一種與植物抗逆性相關的基因及其應用的制作方法

專利名稱：一種與植物抗逆性相關的基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，尤其是一種與植物抗逆性相關的基因及其應用。
背景技術：
大豆原產我國，豆科大豆屬一年生草本植物，是世界上廣泛栽培的重要的糧食和油料作物，干旱、鹽堿等環境脅迫對大豆的生長發育具有重要影響，嚴重時會造成大豆大規模減產。解析大豆抵抗逆境的分子機制，培育耐逆性強的大豆品種是目前大豆育種的主要目標之一。目前，應用基因工程育種已經成為增強作物耐逆性的重要手段。高等植物在應答環境脅迫時啟動了多種應答網絡，目前已成為提高大豆產量及保證農業可持續發展的重要途徑之一。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種與植物抗逆性相關的基因及其應用。為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案如下。一種與植物抗逆性相關的基因，其具有序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。含有上述基因的重組表達載體，所用空載體為pEGAD。將目的基因插入到pEGAD的限制性內切酶Kpn I和BamH I酶切識別位點之間，得
到重組表達載體。上述基因在培育高抗逆轉基因植物中的應用。首先構建含有SEQ ID NO :1所示基因的重組表達載體，然后利用所得重組表達載體構建轉化體，再利用轉化體轉化目的植物，篩選陽性植株，得到與正常植物相比具有高抗逆性的轉基因植物。所述目的植物為大豆。采用上述技術方案所產生的有益效果在于發明人通過大量科學研究證明本發明的基因對植物的多種脅迫條件具有應答性，證明其與植物的抗逆性具有緊密聯系，利用現有常規基因工程方法將本發明的基因導入到植物體內，能夠得到具有高抗逆性的轉基因植物，對提高作物的產量具有重大意義。


圖1為大豆中GALl基因在受ABA，NaCl脅迫下表達模式。圖2為pCAMBIA3301-PeAU:⑶S的在鹽、ABA脅迫下的⑶S染色結果；l，Ck ；2,150mM NaCl,3,100 μ M ΑΒΑ。
具體實施例方式以下實施例詳細說明了本發明。本發明所使用的各種原料及各項設備均為常規市售產品，均能夠通過市場購買直接獲得。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，
3結果取平均值。本發明的基因來源于大豆屬大豆，命名為GmAP21ike-l (簡稱GAL1)。可用現有的植物表達載體構建含有所述基因和啟動子的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物基因槍轉化法所用的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如煙草花椰菜花葉病毒 (CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子⑴biquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS 基因、GFP基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。利用本發明的基因制備轉基因高抗逆性植物時，首先構建含有SEQ ID NO 1所示基因的重組表達載體，然后利用此重組表達載體構建轉化體，再利用此轉化體侵染目的植物，篩選陽性植株，獲得與正常植物相比具有高抗逆性的轉基因植物。實施例1、實時熒光定量分析GALl的表達模式(1)、脅迫處理Hoagland營養液生長20天左右的大豆Williams82幼苗用200mM NaCl, 100 μ M ABA分別處理Oh、lh、;3h、6h、12h，取根用液氮速凍，_80°C保存備用；(2)、mRNA的分離采用Trizol法提取大豆總RNA，①先將組織剪切成小塊，放入研磨中用液氮研磨3次，將研磨好的組織50-100mg加入1. 5mL離心管中然后加入Iml RNAVzol，裂解產物應呈澄清的透明粘稠液體.室溫放置5分鐘；②加200 μ 1氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min，12，000r/min，4°C離心IOmin ；③取500 μ 1上清于另一離心管，加等體積異丙醇，室溫放置lOmin，12，OOOr/min，4°C離心IOmin ；④加入Iml 75%乙醇洗沉淀， 8，000r/min，4°C離心5min，重復兩次；室溫風干IOmin左右，加20 μ 1左右DEPC處理過的 RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀；(3)、反轉錄為cDNA 將提取的mRNA用!Iomega公司的反轉錄酶AMV反轉錄為 cDNA ；cDNA第一鏈的合成配置第一種混合液totalRNA,7y 1(2μ g) ；oligo dT (10 μ Μ)，3 μ 1 ；總體積 10 μ 1，PCR儀上70°C放置8min，立即置于冰上；配置第二種混合液5XBuffer，4y1 ；dNTPs(dATP, dGTP, dTTP, dCTP 2. 