原胚期)， 應用上述方法③進行人工加倍，可以獲得頻率較高的六倍體春石斛蘭。4、春石斛蘭多倍體復合體種苗工廠化生產包括的步驟步驟1)所述的四倍體春石斛蘭種苗工廠化生產方法包括的步驟是在四倍體春石斛蘭人工授粉后約150-200天，剪下春石斛蘭蒴果，在超凈工作臺內用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將石斛種子接種在1/2MS液體培養基中，振動或靜止，進行種子非共生萌發培養約 60天，轉移至1/2MS固體培養基上，在光周期14小時/天，光強度3000LUX，室溫25°C條件下繼續培養，直至四倍體春石斛蘭成苗移栽。按照常規春石斛蘭栽培管理。步驟2)所述的三倍體春石斛蘭種苗工廠化生產方法包括的步驟是在 4x ^ Xh早X4x $人工授粉后約150-200天，剪下雜交蒴果，在超凈工作臺內用 75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將石斛種子接種在1/2MS液體培養基中，振動或靜止，進行種子非共生萌發培養；在種子類原球莖形成后，轉移到1/2MS固體培養基上，在光周期14小時/ 天，光強度3000LUX，室溫25C條件下繼續培養，直至三倍體春石斛蘭種苗移栽。按照常規春石斛蘭栽培管理。步驟3)所述的六倍體春石斛蘭種苗工廠化生產方法是在虹早Xh $或 2x ^ X4x $人工授粉后約150-200天，剪下雜交蒴果，在超凈工作臺內用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將石斛種子接種在1/2MS液體培養基中，振動或靜止，進行種子非共生萌發培養；在種子非共生萌發培養約20天后，在種子類原球莖形成初期(原胚期)，移入含有 0. 01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行誘變處理約150-180小時，然后轉入1/2MS固體培養基上，在光周期14小時/天，光強度3000LUX，室溫25°C條件下繼續培養，直至春石斛蘭成苗移栽。按照常規春石斛蘭栽培管理。在瓶苗移栽時，按株編號，取新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中前處理 4小時，后將根尖轉入體積比為3 1的甲醇與冰醋酸固定液中固定4小時以上，4°C冰箱中保存備用。用卡寶品紅染色液染色，壓片法制備染色體標本，400倍以上顯微鏡觀染色體數目，選取染色體數目2n = 114的幼苗，為加倍成功的六倍體春石斛蘭，然后進行瓶苗移栽。本發明提出的通過“基因組多倍化與雜交相結合的方法”來培育春石斛蘭多倍體復合體，與以往的方法相比，具有諸多優點，可以獲得更多的品種類型，多倍體春石斛蘭不僅花大，而且，三倍體石斛蘭具有多倍體和雜交種雙重優勢，生長旺盛，抗病性強，同時還能進行雜交制種。
圖1二倍體春石斛蘭親本，2n = 2x = 38。
圖2二倍體春石斛蘭蒴果。
圖3同源四倍體春石斛蘭的人工誘變。
圖4四倍體春石斛蘭的分化培養。
圖5四倍體春石斛蘭移栽苗。
圖6一年生四倍體與二倍體春石斛蘭盆栽植株的比較。
圖7四倍體春石斛蘭親本，2n = 4x = 76。
圖8二倍體與四倍體春石斛蘭雜交Fl蒴果。
圖9二倍體與四倍體春石斛蘭雜交Fl種子萌發。
圖10三倍體春石斛蘭原胚期原球莖的六倍體人工誘導
圖11三倍體春石斛蘭的倍性鑒定，2η = 3χ = 57。
圖12六倍體春石斛蘭的倍性鑒定，2η = 6χ= 114。
