專利名稱：編碼木脂素甲基化酶的基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有將甲基轉移至木脂素上的活性的酶的基因、利用該甲基化酶使木脂素組成改變的植物等。更加具體地說，本發明涉及具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因，優選來自芝麻的具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因及其利用。
背景技術：
胡麻屬芝麻(Sesamum indicum)，是屬于胡麻科(Pedaliaceae)的1年生草本植物。據說芝麻的原產地在中非，芝麻是大約有6000年歷史的最古老的栽培油料作物，并已在世界范圍內栽培。自古以來芝麻就是珍貴的食品，被認為是健康食品的代表。特別是芝麻種子、從芝麻種子中得到的油、芝麻種子的提取物均在被利用(例如參照《芝麻其科學和功能性》日語原名「-ι O科學i機能性」、并木滿夫編丸善planet公司(1998))。芝麻種子內含有的成分中約50%是脂質，約20%是蛋白質。芝麻中含有的脂質的主要成分是以油酸和亞油酸為主體的甘油三酯，并且芝麻中還含有維生素B1、B2、E等。除上述成分之外，芝麻中還含有被統稱為木脂素的植物的二次代謝物(例如芝麻素和芝麻林素等)，這些物質具有強抗氧化性(例如參照Biochemical Systematics and Ecology 13,133-139(1985))。關于木脂素的生物合成，例如在Lignans :biosynthes is and function, Comprehensive natural products chemistry,1 :640-713 (1999) ；Phytochemistry Rev. 2257-288(2003)等中有記載。例如在Phytochemistry Rev. 2257-288(2003)中，表示由松柏醇聚合合成的松脂醇是首次生物合成的木脂素，并且利用松脂醇，在各植物種內經過特有的生物合成途徑可合成多種木脂素。有報告指出有助于該松脂醇合成的dirigent protein存在于連翹等中(例如參照kience 275，362-366 (1997)等)。并且還報導了連翹的松脂醇-落葉松脂素還原酶基因(例如參照J.Biol. Chem.，271 :29473 (1996)、日本特表2001-507931號公報等)，Thuja plicata的松脂醇-落葉松脂素還原酶基因(例如參照J. Biol. Chem.， 274:618(1999)等)，以及閉聯異落葉松脂素脫氫酶及其使用方法(例如參照J.Biol. Chem. ,276(16) :12614-23(2001),日本特表 2002-512790 號公報等)。并且從 Larrea tridentata 中克隆到 Larreatricin 氫氧化酶基因(例如參照 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 100 :10641(2003)等)。關于芝麻木脂素的生物合成，一般認為是通過胡椒醇合成酶作用于松脂醇而合成胡椒醇，接著，通過芝麻素合成酶作用于此胡椒醇而合成芝麻素。但已證明，從芝麻中克隆到的細胞色素P450蛋白質CYP81Q1，單獨由松脂醇經過胡椒醇而合成芝麻素(國際公開公報 W02005/030944 ；參照圖 1)。近年來，不僅是木脂素，而且木脂素糖苷也正受到關注。已知上述木脂素分子中有幾種以糖苷的形式存在于植物中。例如，芝麻種子中存在芝麻素酚糖苷(sesaminol 2' _0_ β -D-Glucopyranoside ；sesaminol 2，_0_ β -D-glucopyranosyl(1-2) _0_ β -D-Gluc opyranoside ；及 sesaminol 2，-0_ β -D-glucopyranosyl (1-2) _0_ (- β -D-glucopyranosyl (1-6))-β-D-Glucopyranoside))；及松月旨醇糖苷(Pinoresinol 4，_0_β-D-glucopyranos yl (1-6)- β -D-Glucopyranoside ；Pinoresinol 4，_0_ β -D-glucopyranosyl(1-2)- β -D-G Iucopyranoside ；Pinoresinol 4，_0_ β -D-glucopyranosyl (1-6)_0_(β -D-glucopyranos yl (1-6)) β -D-Glucopyranoside ；及 Pinoresinoldi-O-β-D-Glucopyranoside))等。連S 中存在(+)-Pinoresinol-4，-O- β -D Glucoside 及(_)-羅漢松樹脂酚-4-0-Glucoside。 亞麻中存在Secoisolariciresinol DiGlucoside禾口Pinoresinol DiGlucoside等(例如參考「生藥學雜志」日語原名「生薬學雑誌」、第32卷、第194頁(1978) ；Tetrahedr on, 14 649(2003) ；Phytochemistry, 58 :587(2001)等)。芝麻中含有的松脂醇糖苷和芝麻素酚糖苷(例如參照Katsuzaki，H.等、Biosci. Biotech. Biochem. 56,2087-2088(1992)等)，因為在水溶性區域顯示強抗氧化性，所以期待其有與脂溶性抗氧化劑(例如生育酚)不同的應用。此外，對于木脂素糖苷主張其有如下所述作用機理，即、木脂素糖苷的具有抗氧化性的官能團酚羥基被自身具有的糖保護，但攝入體內后在腸內細菌具有的葡萄糖苷酶的作用下發生水解，生成作為葡糖苷配基部分的脂溶性木脂素。該葡糖苷配基在腸內吸收通過血液被運送到各臟器內，防止臟器生物膜等的氧化障礙。依據這種作用機理，期待將木脂素糖苷作為動脈硬化預防食品而應用(例如參照 Τ. O saw a :Anticarcinogenesis and radiation protection 2 :p. 327，Plenum Press，New Yo) 0作為木脂素糖苷以外的木脂素衍生物已知有甲基化木脂素。甲基化木脂素與木脂素糖苷相同，具有抗氧化性的官能團酚羥基受甲基保護，因此是具有甲氧基結構的木脂素。報導了呋喃駢呋喃類的芝麻木脂素中胡椒醇的4位羥基被甲基化的Kobusine及芝麻素酚的 2，位羥基被甲基化的 Sesangolin (參照 Pytochemistry 47，583-591 (1998)；及 J. O rg. Chem. 27，3232-3235 (1962))(圖1)。但還不明確催化這些合成反應的酶，并且到目前為止還沒有精制、分離使呋喃駢呋喃類木脂素甲基化的酶及編碼該酶的基因的報告。已知具有催化甲基轉移反應這種特定功能的蛋白質，在不同的植物種中其氨基酸序列類似(例如參照 Plant Cell 14, 505-519 (2002))
發明內容
通過改變植物的二次代謝物等的生物合成途徑，能夠進行有用物質的生成及/或有用植物的育種，將這種技術稱為代謝工程。如果利用這種技術，能夠大量生產任意的化合物及/或抑制不需要的物質的生產。因此，鑒于上述這些物質的有用性，使用與木脂素代謝途徑相關的基因，采用基因工程合成木脂素及其代謝物在工業上有用。但是，有關木脂素、 特別是與以芝麻木脂素為代表的呋喃駢呋喃類木脂素的生物合成相關的基因的知識，如上所述還很有限，并且仍未發現催化甲基化呋喃駢呋喃類木脂素生成的甲基化酶，更期望得到其基因。本發明鑒于上述狀況，提供如下所示的具有木脂素甲基轉移活性的酶、編碼該酶的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體·細胞·轉化體等。
(1)多核苷酸，其為下述(a) (d)中任一項所述的多核苷酸，(a)多核苷酸，其含有具有序列號1或3的堿基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼具有序列號2或4的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸；(c)多核苷酸，其為與具有序列號1或3的堿基序列的部分或全部互補堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下進行雜交，且編碼具有將甲基轉移至木脂素上的活性的蛋白質的多核苷酸；以及(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有在序列號2或4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列，且具有將甲基轉移至木脂素上的活性。(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其編碼蛋白質，所述蛋白質具有序列號2或4的氨基酸序列，或者具有在該氨基酸序列中添加、缺失1個或多個氨基酸及/或被其他氨基酸替換修飾的氨基酸序列，且具有將甲基轉移至木脂素上的活性。(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其與具有序列號1或3的堿基序列的部分或全部互補堿基序列的多核苷酸在高嚴格條件下進行雜交，且編碼具有將甲基轉移至木脂素上的活性的蛋白質。(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其與具有序列號1或3的堿基序列的部分或全部互補堿基序列的多核苷酸在hSSC、50°C的條件下進行雜交，且編碼具有將甲基轉移至木脂素上的活性的蛋白質。(5)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有具有序列號1或3的堿基序列的多核苷酸。(6)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有編碼具有序列號2或4的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸。(7)如上述(1) (6)中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。(8)如上述⑴ (7)中任一項所述的多核苷酸，其編碼對于呋喃駢呋喃類木脂素具有轉移甲基活性的蛋白質。(9)如上述(8)所述的多核苷酸，其編碼對于松脂醇及/或胡椒醇具有轉移甲基活性的蛋白質。(10)蛋白質，其是被上述(1) (9)中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。(11)載體，其含有上述⑴ (9)中任一項所述的多核苷酸。(12)宿主細胞，其為被上述(11)所述載體轉化的宿主細胞。(13)該蛋白質的制造方法，其特征在于，培養或繁殖權利要求12所述的宿主細胞，從該宿主細胞中提取具有將甲基轉移至木脂素上的活性的蛋白質。(14)植物體(例如，芝麻、連翹或亞麻)或具有與該植物體相同性質的該植物體的后代植物體、或這些植物體的組織，其中導入上述(1) (9)中任一項所述的多核苷酸。(15)方法，其使用上述(1) (9)中任一項所述的多核苷酸，將甲基轉移至木脂素上。(16)該植物體或具有與該植物體相同性質的該植物體的后代植物體，其中，將上述(1) (9)中任一項所述的多核苷酸導入植物體內，通過表達使產生的木脂素組成改變。(17)多核苷酸，其具有上述(1) (9)中所述的多核苷酸的片段或其互補序列。
如果利用本發明的多肽(木脂素甲基化酶)，產生的效果是例如能夠在生物(特別是植物)中人為地調節木脂素及甲基化木脂素的量。此外，通過使用這些重組酶使木脂素甲基化，可以改變體外和體內的物性(溶解度、動物的吸收效率等)。此外，通過利用本發明的多核苷酸，可人工生產目前為止自然界中未鑒定的甲基化木脂素。此外，利用本發明的多肽合成的甲基化木脂素，能夠作為新型生理功能物質的初始物質或中間體有效利用。通過使用基因重組技術使本發明的木脂素甲基化酶在所期望的生物內表達，可由松脂醇人工生產單甲基化松脂醇及/或由胡椒醇人工生產Kobusine。此外，通過使用基因重組技術使本發明的木脂素甲基化酶在所期望的生物內表達，能夠制造人為控制木脂素和甲基化木脂素的量的植物及/或微生物。在生產Kobusine或甲基化松脂醇的植物中，通過抑制本發明的木脂素甲基化酶的表達，能夠使葡糖苷配基游離，使木脂素(特別是胡椒醇及/或松脂醇)的量增加。如果使用本發明的木脂素甲基化酶，能夠由松脂醇人工生產新型甲基化木脂素單甲基化松脂醇。
圖1是芝麻木脂素的結構和代謝途徑圖。圖 2-2A 是通過 RT-PCR 的 SiOMTl 及 Si0MT2 在芝麻(S. indicum cv.真瀨金)不同器官的基因表達分析的結果圖。圖2-2B是通過RT-PCR的SrOMTl在芝麻(S. radiatum) 不同器官的基因表達分析的結果圖。圖3-3A是大腸桿菌內表達的SiOMTl和松脂醇的酶反應液在A280nm處的色譜圖。 圖3- 是大腸桿菌內表達的SiOMTl和胡椒醇的酶反應液在A280nm處的色譜圖。圖4-3C是大腸桿菌內表達的Si0MT2和松脂醇的酶反應液在A280nm處的色譜圖。 圖4-3D是大腸桿菌內表達的Si0MT2和胡椒醇的酶反應液在A280nm處的色譜圖。圖5-3E是大腸桿菌內表達的SrOMTl和松脂醇的酶反應液在A280nm處的色譜圖。 圖5-3F是大腸桿菌內表達的SrOMTl和胡椒醇的酶反應液在A280nm處的色譜圖。圖6-4A是由SiOMTl生成的甲基化松脂醇的LC-MS的色譜圖。圖7-4B是由SiOMTl生成的甲基化胡椒醇(Kobusine)的LC-MS的色譜圖。圖8是使用SiOMTl基因全長探針的Genomic Southern雜交的結果。圖9-6A是標準品咖啡酸在A280nm處的色譜圖。圖9-6B是大腸桿菌內表達的 SiOMTl和咖啡酸的酶反應液在A280nm處的色譜圖。圖9-6C是大腸桿菌內表達的SrOMTl 和松脂醇的酶反應液在A280nm處的色譜圖。圖10-6D是由SiOMTl生成的甲基化咖啡酸(阿魏酸)的LC-MS的色譜圖。
具體實施例方式本發明者發現了以木脂素特別是以松脂醇及/或胡椒醇為主要基質的新型甲基化酶，同時發現該甲基化酶可使松脂醇甲基化。到目前為止雖然已鑒定出二甲基化松脂醇桉脂素，但仍未發現單甲基化松脂醇。本發明者通過同源性檢索，從包括來自芝麻種子的5000個克隆體的EST數據庫中查找芝麻甲基化酶樣基因的部分序列，其結果得到2種甲基化酶樣基因(下述SiOMTl和Si0MT2)。這些SiOMT基因在種子內表達強烈。采用RACE法取得這些基因的全長堿基序列，使其在大腸桿菌內表達。使得到的重組蛋白質與芝麻素酚或松脂醇反應后，利用HPLC 分析、LC-MS分析、及T0F-MS/MS分析，測定酶活性。其結果證明SiOMTl具有催化使胡椒醇甲基化生成Kobusine的反應的活性。并且證明SiOMTl具有催化使松脂醇甲基化生成單甲基化松脂醇的反應的活性。認為該甲基化木脂素是松脂醇的衍生物桉脂素的中間體。通過 PCR從非洲芝麻ksamum radiatum中克隆SiOMTl的同源基因SrOMTl，確認SrOMTl具有與 SiOMTl同樣的甲基化活性。“木脂素”是具有C6-C3骨架的2分子phenylpropanoid化合物主要通過這些 8-8’位聚合(8-8’鍵)的化合物。一般認為木脂素對植物的生物體防御機構有用(參照 Phytochemistry Rev. 2，371—390(2,003))。作為代表性的木脂素，可以為芝麻中含有的(+)_芝麻素、(+)_芝麻素酚、(+)_芝麻林素、(+)_松脂醇、(+)_胡椒醇及(+)_芝麻素酚；連翹(Forsythia intermedia) 中含有的(+)_松脂醇、(-)_牛蒡子苷配基及(-)_羅漢松樹脂酚；甘肅瑞香(Daphne t angutica)中含有的(_)_松脂醇和(_)_落葉松脂素；亞麻(Linum usitatissimum)中含有的(+)_閉聯異落葉松脂素等。這些木脂素有多種分子結構(參照Wood Research 90， 27-110(2,003)等)。以(+)_松脂醇為代表的芝麻木脂素類被分類為在范圍最廣的植物種中已被鑒定的呋喃駢呋喃類木脂素。作為芝麻木脂素之一的芝麻素，具有多種生理活性作用，對膽固醇代謝、肝功能及免疫功能的改善有效(例如參照《芝麻其科學和功能性》日語原名「-'7 Ο科學i効能性」、并木滿夫編；丸善planet公司(1998))。從芝麻種子或芝麻粕中分離精制芝麻素的方法已經實用化(例如、日本特開2001-139579公報、日本特開平 10-7676號公報等)，以芝麻素為主要成分的具有促進乙醇分解作用的肝功能改善/增強劑已有市售(商品名「力寸$ >」(芝麻素)，總經銷三得利株式會社)。此外，有報告指出， 除芝麻素之外，其它木脂素(例如芝麻素酚、芝麻林素等)也具有生理活性(例如參照「日本農藝化學會志」日語原名「日本農蕓化學會誌」、76 :805-813(2002)) 0因此，木脂素或其衍生物作為具有各種生理活性的生理活性物質或其中間體有用。以下，對于本發明的編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸、被該多核苷酸編碼的蛋白質、及其利用進行詳細說明。(1)多核苷酸首先，本發明提供下述(a) (d)中任一項所述的多核苷酸。(a)多核苷酸，其含有具有序列號1或3的堿基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有序列號2或4的氨基酸序列；(c)多核苷酸，其為與具有序列號1或3的堿基序列的部分或全部互補堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下進行雜交，且編碼具有將甲基轉移至木脂素上的活性的蛋白質的多核苷酸；以及(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有在序列號2或4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列，且具有將甲基轉移至木脂素上的活性。在本發明書中，用語“多核苷酸”可與“基因”、“核酸”或“核酸分子”交換使用，是