具體實施例方式本發明提供的一種春石斛蘭花人工多倍體復合體的培育及其種苗工廠化生產方法包括以下步驟在普通二倍體春石斛蘭開花期進行人工授粉，取收獲的蒴果，將種子接種在1/2MS 液體培養基中進行非共生萌發培養，將原胚期種子原球莖移入含有0.01%秋水仙堿的 1/2MS液體培養基中進行誘變培養，后轉入1/2MS固體培養基光照培養，直至春石斛蘭成苗，選取染色體數目2n = 76的四倍體幼苗進行開花培養，開花后，以四倍體為母本，二倍體為父本Gx ^ X2x $ )或以二倍體為母本，四倍體為父本Qx ^ X4x $ )雜交，獲得三倍體春石斛蘭。三倍體春石斛蘭雜交種子形成早期(原胚期)再移入含有0.01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行六倍體人工誘變處理，處理150-180h后，轉入1/2MS固體培養基光照培養，直至春石斛蘭成苗，選取染色體數目2η = 114的幼苗，為加倍成功的六倍體春石斛蘭。然后進行瓶苗移栽。按常規的春石斛蘭栽培管理，直至開花。具體應用實施例2005年12月自天津市曹莊花卉市場購入二倍體春石斛蘭，如圖1，于2006年1月 27日進行同株異花人工授粉，授粉后的春石斛蘭放在20-25°C，自然光照條件下，至2006年 8月10日(196天)剪下蒴果，如圖2，用自來水清洗表面后，在超凈工作臺內，用75%酒精消毒60秒，然后用0. 1 %升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗5遍，將蒴果放入鋪有濾紙的無菌培養皿中，沿蒴果縱軸方向，用無菌解剖刀將蒴果切開，將春石斛種子接種在1/2MS液體培養基中，在20-25°C條件下，間歇振蕩培養。在培養30-40天后，轉入含有0. 01%秋水仙堿的 l/2MS(pH5. 6-5. 8)液體培養基中，誘變處理150-180小時，如圖3，后將其置換，再在1/2MS 液體培養基中繼續培養至30-60天，然后轉入1/2MS固體培養基上，在光周期14小時/天， 光強度3000LUX，室溫20-25°C條件下繼續培養，直至春石斛蘭幼苗分化，如圖4。圖5所示， 在瓶苗移栽前，按同批材料分別取新生根尖，用對二氯苯飽和水溶液處理4小時，后將根尖放入體積3 1甲醇冰醋酸固定液中固定半小時以上，4°C冰箱保存備用。用壓片法制備染色體標本，卡寶品紅染色液染色，顯微鏡觀察，確定染色體數目2n = 76的幼苗為加倍成功的同源四倍體春石斛蘭幼苗(圖6)，然后進行瓶苗移栽。四倍體春石斛蘭幼苗按一般二倍體春石斛蘭進行栽培管理，直至開花。2008年1月觀日用本發明創造的同源四倍體春石斛蘭作母本，二倍體春石斛蘭作父本，或二倍體春石斛蘭作母本，四倍體春石斛蘭作父本，進行三倍體春石斛蘭的雜交轉育，即乜早Χ2χ早Χ4χ $ — 3χ，見圖1，圖7，人工授粉后183天(2008年1月28 日至2008年7月30日)將蒴果剪下(圖8)，用上述方法將三倍體春石斛蘭種子接種在 1/2MS液體培養基中，培養20-40天(圖9，圖10)，轉入含0. 01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中，進行六倍體人工誘變，誘變處理192小時，后轉入正常1/2MS液體培養基中繼續培養，30-60天后轉入1/2MS固體培養基中進行春石斛蘭幼苗分化培養。在瓶苗移栽前，按同批材料分別取新生根尖，用去壁、低滲法制備染色體標本，即 新生根尖用對二氯苯飽和水溶液前處理4小時一前低滲用0. 075Μ KCl溶液處理15分鐘 —去壁用2. 5%混合酶(果膠酶+纖維素酶)25°C處理1小時一后低滲用0.075M KCl 溶液處理15分鐘一固定用3 1(甲醇冰醋酸)固定30分鐘以上一涂片一Giemsa染色一顯微鏡觀察，確定染色體數目2n = 114的幼苗為加倍成功的六倍體春石斛蘭幼苗(圖 12), 2n = 57的幼苗為三倍體(圖11)，然后進行瓶苗移栽。移栽后的六倍體種苗按照常規春石斛蘭栽培管理條件，特別注意通風、保持50-60%遮光，濕度保持在30-50%以上。
權利要求