7指核苷酸的聚合物。在本說明書中，用語“堿基序列”可與“核酸序列”或“核苷酸序列”交換使用，以脫氧核糖核苷酸(省略為A、G、C及T)的序列表示。本發明的多核苷酸可以RNA(例如mRNA)的形態、或DNA的形態(例如cDNA或基因組DNA)存在，DNA可以是雙鏈或單鏈，單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(正義鏈)，或者也可以是非編碼鏈(反義鏈)。在本說明書中，用語“寡核苷酸”是指數個 數十個核苷酸(例如2 60個)結合形成的寡核苷酸，可與“多核苷酸”交換使用。對于寡核苷酸，短的稱為二核苷酸(二聚體)、三核苷酸(三聚體)，長的用30mer或IOOmer這種發生聚合的核苷酸的數量表示。寡核苷酸可以作為更長的多核苷酸的片段而生成，也可以化學合成。在本說明書中，用語“部分多核苷酸”是指該多核苷酸的片段，例如是指至少 12nt (核苷酸)，優選約15nt，更優選至少約20nt，更進一步優選至少約30nt，最優選至少約 40nt長度的片段。“至少12nt長度的片段”，例如是指含有序列號1所示的堿基序列中的12 以上連續堿基的片段。參照本說明書可提供序列號1所示的堿基序列，所以同領域技術人員能夠容易地制作以序列號1為基礎的DNA片段。例如為了制作各種大小的片段可容易地使用限制內切酶切割或超聲波切割。或者可合成制作這種片段。適當的片段(寡核苷酸)， 可通過 Applied Biosystems Incorporated(ABI, 850 Lincoln Center Dr. ,Foster City, CA94404) 392 型 Synthesizer 等合成。本發明的多核苷酸，編碼具有木脂素甲基化活性的多肽。這種多核苷酸，典型的是含有具有序列號1或3的堿基序列的多核苷酸的多核苷酸，或含有編碼具有序列號2或4 的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。本發明的優選多核苷酸是具有序列號1或 3的堿基序列的多核苷酸、或編碼具有序列號2或4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。本發明的多核苷酸，只要其編碼的多肽具有木脂素甲基化活性，可以為在序列號1 或3的堿基序列中缺失、插入、替換及/或添加1個或多個(例如1 30個、1 20個、1 10個、1 數個(例如6個)1 5個、1 3個、1 2個等)堿基后的突變體。突變體可在編碼區或非編碼，或在這兩個區突變。編碼區的突變，可生成保守性或非保守性氨基酸的缺失、插入、替換或添加。本發明的多核苷酸，是編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸，包括與具有序列號1或3的堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸。nj ^ M Sambrook Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中記載的方法的公知方法進行雜交。通常情況下，溫度越高鹽濃度越低，嚴格度就越高(雜交越難)，能夠得到同源性更高的多核苷酸。適當的雜交溫度，因堿基序列、該堿基序列的長度的不同而不同，例如將由編碼6個氨基酸的18個堿基組成的DNA片段作為探針使用時，優選50°C以下的溫度。在本說明書中，用語“嚴格的雜交條件”是指，在雜交溶液(含有50%甲酰胺、 5XSSC(150mM NaCl、15m M 枸櫞酸三鈉)、50mM 磷酸鈉(pH7. 6)、5 XDenhardt 液、10%硫酸葡聚糖、及20 μ g/ml變性剪切鮭精子DNA)中，42 °C孵育一夜后，約65 °C時在0. IXSSC中洗凈過濾器。與多核苷酸的“一部分”雜交的多核苷酸，是指與參照多核苷酸的至少約15個核苷酸(nt)，更優選至少約20nt，更進一步優選至少約30nt，最優選至少約30 70nt進行雜交的多核苷酸(DNA或RNA的任一種)。
本發明提供具有與序列號1或3的堿基序列至少80%同一，更優選至少85%、 90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一的堿基序列的多核苷酸。對于任意特定的核酸分子，其是否與例如序列號1或3所示的堿基序列至少 80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、或99%同一，使用公知的計算機程序(例如 Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix(注冊商標)，Genetics Computer Group, University Research Park, 575S cience Drive, Madison, WI 53711))可以決定。Bestfit是利用Smith和Waterman的局部同源性算法(Algorithm)，發現2個序列間的最良好的同源區段(segment) (Advances in Applied Mathematics 2 :482 489 (1981))。使用Bestfit或任意的其他序列排列程序，決定特定的序列與本發明的參照序列例如是否95%同一時，用參照堿基序列的全長計算同一性百分率，并且設定參數允許參照序列的核苷酸總數的5%以下的同源性的空位。在特定實施方式中，參照(QUERY)序列(本發明的序列)和對象序列之間的同一性(也稱為全體序列排列)，使用以Brutlag等的算法(Comp. App. Biosci. 6 :237 245(1990))為基礎的FASTDB計算機程序決定。為了計算同一性百分率，DNA序列的 FASTDB 排列中優選使用的參數為Matrix = Unitary、k-tuple = 4、Mismatch Penalty =1、Joining Penalty = 30、Randomization Group Length = 0> Cutoff Score = 1> Gap Penalty = 5、Gap Size Penalty = 0. 05、Window Size = 500 或對象堿基序列的長度(更短一方)。此外，本發明包括上述多核苷酸的片段或具有其互補序列的寡核苷酸。即使在本發明的寡核苷酸不編碼木脂素甲基化多肽時，同領域技術人員應容易理解在制作本發明的多肽時，可將本發明的多核苷酸作為聚合酶鏈式反應(PCR)的引物使用。不編碼木脂素甲基化多肽的本發明的寡核苷酸的其他用途，可以為下述用途(l)cDNA文庫中的木脂素甲基化酶基因或其對立基因或剪切突變體的分離；(2)為了提供木脂素甲基化酶基因的正確的染色體位置，與分裂中期染色體Spread的原位雜交(例如“FISH”)(Verma等，Human Chromosomes :A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)中記載)；及C3)用于檢測特定組織的木脂素甲基化酶mRNA表達的Northern-blot分析。本發明的多核苷酸或寡核苷酸，可作為利用反義RNA作用原理的基因表達操作用的工具使用。利用反義RNA技術，可觀察到來自內源性基因的基因產物的減少。通過導入本發明的寡核苷酸，可使具有木脂素甲基化活性的多肽的含量降低，其結果能夠控制(增加或減少)植物中的甲基化木脂素含量或含量比。本發明的多核苷酸或寡核苷酸，可以包括非翻譯區(UTO)的序列、載體序列(包括表達載體序列)等序列。取得本發明的多核苷酸或寡核苷酸的方法，可以為將含有本發明的多核苷酸或寡核苷酸的DNA片段進行分離的各種公知的方法。例如制備與本發明的多核苷酸的堿基序列的一部分進行特異雜交的探針，篩選基因組DNA文庫或cDNA文庫，能夠取得本發明的多核苷酸或寡核苷酸。作為這種探針，只要是與本發明的多核苷酸的堿基序列或其互補序列中的至少一部分進行特異雜交的多核苷酸(寡核苷酸)即可。這種通過雜交選擇的多核苷酸，可以為天然的多核苷酸(例如來自胡麻科植物、 地衣類植物等植物的多核苷酸)，也可以為來自植物以外的多核苷酸。取得本發明的多核苷酸的其他方法，可以為使用PCR的方法。該PCR擴增方法的特征在于，包括例如利用本發明的多核苷酸的cDNA的5’側及/或3’側的序列(或其互補序列)制備引物的步驟、使用這些引物將基因組DNA (或cDNA)等作為模板進行PCR擴增的步驟。使用本發明的方法，能夠大量取得含有本發明的多核苷酸的DNA片段。作為取得本發明的多核苷酸的供給源，沒有特別限定，優選含有胡椒醇或松脂醇的生物材料。在本說明書中，用語“生物材料”是指生物學樣品(從生物體中得到的組織樣品或細胞樣品)。在下述實施例中雖然使用芝麻，但并不限于此。使用本發明的多核苷酸，能夠在轉化體或細胞中合成具有木脂素甲基化活性的多肽。使用本發明的多核苷酸，通過檢測雜交的多核苷酸，能夠容易地檢測出表達具有木脂素甲基化活性的多肽的生物。本發明的寡核苷酸，通過作為檢測編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的雜交探針或用于擴增該多核苷酸的引物利用，能夠容易地檢測出表達具有木脂素甲基化活性的多肽的生物或組織。并且，將上述寡核苷酸作為反義寡核苷酸使用，能夠抑制上述生物體或組織或細胞的具有木脂素甲基化活性的多肽的表達。(2)多肽本發明還提供被上述本發明的多核苷酸編碼的蛋白質(多肽)，這種多肽，典型的是具有序列號2或4的氨基酸序列的蛋白質。在本說明書中，用語“多肽”可與“肽”或“蛋白質”交換使用。此外，多肽的“片段” 是指該多肽的部分片段。且本發明的多肽可從天然供給源中分離，也可化學合成。本發明的多肽，包括天然精制產物、化學合成產物、以及從原核生物宿主或真核生物宿主(例如包括細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞)中通過重組技術產生的產物。依靠重組產生步驟中使用的宿主，可使本發明的多肽糖基化或非糖基化。并且，本發明的多肽在多種情況下，作為宿主介導過程的結果，可含有起始的突變蛋氨酸殘基。本發明還提供具有木脂素甲基化活性的多肽。在本說明書中，“木脂素甲基化活性”是指使木脂素甲基化的活性，即、將甲基轉移至木脂素上的活性。也就是說，本說明書中的“甲基化酶”和“甲基轉移酶”可交換使用。通過使作為甲基供給體的SAM和作為基質的木脂素與木脂素甲基化酶反應，將其反應生成物進行HPLC或LC-MS分析，能夠測定或確認 “木脂素甲基化活性”。一般的甲基化酶活性測定法如公知文獻所記載(公知文獻Toquin， V.，et al. (2003)Plant Mol. Biol. 52，495—509.，Gang，D. R.，et al. (2002)Plant Cell 14， 505-519.)。此外，本發明的多肽是具有序列號2或4的氨基酸序列的多肽的突變體，且包括具有木脂素甲基化活性的多肽。這種突變體包括具有在序列號2或4的氨基酸序列中，缺失、替換、插入及/或添加1個或多個(例如1 30、1 20、1 10、1 數個(6個)、1 3個、1 2個等)氨基酸(氨基酸殘基)后的氨基酸序列，且具有將甲基轉移至木脂素上的活性的蛋白質。“缺失、替換、插入及/或添加”包括逆轉、重復及類型替換(例如將親水性殘基替換為其他殘基，但通常不能將強親水性殘基替換為強疏水性殘基)。特別是，多肽中的“中性”氨基酸的替換，一般來說幾乎不影響該多肽的活性。可容易地改變多肽的氨基酸序列中的數個氨基酸，而不顯著影響該多肽的結構或
10功能，這在該領域是公知的。并且還知道不僅是人為地改變，天然蛋白質中也存在不會使該蛋白質的結構或功能顯著改變的突變體。同領域技術人員，使用公知技術，能夠容易地使多肽的氨基酸序列中1或多個氨基酸突變。例如，根據公知的定點誘變法，能夠使編碼多肽的多核苷酸的任意堿基突變。此外，設計與編碼多肽的多核苷酸的任意位點對應的引物，能夠制作缺失突變體或附加突變體。進而，使用本發明書中記載的方法，可容易地決定制作的突變體是否具有所期望的活性。優選的突變體具有保守性或非保守性氨基酸替換、缺失或添加。優選沉默替換、添加及缺失，特別優選保守性替換。這些不會改變本發明的多肽的活性。通常認為的代表性保守性替換是，脂肪族氨基酸Ala、Val, Leu、及Ile中的1個氨基酸替換為其他的氨基酸； 羥基殘基Ser和Thr的交換，酸性殘基Asp和Glu的交換、酰胺殘基Asn和Gln之間的替換、堿性殘基Lys和Arg的交換、以及芳香族殘基I^he、Tyr之間的替換。如上詳述，有關哪個氨基酸的突變可能是表達沉默型(即是否對功能有顯著有害效果)的進一步指導說明， 在Bowie,J. U.等"Deciphering the Message inProtein Sequences :Tolerance to Amino Acid Substitutions”，Science 247:1306-1310(1990)中有記載。如上所述，這種突變多肽并不限于利用公知的突變多肽的制作方法，具有人為地導入的突變的多肽，也可以為分離精制天然存在的多肽得到的突變多肽。本發明的多肽，可以為氨基酸形成肽鍵的多肽，但并不限于此，也可以為含有多肽以外的結構的復合多肽。在本說明書中使用時，“多肽以外的結構”可以為糖鏈、類異戊二烯(isoprenoid)基等，但未特定。本發明的多肽，也可以包括附加多肽。作為附加多肽，例如可以為His、Myc、Flag 等表位標記的多肽。本發明的多肽，可以為將編碼本發明的多肽的多核苷酸導入宿主細胞，使該多肽在細胞內表達的狀態，也可以從細胞、組織等中分離精制。本發明的多肽，可以如下所述重組生成，也可以化學合成(例如參照H oughten, R. A. , Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 82:5131-5135(1985)；美國專利第 4，631，211 號等)。本發明的多肽，能夠催化木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的甲基化反應。(3)本發明的多肽或多核苷酸的利用本發明還提供通過使用本發明的多肽或多核苷酸，控制(增加或減少)生物(優選植物)中的木脂素及甲基化木脂素的量的方法以及該經控制后的生物(優選植物)。(A)載體本發明提供用于生成具有木脂素甲基化活性的多肽時使用的載體。本發明的載體可以為體外翻譯時使用的載體，也可以為重組表達時使用的載體。本發明的載體，只要含有上述本發明的多核苷酸，沒有特別限定。例如可以為插入編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的cDNA的重組表達載體等。重組表達載體的制作方法可以為使用質粒、噬菌體、或黏粒等的方法，沒有特別限定。載體的具體種類沒有特別限定，可適當選擇在宿主細胞中可表達的載體。即根據宿主細胞的種類，為了使本發明的多核苷酸準確地表達而選擇適當的啟動子序列，可以將使其和本發明的多核苷酸整合到各種質粒等中得到的載體作為表達載體使用。
本發明的表達載體，依賴于應導入的宿主的種類，含有表達控制區(例如啟動子、 終止子及/或復制起點等)。細菌用表達載體的啟動子，可使用通常用的啟動子(例如trc 啟動子、tac啟動子、Iac啟動子等)，酵母用啟動子，例如可以為甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子、PH05啟動子等，絲狀菌用啟動子，例如可以為淀粉酶(Amylase)、trpC等。此外，動物細胞宿主用啟動子，可以為病毒性啟動子(例如SV40初期啟動子、SV40后期啟動子等)。植物體轉化使用的重組表達載體，只要是在該植物體內可使本發明的多核苷酸表達的載體， 沒有特別限定。作為這種載體，例如可以為具有在植物細胞內使多核苷酸進行結構表達的啟動子(例如花椰菜花葉病毒的35S啟動子)的載體，或者為具有通過外部刺激被誘導活化的啟動子的載體。可根據使用限制酶及/或連接酶等的通常方法進行表達載體的制備。利用表達載體的宿主的轉化也可根據通常的方法進行。將使用上述表達載體進行轉化的宿主進行培養、栽培或飼養后，根據通常用的方法(例如過濾、離心分離、細胞破碎、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法等)，可從培養物等中回收、精制目標蛋白質。表達載體，優選至少含有1個選擇性標記。作為這種標記，在真核生物細胞培養中可以為二氫葉酸還原酶基因或新霉素抗性基因，以及在E. coli及其他細菌培養中可以為四環素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因。使用上述選擇性標記物，能夠確認本發明的多核苷酸是否導入宿主細胞，并且確認在宿主細胞中是否準確表達。或者，將本發明的多肽作為融合多肽(例如與GFP的融合多肽)表達，可將GFP熒光作標記物使用。(B)轉化體或細胞本發明提供導入有編碼具有上述木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的轉化體或細胞。在本說明書中，用語“轉化體”不僅包括組織或器官，還包括生物個體。轉化體或細胞的制作方法(生產方法)沒有特別限定，例如可以為將上述重組載體導入宿主內進行轉化的方法。這里使用的宿主細胞，沒有特別限定，可優選使用以往公知的各種細胞。具體來說，例如可以為大腸桿菌(Escherichia coli)等細菌、酵母 (出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe)、線蟲 (Caenorhabditis elegans)、非洲爪蛙(Xenopus laevis)的卵母細胞等。上述宿主細胞的適當的培養基及條件在該領域是公知的。此外，對作為轉化的對象的生物沒有特別限定，可以為上述宿主細胞中例示的各種微生物、植物或動物。本發明的轉化體或細胞的特征在于，這些轉化體或細胞使天然具有的木脂素及/ 或甲基化木脂素的組成發生改變。本發明的轉化體或細胞，優選植物或其后代、或來自這些植物或其后代的組織，特別優選芝麻、連翹或亞麻。這種轉化體或細胞，通過使用本發明的控制甲基化木脂素含量的方法，能夠使產生木脂素的生物中的甲基化木脂素的含量增加或減少。本發明的轉化體，可以為植物轉化體。本實施方式的植物轉化體可通過下述方式取得，即將含有本發明的多核苷酸的重組載體導入被該多核苷酸編碼的多肽可表達的植物中。使用重組表達載體時，植物體轉化時使用的重組表達載體，只要是在該植物體內可使本發明的多核苷酸進行表達的載體，沒有特別限定。作為這種載體，例如可以為具有在植物細胞內可使多核苷酸進行結構表達的啟動子(例如、花椰菜花葉病毒的35S啟動子) 的載體，或具有通過外部刺激被誘導活化的啟動子的載體。本發明中作為轉化的對象的植物，是指植物體整體、植物器官(例如葉、花瓣、莖、 根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、柔軟組織、木質部、維管束、柵狀組織、海綿狀組織等)或植物培養細胞、或各種形態的植物細胞(例如懸浮培養細胞)、原生質體、葉子切片、愈傷組織等任何物質。轉化使用的植物，沒有特別限定，可以為屬于單子葉植物綱或雙子葉植物綱植物中的任何植物。向植物內導入基因時，使用同本領域技術人員公知的轉化方法(例如農桿菌法、 基因槍法、PEG法、電穿孔法等)。例如以農桿菌為介質的方法和直接向植物細胞內導入的方法是公知的。使用農桿菌法時，將構建的植物用表達載體導入適當的農桿菌(例如 Agrobacterium tumefaciens)內，根據葉盤法(內宮博文著、「植物基因操作手冊」日語原名「植物遺伝子操作7 二 Λ 7 >」(1990)27 31頁、講談社科學技術、東京)等，使該株感染無菌培養葉片，可得到轉化體。此外，可使用Nagel等的方法(Micribiol.Lett.、 67,325(1990)) 0該方法首先例如將表達載體導入農桿菌內，接著利用PlantMolecular Biology Manual (S. B. Gelvin 等、Academic Press Publishers)中所述的方法將轉化的農桿菌導入植物細胞或植物組織內。這里，“植物組織”包括培養植物細胞得到的愈傷組織。 