1.一種春石斛蘭人工多倍體復合體的培育及其種苗工廠化生產方法，其特征在于它包括以下步驟在普通二倍體春石斛蘭開花期進行人工授粉，取收獲的蒴果，將種子接種在1/2MS液體培養基中進行非共生萌發培養，原胚期原球莖移入含有0. 01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行同源四倍體的人工誘變培養，后轉入1/2MS固體培養基光照培養，直至春石斛蘭成苗，選取染色體數目2n = 76的幼苗，在晝夜溫度在25-15°C條件下進行培養，直至開花。然后進行三倍體春石斛蘭的雜交轉育，以四倍體為母本，二倍體為父本或以二倍體為母本，四倍體為父本雜交，獲得三倍體春石斛蘭；三倍體春石斛蘭雜交種子形成早期(原胚期)再移入含有0. 01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行六倍體的人工誘變培養，誘變處理150-180h，后轉入1/2MS固體培養基光照培養，直至春石斛蘭成苗；選取染色體數目2η =114的幼苗，為加倍成功的六倍體春石斛蘭，然后將進行瓶苗移栽，按常規的春石斛蘭栽培管理條件，直至開花。
2.一種春石斛蘭人工多倍體復合體的培育及其種苗工廠化生產方法，其特征在于它包括以下步驟四倍體春石斛蘭花的培育方法1)二倍體春石斛蘭按常規方法進行栽培管理，在開花后的5-10天內進行自花或同株異花授粉，授粉后的春石斛蘭植株放在通風、半透光、保持30-50%濕度、15-25°C溫度條件下，直至蒴果形成；2)在人工授粉后的春石斛蘭生長4-5個月后，剪下蒴果，在超凈工作臺內用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將淡黃色春石斛蘭種子接種在1/2MS液體培養基中，間歇振蕩，進行種子非共生萌發培養20-50天，至種子類原球莖(PLBs)發育成球形；3)四倍體春石斛蘭的人工誘變春石斛蘭種子非共生萌發培養約20天后，在種子類原球莖形成初期(原胚期)，移入含有0. 01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行人工四倍體的誘變，誘變處理150-180小時，然后轉入1/2MS固體培養基上繼續培養，室溫25°C，光周期14h/天，光強度3000LUX，培養60-90d，直至春石斛蘭成苗移栽；4)四倍體春石斛蘭染色體鑒定在瓶苗移栽時，按株編號，取新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中前處理4小時，后將根尖轉入體積比為3 1的甲醇與冰醋酸固定液中固定4小時以上，4°C冰箱中保存備用。用卡寶品紅染色液染色，壓片法制備染色體標本， 400倍以上顯微鏡觀染色體數目，選取染色體數目2n = 76的幼苗，為加倍成功的四倍體春石斛蘭。三倍體春石斛蘭花的培育方法5)按通常方法，以四倍體春石斛蘭為母本，二倍體春石斛蘭為父本或以二倍體春石斛蘭為母本，四倍體春石斛蘭為父本，進行人工雜交，雜交所產生的種子為三倍體春石斛蘭種子，即4χ早X 2χ古或2χ早X4χ古一3χ ；六倍體春石斛蘭花的培育方法6)六倍體春石斛蘭是通過三倍體春石斛蘭雜交第一代種子的人工誘變獲得的，其步驟是(1)在四倍體與二倍體春石斛蘭雜交授粉后15-20周時，剪下雜交蒴果，按上述步驟2),3)的方法，在超凈工作臺內，用75%酒精將朔果消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒 10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將淡黃色石斛蘭種子接種在1/2MS液體培養基中，振動或靜止，進行種子非共生萌發培養20-60天，至種子類原球莖(PLBs)發育成球形；(2)將發育成球形的種子原球莖(原胚期)轉入含有0.01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中處理150-180小時，進行六倍體春石斛蘭的人工誘變；(3)將誘變處理后的春石斛蘭原球莖轉入1/2MS固體培養上，繼續培養，直至春石斛蘭成苗形成；(4)通過染色體數目鑒定，確定2n= 