使用農桿菌法進行轉化時，可使用雙元載體(binary vector) (pBI121或pPZP202等)。此外，作為將基因直接導入植物細胞或植物組織內的方法，已知有電穿孔法、 基因槍法。使用基因槍時，可直接使用植物體、植物器官、植物組織本身，也可制備成切片后使用，還可以制備原生質體使用。可將上述制備的試料用基因導入裝置(例如 PDS-1000 (BI0-RAD公司)等)處理。處理條件因植物或試料的不同而不同，但通常在壓力約450 2000psi、距離約4 12cm的條件下進行。已導入基因的細胞或植物組織，首先用潮霉素抗性等抗藥性選擇，接著利用通常方法使植物體再生。從轉化細胞到植物體的再生，可根據植物細胞的種類采用同領域技術人員公知的方法進行。將植物培養細胞作為宿主使用時，轉化是利用基因槍法、電穿孔法等將重組載體導入培養細胞內。轉化的結果得到的愈傷組織、芽、毛狀根等，可直接在細胞培養、組織培養或器官培養中使用，并且使用以往公知的植物組織培養法，通過投入適當濃度的植物激素 (生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素留醇等)等，能夠使其再生為植物體。可通過PCR法、Southern雜交法、Northern雜交法等來確認基因是否導入植物內。 例如從轉化植物中制備DNA，設計DNA特異性引物進行PCR。一旦取得本發明的多核苷酸整合到基因組內的轉化植物體，通過該植物體的有性生殖或無性生殖可得到其后代。此外，從該植物體或其后代、或從該植物體或其后代的克隆體中，例如得到種子、果實、切穗、塊莖、塊根、植株、愈傷組織、原生質體等，以這些為基礎能夠量產該植物體。因此，本發明包括可表達地導入本發明的多核苷酸的植物體，或具有與該植物體相同性質的該植物體的后代，或來自上述植物體或其后代的組織。對各種植物的轉化方法已有報導，作為本發明的轉化體植物，例如可以為芝麻、稻子、煙草、大麥、小麥、油菜籽、馬鈴薯、番茄、白楊、香蕉、有加利樹、甘薯、大豆、紫花苜蓿、羽扇豆、玉米、菜花、薔薇、菊花、康乃馨、金魚草、仙客來、蘭花、洋桔梗、洋水仙、大丁草、唐菖蒲、霞草、長壽花、百合、天竺葵屬植物、天竺葵、矮牽牛、藍翅草、郁金香、連翹、擬南芥、亞麻及百脈根等，但不限于這些。在優選實施方式中，可使用芝麻制作本發明的轉化體。芝麻的轉化體的制作方法， 例如可以為 T. Asamizu !Transformation of sesame plants using MAT vector system introduction of fatty acid desaturase genes. Sesame Newsletterl6 :22 25 (2002) 中記載的公知方法。使用如此得到的轉化芝麻，因為在該芝麻內生產甲基化木脂素，所以能夠用低成本且環境低負荷的生產工序生產甲基化木脂素(胡椒醇及/或松脂醇)。在其它優選實施方式中，本發明的轉化體可優選使用煙草。煙草和矮牽牛都是容易轉化的代表性植物，由單個除去細胞壁的細胞(原生質體)可再生單個植物個體。這種再生的單個植物個體與來自多細胞的單個個體不同，不會形成嵌合體狀，能夠高效制作轉化體。煙草轉化的優選方法可為葉盤法。這種方法操作容易，可從1枚葉切片上得到數個獨立的轉化體。轉化的方法例如在“新生物化學實驗指導3核酸的分離、分析和基因試驗法化學同人”日語原名『新生物化學実験O手引t 3核酸O分離 分析i遺伝子実験法化學同人」(1996年)中有記載。使用上述得到的轉化煙草，能夠用低成本且環境低負荷的生產工序生產木脂素甲
基化酶。在其他優選實施方式中，本發明的轉化體可優選使用稻子。使用轉化稻子，能夠用低成本且環境低負荷的生產工序在該稻子內生產木脂素甲基化酶。本發明的轉化體，只要是含有木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的生物，不論是什么生物種類，只要導入上述多核苷酸就可生產該甲基化木脂素。使用導入含有編碼本發明的多肽的多核苷酸的重組表達載體的轉化體，能夠催化植物等生物中內在的木脂素進行甲基化的反應，所以可用低成本且環境低負荷的生產工序大量制備甲基化木脂素。并且，本發明通過大量制備甲基化木脂素，能夠提供廉價的食品或工業制品。使用本發明的轉化體，能夠在低成本且環境低負荷的條件下提供催化木脂素甲基化反應的多肽。在一實施方式中，本發明涉及的細胞可以為各種細菌宿主。本實施方式涉及的細胞，可通過下述方式取得，即將含有本發明涉及的多核苷酸的重組載體導入被該多核苷酸編碼的多肽可表達的細胞中。同領域技術人員，根據本說明書中的記載容易理解如果導入含有編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的重組表達載體，就能夠對從細菌到高等植物的廣泛范圍的生物賦予木脂素甲基化能力。本發明的細胞，只要是含有木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的生物，不論是什么生物種類，只要導入上述多核苷酸就可生產該甲基化木脂素。使用導入含有編碼本發明的多肽的多核苷酸的重組表達載體的細胞，能夠催化該細胞內的木脂素甲基化反應，所以可用低成本且環境低負荷的生產工序大量制備甲基化木
14脂素。并且本發明通過大量制備甲基化木脂素，能夠提供廉價的食品或工業制品。使用本發明的細胞，能夠在低成本且環境低負荷的條件下提供催化木脂素甲基化反應的多肽。(C)多肽的生產方法本發明提供生產本發明的多肽的方法。使用本發明的多肽的生產方法，能夠在低成本且環境低負荷的條件下提供催化木脂素甲基化反應的多肽。此外，使用本發明的多肽的生產方法，可容易生產催化木脂素甲基化反應的多肽。本發明的多肽的生產方法，可使用含有編碼本發明的多肽的多核苷酸的載體。本發明的多肽的生產方法，優選將上述載體用于無細胞蛋白質合成體系。使用無細胞蛋白質合成體系時，可使用各種市售的試劑盒。優選本實施方式的多肽的生產方法包括孵育上述載體和無細胞蛋白質合成液的工序。本實施方式的多肽的生產方法，也可使用重組表達體系。使用重組表達體系時，可采用下述方法等，即將本發明的多核苷酸整合到重組表達載體內后，利用公知的方法可表達地導入宿主內，然后精制在宿主內翻譯得到的上述多肽的方法。重組表達載體，可以是質粒也可以不是質粒，只要能夠將目標多核苷酸導入宿主內即可。優選本實施方式的多肽的生產方法包括將上述載體導入宿主內的工序。宿主可使用原核生物或真核生物，作為原核生物宿主，例如可使用屬于 hcherichia屬的細菌(例如大腸桿菌(Escherichia coli)等)、例如屬于Bacillus屬的細菌(例如、Bacillussubtilis)等。作為真核生物宿主，可使用低等真核生物(例如酵母或絲狀菌等真核生物微生物)。作為酵母，可以為Saccharomyces屬微生物(例如Saccharomyces cerevisiae等)，作為絲狀菌，可以為Aspergillus屬微生物(例如 Aspergillus oryzae、Aspergillus niger 等)、Penicillium 屬微生物。此夕卜，動物細胞或植物細胞可作為宿主使用。作為動物細胞，可以為小鼠、大鼠、猴子、人體等的細胞。并且， 昆蟲細胞(例如蠶細胞、或蠶的成蟲)也可作為宿主使用。上述宿主細胞沒有特別限定，可優選使用以往公知的各種細胞。具體來說，例如可以為大腸桿菌(Escherichia coli)等細菌、酵母(出芽酵母&iccharomyces cerevisiae、 分罾 _ 母 Schizosaccharomyces pombe)、線蟲(Caenorhabditis elegans)、φ yjfl JTl M (Xenopus laevis)的卵母細胞等，沒有特別限定。對上述宿主細胞而言合適的培養基以及條件，為同領域內所公知。這樣在宿主內導入外源多核苷酸時，關于表達載體，優選以外源多核苷酸表達的方式整合在宿主內發揮功能的啟動子。精制重組產生的多肽的方法，因使用的宿主、多肽的性質的不同而不同，可利用標簽(tag)等比較容易地精制目標多肽。本實施方式涉及的多肽的生產方法，優選還包括從含有本發明的多肽的細胞或組織的提取液中精制該多肽的工序。精制多肽的工序，優選利用公知的方法(例如破壞細胞或組織后進行離心分離，回收可溶性組分的方法)，從細胞、組織中制備細胞提取液后，通過公知的方法(例如硫酸銨沉淀或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用色譜法、親和色譜法、羥基磷灰石色譜法、及凝集素層析法)從該細胞提取液中精制的工序，但并不限于此。最優選使用高效液相色譜法(HPLC)進行精制。本發明的多肽，可以從天然表達本發明的多肽的細胞或組織中精制該多肽，也可以通過化學合成制備。制作突變多肽的方法，沒有特別限定，例如可以通過使用下述方法，制作突變多肽。即位點專一誘變法(例如參照 Hashimoto-Gotoh，Gene 152，271-275 (1995))，利用 PCR 法在堿基序列中導入點突變制作突變多肽的方法，或通過插入轉座子制作突變株的方法等公知的制作突變多肽的方法。制作突變多肽時也可利用市售的試劑盒。因此，本發明的多肽的生產方法，只要至少根據具有木脂素甲基化活性的多肽的氨基酸序列、或編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的堿基序列，使用公知的常用技術即可。(D)甲基化木脂素生產方法到目前為止，木脂素及甲基化木脂素的生產是通過提取芝麻進行的，因此存在無法大量生產等問題，但是，根據本發明能夠低成本大量生產木脂素及甲基化木脂素。本發明提供用表達本發明的多肽的生物體或細胞來生產甲基化木脂素的方法。上述生物體可以是天然的未改變的生物體，也可以是使用重組表達體系的轉化體。本發明的甲基化木脂素生產方法，能夠高效生產木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)。在一實施方式中，本發明的甲基化木脂素生產方法的特征在于，使用用編碼本發明的多肽的多核苷酸轉化的生物體或其組織，生產甲基化木脂素。優選上述生物體是上述轉化體植物或細菌，特別優選大腸桿菌、芝麻、連翹或亞麻。本發明的甲基化木脂素生產方法，包括將編碼本發明的多肽的多核苷酸導入上述生物體內的工序。將多核苷酸導入上述生物體內的工序，使用上述各種基因導入方法即可。 本實施方式在該方面，上述生物體在轉化前產生的甲基化木脂素和轉化后產生的甲基化木脂素的組成不同。具體來說，從上述生物體中得到的木脂素和甲基化木脂素的含有率增力口。 本實施方式該方面涉及的甲基化木脂素生產方法，優選還包括從上述生物體中提取甲基化木脂素的工序。本發明的甲基化木脂素生產方法，包括將本發明的寡核苷酸作為反義寡核苷酸導入天然表達本發明的多肽的生物體內的工序。將寡核苷酸導入上述生物體內的工序，使用上述反義RNA技術即可。本實施方式涉及的甲基化木脂素生產方法，優選還包括下述工序， 即使用上述抗體或寡核苷酸來鑒定天然表達本發明的多肽的生物體的工序。本實施方式該方面涉及的甲基化木脂素生產方法，優選還包括從上述生物體中提取甲基化木脂素的工序。在本實施方式中，上述生物體在導入上述寡核苷酸之前產生的甲基化木脂素和導入后產生的甲基化木脂素的組成不同。具體來說，從上述生物體得到的木脂素及甲基化木脂素的含有率降低。(E)食品和工業制品本發明提供使用根據上述甲基化木脂素生產方法得到的甲基化木脂素制造的食品及工業制品。本項中記載的食品，可以是上述轉化植物體的種子、果實、切穗、塊莖及/或塊根，也可以是使用從上述轉化植物體中提取的甲基化木脂素制造的食品(例如芝麻、連翹或亞麻、或其加工食品)。本發明涉及的食品或工業制品，可含有期望量的木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)。例如，可以將從上述甲基化木脂素含量增加的本發明的轉化植物中提取的甲基化木脂素提取液，作為甲基化木脂素含量高的食品提供。此外，不僅限于提取的甲基化木脂素，還可以將上述轉化植物體的種子、果實、切穗、塊莖及/或塊根等作為含有大量甲基化木脂素的食品提供。使甲基化木脂素的組成改變的對象沒有特別限定，除植物之外，還可以將動物、細菌或酵母等所有生物作為對象。此外，根據木脂素及甲基木脂素的獨特的物性，本發明的多肽或多核苷酸，可作為工業制品(例如薄膜、生物降解性塑料、功能性纖維、潤滑油、或洗劑類工業制品)的原料使用。在本說明書中，雖然記載了芝麻的木脂素甲基化多肽的一個例子，但本發明并不限定于來自芝麻的多肽或多核苷酸，本發明涉及具有木脂素甲基化活性的全部多肽及其應用，這一點為同領域技術人員所知曉。木脂素甲基化酶可以來自植物、動物或微生物中的任何生物，只要具有木脂素甲基化酶活性就能夠控制木脂素的量。并且，本發明還涉及通過導入編碼木脂素甲基化酶的多核苷酸而制作的木脂素的量得到調節的植物、其后代或它們的組織，其形態可以為切花。使用本發明的木脂素甲基化多肽，能夠促進或抑制甲基化木脂素的生成。此外，使用通常方法，將上述多核苷酸導入植物內，使該多核苷酸結構或組織特異性表達，使目標多肽的表達增加，以及通過使用反義法、共抑制法及RNAi法等，能夠抑制目標多肽的表達，易為同領域技術人員所理解。
實施例本發明根據以下的實施例進一步詳細說明，但并不限于此。實施例中使用的分子生物學的方法，只要沒有另外詳述，均根據國際公開 W02004/018682 號公報(PCT/JP03/10500)或 Molecular Cloning (Sambrook 等、Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989)中i己載白勺方法。實施例1 芝麻種子的EST分析按照制造商推薦的方法，使用Rapid Excision試劑盒(Mratagene公司)，將公知文獻(國際公開公報W02005/030944)中記載的來自芝麻的cDNA噬菌體文庫剪切連接到 pBK-CMV噬菌粒(Mratagene社)上，使感染大腸桿菌。從含有來自該芝麻種子的EST的大腸桿菌菌落中隨機選擇5000克隆體，使用M13RV引物(序列號5)和M4(_20)引物(序列號6)，在下述條件下進行菌落PCR。在含有IXEx-Taq buffer (TakaRa) ,0. 2mM dNTPs、引物各 0. 2pmol/μ 1、Ex-Taq polymerase 1. 25U的混合液中懸浮大腸桿菌菌落，94°C反應5分鐘后，使94°C 1分鐘， 550C 1分鐘，72°C 2分鐘的反應進行30個循環，PCR擴增后，72°C保持7分鐘。5 :M13RV 5' —caggaaacagcattgac6 :M4-20 5' -gtaaaacgacggccagt將這些PCR產物供給瓊脂糖凝膠電泳，通過溴化乙錠染色，確認pBK-CMV中含有的EST被特異性擴增。將這5000種PCR產物4 μ 1禾口 IOunit的ExonucleaseI (USB公司) 和 2unit 的 Shrimp Alkaline phosphatase (USB 公司)混合，37°C保持 30 分鐘，80°C保持 20分鐘結束酶反應。使用該酶反應液1 μ 1，在下述條件下進行直接測序反應。測序反應液含有Bl反應液 1 U l、5x BigDyeSequencingBuffer ver. 3. 1 (Applied Biosystems) 3 μ 1、 BigDyeSequencing RRver. 3. !(Applied Biosystems) 2 μ 1U. 6p mol/μ 1M13RV 弓L 1 μ 1、
17滅菌水13 μ 1。測序反應是在96°C反應1分鐘后，使96°C 10秒、50°C 5秒、60°C 4分鐘的反應進行25個循環。測序反應液利用DyeEx96 (QIAGEN公司)，根據制造商推薦的方法生成， 使用 Sequen cer model 3100 (Applied Biosystems 公司)決定堿基序列。得到的5000種堿基序列用Blastx進行同源檢索，從其中鑒定出與甲基化酶基因具有同源性的2種芝麻甲基化酶(Sesamum indicum O-methyltransferase ；以下略為 SiOMT)的部分序列。Blastx分析的條件如下所述，程序Blastx ver. 2. 2. 9，數據庫 nr,遺傳密碼standard (1),過濾器:L0ff complexity> Expect :10, Word size :3, Matrix BLOSUM 62, Gap Costs !Existence 11, Extension 1。實施例2 芝麻甲基化酶基因的表達分析為了分析通過EST分析得到的二種SiOMTl和Si0MT2基因表達模式，對于公知文獻(國際公開公報W02005/030944)記載的芝麻的不同器官的cDNA，在以下條件下進行 RT-PCR。PCR 反應液含有 cDNA 1 μ UlXEx-Taq buffer(TakaRa) ,0. 2mM dNTPs、引物各 0. 2pmol/y 1,Ex-Taq polymerase 1. 25U。94°C反應 5 分鐘后，使 94°C 1 分鐘、55°C 1 分鐘、 72°C 2分鐘的反應進行32個循環，PCR擴增后，72°C保持5分鐘。作為SiOMTl及Si0MT2 特異性引物，使用SiOMTl-FW(序列號7)和SiOMTl-RV (序列號8)以及Si0MT2_FW(序列號 9)和Si0MT2-RV(序列號10)。為了比較SiOMT基因的表達量和內源性基因的表達量，同時進行作為內部標準的基因的PCR反應。具體來說，使用SilSSrRNA-F引物(序列號11)和 Sil8SrRNA-R引物(序列號12)，進行芝麻的18S ribosomal RNA基因(登錄號AF169853) 的PCR反應。序列號 7 :Si0MTl_FW :5 '-ttgccccatgtcattcaagatj^^lj-^· 8 :Si0MTl-RV 5 ‘-aaaattcagacttataacgataccaaa序歹Ij號 9 :Si0MT2_FW :5 ‘-ttagaaaaactcaattcgtctaat序列號 10 :Si0MT2_RV :5 '-cctacatccacgacggaatccaaa序列號 11 :Sil8SrRNA-FW 5' -tatgcttgtctcaaagattaa；！5歹Ij號 12 :Sil8SrRNA-RV 5' -aacatctaagggcatcacaga將PCR產物進行電泳，進行溴化乙錠染色的結果，確認兩SiOMT基因(SiOMTl和 Si0MT2)均在種子內強烈表達(圖2-2A)。即可確認兩SiOMT基因表達區域和甲基化木脂素的蓄積區域一致。實施例3 芝麻甲基化酶基因的克隆因為兩EST克隆未含推定ORF的5’區域，所以使用5’ RapidAmplification of cDNA End(以下稱5’ RACE)法，擴增各SiOMT基因的5’區域。具體來說，根據制造商推薦的方法使用Gene Racer kit Qnvitrogen公司)，用以下引物(序列號13 16)，擴增各5’ 區域。序歹丨J號 13 GR-SiOMTI-RV :5，-ccggcccactgttcgggtcctaacgggaaa；^歹Ij號 14 SiOMTI-NEST-RV 5' -gcaaatccacttcataaaaat序歹丨J號 15 :GR-Si0MT2-RV :5，-cctcgggttccgctctttctgctcccagaa序列號 16 :Si0MT2-NEST-RV :5，-atcaatttgggaaattacaaa對于Si0MT2，因為EST克隆未含推定ORF的3’末端，所以使用序列號17和18的引物進行3，RACE。