114的幼苗為加倍成功的六倍體春石斛蘭；所述的四倍體種苗的工廠化生產方法包括以下步驟四倍體春石斛蘭開花5-10天內，以自花或同株異花進行人工授粉，授粉后的春石斛蘭植株，放在通風、半透光、保持30-50%濕度、15-25°C溫度條件下生長；在四倍體春石斛蘭人工授粉后150-200天，剪下春石斛蘭蒴果，在超凈工作臺內用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將淡黃色石斛蘭種子接種在1/2MS液體培養基中，振動或靜止，進行種子非共生萌發培養30-60天，種子原球莖形成，轉移至1/2MS固體培養基上，在光周期14小時/天，光強度 3000Lux,室溫25°C條件下繼續培養，培養約60-90天，直至四倍體春石斛蘭成苗移栽；按照常規春石斛蘭栽培管理；所述的三倍體春石斛蘭種苗工廠化生產方法包括以下步驟在4x早Xh $或 2x ^ X4x $人工授粉后150-200天，剪下雜交蒴果，在超凈工作臺內用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將淡黃色石斛種子接種在1/2MS液體培養基中，振動或靜止，進行種子非共生萌發培養；在種子類原球莖形成后，轉移到1/2MS固體培養基上，在光周期14小時/天，光強度 3000LUX，室溫25C條件下繼續培養，直至三倍體春石斛蘭種苗移栽；按照常規春石斛蘭栽培管理；所述的六倍體春石斛蘭種苗的工廠化生產方法包括以下步驟在4χ早Χ2χ $或 2x ^ Χ4χ $人工授粉后150-200天，剪下雜交蒴果，在超凈工作臺內用75%酒精消毒1分鐘，再用0. 升汞水溶液消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌手術刀沿蒴果縱軸方向切開，將淡黃色石斛蘭種子接種在1/2MS液體培養基中，振動或靜止，進行種子非共生萌發培養；在種子非共生萌發培養約20天后，在種子類原球莖形成初期(原胚期)，移入含有 0. 01%秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行誘變處理150-180小時，然后轉入1/2MS固體培養基上，在光周期14小時/天，光強度3000LUX，室溫25°C條件下繼續培養，直至春石斛蘭成苗移栽；在瓶苗移栽時，按株編號，取新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中前處理4小時，后將根尖轉入體積比為3 1的甲醇與冰醋酸固定液中固定4小時以上，4°C冰箱中保存備用。用卡寶品紅染色液染色，壓片法制備染色體標本，400倍以上顯微鏡觀染色體數目， 選取染色體數目2η= 114的幼苗，為加倍成功的六倍體春石斛蘭，然后進行瓶苗移栽，按照常規春石斛蘭栽培管理。
全文摘要
本發明涉及一種春石斛蘭人工多倍體復合體的培育及種苗工廠化生產方法。在普通春石斛蘭開花期人工授粉取收獲的種子接種在1/2MS液體培養基中非共生萌發培養，將原胚期種子原球莖移入含有0.01％秋水仙堿的1/2MS液體培養基中誘變培養，后轉入1/2MS固體培養基培養，至春石斛蘭成苗，取染色體數目2n＝76的四倍體幼苗進行開花培養，以四倍體為母本，二倍體為父本或以二倍體為母本，四倍體為父本雜交獲得三倍體。三倍體雜交種子形成早期再移入含有0.01％秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行六倍體人工誘變處理150-180h后，轉入1/2MS固體培養基，直至成苗，選取染色體數目2n＝114的幼苗為六倍體春石斛蘭，進行瓶苗移栽，按常規方法栽培管理，直至開花。本發明為春石斛蘭新品種的推廣奠定了基礎。
文檔編號A01H4/00GK102239806SQ201110177879
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者李秀蘭, 陳力, 陳瑞陽 申請人:南開大學