序列號 17 :GR-SiOMT2-FW 5' -gaagatcgccccatgagcatgaaacccttt序歹丨J號 18 :SiOMT2-NEST-FW :5，-aacgtcgttctgggagcagaaaga由RACE法得到的擴增片段的堿基序列通過引物步移法決定，得到包括SiOMTl和 Si0MT2基因的全長開放閱讀框的堿基序列信息(序列號1和序列號19)。SiOMTl和Si0MT2相互在氨基酸序列中顯示的序列同一性，對于序列同一性， 采用默認值(default)設定，使用 Clustal W alignment 程序(Mac Vector ver. 7. 2. 2 (Sy manteccorporation))。通過Blastx分析得到的SiOMT基因的全長cDNA序列(h ttp://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，檢索具有同源性的已知蛋白質。Blastx分析的條件如下所述。程序Blastxver. 2. 2. 9，數據庫nr，遺傳密碼standard(l)，過濾器L0W complexity, Expect :10, Word size :3, Matrix :BL0SUM62, GapCosts :Existence 11, Extension 1。Blastx 分析結果 Il 示,SiOMTl 與 Catharanthsus roseus Caffeic acid-O-methyltransferase (COMT) (AAK20170)有 74 % 序列同一性，SiOMT2 與 Rosa hybrida (AAM23004)的 Orcinol-O-methyltransferase (00ΜΤ)有 57 % 的序列同一'性。由此可見，兩SiOMT與已知甲基化酶之間的序列同一性都不算高。因此，不能推定得到的兩 SiOMT基因的功能。即得到的兩SiOMT基因就是到目前為止仍未分離的木脂素甲基化酶的可能性非吊尚。實施例4 大腸桿菌表達載體的構建對于SiOMTl，使用序列號20和21的引物對，將在cDNA的起始蛋氨酸密碼子(ATG) 的上游具有BglII位點、在終止密碼子的下游具有MlI位點的片段，進行PCR擴增。另一方面，對于Si0MT2，使用序列號22和23的引物對，將在cDNA的起始蛋氨酸密碼子(ATG)的上游具有BamHI位點、在終止密碼子的下游具有B10I位點的片段進行PCR擴增。PCR使用的引物如下所示。j^^lJ^j 20 :Bgl2-Si0MTI-Fff 5' —aaaacatgtatggcggatcagtccgaggaagaagaggcttt序列號 21 SalI-SiOMTl-RV :5，-attgtcgacttatgaaattccatgatccaaatattj^^lJ^j 22 :BamHI-SiOMT2-Fff 5' —aaaggatccatggcgatggttaaccaaaagcaaaatctt23 :XhoI-Si0MT2-RV 5' —aaactcgagttaaggatatatctcgatgatagatctcaaPCR反應液(25μ1)含有作為模板的芝麻種子cDNA、各引物0. 2p mol/μ U 1XK0D plus buffer (TOYOBO) ,0. 2m MdNTPsUmM MgSO4UU KOD plus polymerase 94°C 反應5分鐘后，使94°C 1分鐘、55°C 1分鐘、72 °C 2分鐘的反應進行30個循環，PCR擴增后， 72°C保持3分鐘。將得到的各PCR產物，根據制造商推薦的方法，插入pCR4 Blunt-TOPO vector (Invitrogen)的多克隆位點，得到 SiOMTl/pCR 4B lunt-ΤΟΡΟ(稱為 pSPB 2678)、 SiOM T2/pCR4 Blunt-ΤΟΡΟ (稱為 pSPB 2679)。分析pSPB^78和pSPB^79中含有的SiOMT堿基序列，確認是否進行了正確的 PCR0將這些質粒在附加在PCR引物上的限制酶位點消化，得到全長SiOMT，將含有該SiOMT 的約1. Ikb的DNA片段插入大腸桿菌表達載體PQE30載體OiIAGEN)的BamHI/MlI位點，得到 Si0MTl/pQE30 (稱為 pSPB2690)、Si0MT2/pQE30 (稱為 pSPB2686)。實施例5 重組蛋白質的制備使用上述制作的大腸桿菌表達載體pSPB^90和PSPB2686，轉化大腸桿菌菌株 JM109(T0Y0B0)，在含有最終濃度為20μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養基中于37°C前培養一夜。將一部分前培養液添加到含有氨芐青霉素50 μ g/ml、酸水解酪素0. 5%的M9培養基 (IOml)中，振蕩培養直到A6tltl = 0. 6 1. 0。接著，在培養液中加入最終濃度為0. 5mM的IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside)，進一步在 30°C振蕩培養一夜后，3000rpm、4°C 離心分離10分鐘，集菌。將菌體懸浮在IOml的緩沖液(30mM Tris-HCl (pH7. 5)、2mM MgCl2, 0. 5mM EDTA,50yM APSMF)中，然后進行超聲波處理，破碎大腸桿菌，接著15，000rpm、4°C離心分離10分鐘，將得到的上清液作為粗酶液用于以下活性測定。實施例6 芝麻木脂素甲基化酶的生成物的分析將酶反應的底物使用的芝麻木脂素溶解于少量的DMSO中，然后再溶解于 70%乙醇中，制備底物溶液(lmg/ml)。芝麻木脂素例如可根據公知的方法(日本農藝化學會志67 :1693(1993))(日語原名日本農蕓化學會誌)，從芝麻中提取和精制得到。將底物溶液10 μ 1、在大腸桿菌中表達的SiOMT的上述粗酶液200 μ 1及IOmM S-Adenosyl-L-Mathianine (SAM) 10 μ 1在反應試管中混合，然后使其在30°C反應2小時。在反應試管內添加含有0. 三氟乙酸(TFA)的100%乙腈Q50 μ 1)，結束酶反應。用旋渦混合器(Vortex Mixer)劇烈攪拌反應試管，然后15，000rpm、4°C離心分離5分鐘，將得到的上清液用過濾器(孔徑0. 45mm,4mm Millex-LH.Millipore)洗凈，然后使用高效液相色譜法(以下稱為HPLC)分析該上清液。木脂素及其甲基化木脂素的分析條件如下所示。使用C-30柱(野村化學C30-UG-5、4. 6mm X 150mm)，進行液相色譜法 (Lc-2010c (島津制作所))。流動相中，A液使用0. 1%1 八，8液使用含有0. 1%TFA的90% 乙腈。使用A液80% :B液20%的混合液平衡柱子(20分鐘)后，使用直線濃度梯度(A液 80% :B液20%—A液10% ；B液90% )，洗脫20分鐘(流速0. 6m 1/分)，進一步使用A 液10% =B液90%洗脫7分鐘。測定^Onm處的吸收，檢測樣品中含有的化合物。對于化合物的各吸收峰，使用SPD-10AV (島津制作所)測定其在190nm 400nm處的光譜，分析具有木脂素的2個特征最大吸收峰O30nm和^Onm)的物質。在該條件下，在約11. 8分鐘檢測出松脂醇標準品，在約15. 5分鐘檢測出胡椒醇標準品，在約16. 8分鐘檢測出芝麻素酚標準品。在SiOMTl重組蛋白質和松脂醇的反應液中，新得到具有木脂素光譜的保留時間為14. 0分鐘的吸收峰A(圖3-3A)。此外，在SiOMTl重組蛋白質和胡椒醇的反應液中，新得到具有木脂素光譜的保留時間約為17. 7分鐘的吸收峰B (圖3-3B)。在Si0MT2重組蛋白質和松脂醇或胡椒醇的反應液中，沒有發現新的生成物(圖 4-3C 3D)。并且發現，SiOMTl和Si0MT2對芝麻素酚沒有木脂素甲基化活性。接著，利用LC-MS分析，決定由SiOMTl生成的新型木脂素的分子量(液相色譜法 (LC) =Waters 2795 (Waters 公司)，質量分析器QUATRO micro (Micro 公司))。用 50%丙酮5ml洗凈填充有Iml DIAION HP-20樹脂(三菱化學)的色譜柱，然后用IOml水平衡。將含有由SiOMTl生成的甲基化木脂素的酶反應液裝入色譜柱，用5ml水洗凈雜質，然后使用80%丙酮2ml進行洗脫。使用蒸發儀將洗脫液干燥固化后，再溶解于含甲酸的90%乙腈(ΙΟΟμΙ)中，作為LC-MS分析樣品。LC條件如下所示。使用Develosil C30-UG-3柱(野村化學3. 0X 150mm)，對于流動相，A液使用水， B液使用100%乙腈，C液使用1 %甲酸，D液使用100m M乙酸銨水溶液。使用10分鐘的直線濃度梯度(A液60% :B液30% :C液5% :D液A液10% :B液80% :C液5% =D 液5%)洗脫，然后使用A液10% :B液80% :C液5% :D液5%，洗脫5分鐘(流速通常 O.aiil/分)。作為銨加合離子檢測信號。在這種條件下，約8. 3分鐘檢測出吸收峰A，約11. 3分鐘檢測出吸收峰B (圖3 5)。使用離子模型(ion mode)ES+,Cone voltagel5V,Collision 2eV 的 MS 條件，在 100 800(m/z，30分)的范圍進行MS掃描，在210 400nm(30分)的范圍測定PDA。上述條件下的LC-MS分析結果是，吸收峰A的銨加合離子分子量373 (m/z)，吸收峰 B的銨加合離子分子量371 (m/z)。(圖6-4A、圖7-4B)。因此，鑒定這些吸收峰分別是松脂醇(銨加合離子分子量359)的單甲基化物，及胡椒醇(銨加合離子分子量374)的單甲基化物。以上結果證明，SiOMTl是對芝麻木脂素松脂醇及胡椒醇具有單甲基化活性的酶。實施例7 芝麻木脂素甲基化酶同源基因的分離為了證明在芝麻種間是否功能性及結構性地保存有具有木脂素甲基化活性的酶基因，嘗試從與栽培芝麻品種Sesamum indicum在細胞遺傳學上不同的非洲芝麻(Sesamum radiatum)中，分離 SiOMTl 的 Counterpart gene (SrOMTl)。S. radiatum是非洲現存的芝麻植物，根據細胞遺傳學分析，確定染色體數為2n = 64，是與栽培芝麻品種S. indicum (2n = 26)在遺傳學上不同的系統(參考文獻、并木滿夫、小林貞作“芝麻的科學”朝倉書店)(日語原名『7 O科學」)。但是，已知S. radiatum種子中也蓄積有多種木脂素(參考文獻、Bedigian, D.等、Biochemical Systematics and Ecology 13:133-139(1985))。 因此，期望S. radiatum的基因組中含有與S. indicum的SiOMTl相對應的基因。使用S. radiatum 種子的 cDNA，使用 Bgl2_Si0MTl_FW(序列號 20 及) &ilI-Si0MTl-RV(序列號21)的引物對，通過PCR嘗試SrOMTl的擴增。PCR 反應液含有S. radiatum 種子的 cDNAl μ IUXEx-Taq buffer (TakaRa)、0· 2m MdNTPs、引物各 0· 2p mol/μ 1、Ex-Taq polymerase 1. 25U。94°C反應 5 分鐘后，使 94°C 1 分鐘、55°C 1分鐘、72°C 2分鐘的反應進行30個循環，PCR擴增后，72°C保持5分鐘。根據制造商推薦的方法，將得到的約1. Ik b的PCR產物插入pCR2-T0P0 vector Qnvitrogen公司)的多克隆位點內，得到SrSi0MTl/pCR2-T0P0(pSPB^10)。根據引物步移法，決定pSPB^lO中含有的SrOMTl的堿基序列(及氨基酸序列)(序列號3和4)。SrOMTl與SiOMTl在氨基酸序列中有89%的序列同一性。對于序列同一性，設定默認值(default)，使用Clustal W alignment程序(Mac Vector ver. 7. 2· 2 (Symanteccorporation))。這種高序列同一性強有力地支持 SrOMTl 是 SiOMTl 白勺 Counterpart gene。采用與實施例2同樣的方法進行RT-PCR，確認SrOMTl的種子特異性基因表達(圖 2-2B)。
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與實施例4相同，構建SrOMTl的大腸桿菌表達載體Sr0MTl/pQE30 (pSPB2911)，與實施例5同樣制備重組蛋白質，與實施例6同樣對其活性及生成物進行分析。SrOMTl與SiOMTl相同，對松脂醇和胡椒醇顯示甲基化活性(圖5)。此外，SiOMTl 對芝麻素酚不顯示甲基化活性。上述結果表明，SrOMTl是SiOMTl的Counterpart gene，本酶基因保留在芝麻種間。實施例8 =SiOMTl的基因組Southern分析為了搞清楚芝麻基因組內的SiOMTl基因的拷貝數，實施基因組Southern分析。根據制造商推薦的方法，使用Nucleon Phytopure for Plant Extraction Kit (Amersham^ 司)，從S. indicum(真瀨金品種)的葉子中提取出基因組DNA。將提取的基因組DNA20 μ g 用EC0RI、HindIII，)(h0I或^CbaI消化后，通過使用瓊脂糖凝膠的電泳進行分離。使用0. 25M HCl使該瓊脂糖凝膠水解15分鐘后，使用1. 5M NaCl/0. 5M NaOH溶液使其變性(30分鐘)， 通過添加含1. 5M NaCl的Tris-HCl (pH7. 5)在變性溶液中進行中和QO分鐘)。接著，將瓊脂糖凝膠內的基因組DNA在20XSSC溶液中轉印到膜上(Hybribond-N、Amersham公司)。 通過UV照射使轉印到膜上的基因組DNA與膜結合，使用含有7% SDS、50%甲酰胺、5XSSC、 2%封閉試劑、0. 十二烷基肌氨鈉、50m M磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)的雜交緩沖液(高SDS 緩沖液羅氏公司)，在42°C下進行1小時預雜交。將pSPB^78作為模板，分別使用序列號20 (Bg 12-SiOMTl-Fff)及序列號 21 (SalI-SiOMTl-RV)的引物對，通過PCR制作DIG標記的雜交探針。PCR反應液含有 PSPB2678 質粒 lng、lX PCR 緩沖液(TaKaRa 生物公司)、2. 5mM DIG-dNTP mixture (PCR DIG labeling Mix、羅氏公司)、各引物對 0. 2pmol、IUrTaq polymerase (TaKaRa 生物公司)。 PCR反應是95 °C 30秒、53°C 30秒、72°C 2分鐘的反應進行30個循環。將用kphadex G-50 柱-FindBoehringer公司)精制的PCR產物作為雜交探針使用。使該探針進行熱變性后， 在預雜交液中添加15 μ 1，42 °C孵育一夜。雜交之后，通過高嚴格度的條件(使用含有0. 2XSSC和0. 1 % SDS的溶液，65°C 30 分鐘進行2次)洗凈膜。根據制造商的說明書，使用DIG標記&檢測試劑盒(羅氏公司)， 檢測雜交信號。Southern分析的結果顯示，因為在任何限制酶消化的組分中都檢測出2條以上的條帶，所以與SiOMTl同源性極高的基因至少有1個以上在芝麻基因組內被編碼(圖8)。進一步說，期望在芝麻基因組中存在多個與SiOMTl功能性重復或類似的酶基因。實施例9 芝麻木脂素甲基化酶的COMT活性測定如實施例3所示，通過數據庫檢索，顯示SiOMTl和SrOMTl在已知的蛋白質中與 COMT具有最高序列同一性。這表明芝麻甲基化酶也具有COMT活性。討論在實施例5和實施例7中表達的SiOMTl和SrOMTl對咖啡酸的甲基化活性。 將0. 4m g/m 1咖啡酸10 μ 1、大腸桿菌內表達的SiOMT的粗酶液200 μ 1及IOmM SAM 10 μ 1 在反應試管內混合后，30°C反應1小時，然后采用與實施例6同樣的方法供給HPLC分析。其結果，SiOMTl和SrOMTl均在與咖啡酸的反應液中，生成與標準品阿魏酸的保留時間一致的吸收峰C (保留時間約7. 3分鐘(圖9-6A 6C))。在本HPLC分析條件下，咖啡酸在保留時間約為3. 9分鐘時被洗脫。在與實施例6同樣的條件下，進行LC-MS分析，結果發現吸收峰C為銨加合離子分子量195 (m/z)(圖10-6D)。因此，確認吸收峰C是咖啡酸單(銨加合離子分子量181 (m/z)) 甲基化生成的阿魏酸。因此證明兩種木脂素甲基化酶均具有COMT活性。如上所述，本發明的多肽和多核苷酸對甲基化木脂素的生產有用。此外，可表達地導入了本發明的多核苷酸的轉化體或細胞，在食品領域、各種工業領域中，對生產甲基化木脂素或使用甲基化木脂素的制品極為有用。上述轉化體是植物體的情況下，能夠將植物體自身作為食品使用，所以在農業領域等非常有用。通過將本發明的多肽和多核苷酸與本發明者發現的其他酶(合成胡椒醇和芝麻素的酶SiP189)組合，不僅是芝麻，而且可確立特定的木脂素分子種的生產體系，其結果能夠擴大特定木脂素及甲基化木脂素的生產量。因此，本發明可在農業、食品產業、醫藥品產業及其相關產業廣泛利用。
權利要求
1.下述(a)或(b)所述的多核苷酸，(a)由序列號3的堿基序列組成的多核苷酸；(b)編碼由序列號4的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其為DNA。
3.如權利要求1或2所述的多核苷酸，其編碼具有將甲基轉移至松脂醇及/或胡椒醇上的活性的蛋白質。
4.被所述權利要求1 3中任一頂所述的多核苷酸編碼的蛋白質。
5.含有所述權利要求1 3中任一項所述的多核苷酸的載體。
6.被權利要求5所述的載體轉化的宿主細胞。
7.具有將甲基轉移至松脂醇及/或胡椒醇上的活性的蛋白質的制造方法，其特征在于，培養或繁殖權利要求6所述的宿主細胞，從該宿主細胞中提取該蛋白質。
8.使用權利要求1 3中任一項所述的多核苷酸，將甲基轉移至松脂醇及/或胡椒醇上的方法。
9.制造木脂素組成改變的植物體的方法，所述方法是將權利要求1 3中任一項所述的多核苷酸導入植物體內，通過表達使產生的木脂素組成改變。
全文摘要
本發明涉及具有將甲基轉移至木脂素上的活性的酶的基因、利用該甲基化酶使木脂素組成改變的植物等。更加具體地說，本發明涉及具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因，優選來自芝麻的具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因及其利用。
文檔編號A01H5/00GK102304535SQ20111015775
公開日2012年1月4日 申請日期2007年3月27日 優先權日2006年3月29日
發明者小埜榮一郎 申請人:三得利控股株式會社