5mmol/ L each), 4 μ 1 ； RNase inhibitor (40U/μ 1) ,0. 5μ 1 ；RNase-free 水，0· 5 μ 1 ；M-MLV (200U/μ 1)反轉錄酶， μ ι ；混勻，將第二種混合液加入到第一種混合液中，每管 ομ 1，pcr儀上 42°C孵育90min，然后70°C，IOmin終止反應；(4)、實時熒光定量PCR對GALl表達特征的分析以上述cDNA作為模板，根據GALl序列設計引物，以18srRNA為內參，使用TaKaRa 公司出品的STOR Premix Ex Tag 進行定量PCR分析。在20 μ 1體系中加入cDNA模板 2μ 1、正反向引物各 0. 4μ 1、STOR Primix Ex taq (2X) 10μ 1, ROX Reference Dye ΙΙ(50Χ)0· 4μ 1、ddH20 6·8μ1。擴增程序為95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s,45 cycles ； 95°C 15s,60°C lmin,95°C 15s ；引物序列分別為qGALl-F 5' -CAATGGGCAGGAAAGAGC-3，(SEQ ID NO 3)；qGALl-R 5' -ATGGCAGTCGATGGAAAGGT-3，(SEQ ID NO 4)；18srRNA-F 5' -CCTTGCTTGTTGCTTTACTAAAT-3，(SEQ ID NO 5)；18srRNA-R 5' -ATGCACCTTTTCGTTTGTTTCGGAG-3，(SEQ ID NO 6)；(5)結果結果如圖1所示，表明相對于CK，GALl基因在NaCl，ABA處理下表達上調，其中 NaCl處理后3小時達到最高，ABA處理后6小時表達達到最高，之后表達下調；這表明本發明的基因與植物的抗逆性具有緊密聯系，利用現有常規基因工程方法將本發明的基因導入到植物體內，能夠得到具有高抗逆性的轉基因植物，對提高作物的產量具有重大意義。實施例2、PemiarOTS染色技術分析GALl基因的逆境表達模式(I)GALl 的 Promoter 的克隆根據GALl基因的啟動子序列(ATG上游取llliBbp，見SEQ ID NO 2)設計引物對， 根據載體PCAMBIA3301多克隆位點，引物末端分別引入EcoRI和BglII酶切識別位點，以 CTAB法提取的大豆測序品種Williams82的DNA為模板，PCR擴增GALl基因的啟動子；引物序列為Pro-GALl-F-EcoRI :5，-CGGAATTC GATCTACTTAAGTCAATAAC-3，(SEQ ID NO 7)；Pro-GALl-R-BglII :5，-GAAGATCT CGTGGCGCTTCTTTTTTTTA-3，(SEQ ID NO 8)；PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生工膠回收試劑盒回收純化 1113bb左右的條帶；連T載體(PMD19-T)，挑陽性克隆，測序；(2)重組表達載體的構建①提取含有正確測序的GALl Promoter序列的T載體質粒，用限制性內切酶EcoRI 和BglII酶切，回收酶切產物；②用限制性內切酶EcoRI和BglII酶切空載體pCAMBIA3301，回收載體骨架；③用T4連接酶將步驟1的酶切產物和步驟2的載體骨架連接；④將步驟3的連接產物熱激轉化感受態DH5 α菌株，37°C過夜培養，挑取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒pCAMBIA330l-PeAU⑶S ；(3)農桿菌的轉化采用液氮凍溶法轉化農桿菌，具體操作如下a.取出凍存的200 μ 1感受態細胞，融化后加入5_10 μ 1質粒DNA，輕彈管壁混勻， 冰上放20-30min ；
b.放入液氮中5min后取出，將管轉入37°C (5min)融化后，加入800 μ 1 LB (無抗性)液體培養基，28°C低速振蕩(150rpm)4-^!;d. 10000rpm，30sec，去上清，加100 μ 1 LB液體培養基，懸浮菌體后涂板(含50mg/ ml卡那霉素)；e.置培養至白色轉化子長出，用于毛狀根的轉化；(4)農桿菌K599介導的毛狀根轉化以大豆品種吉林小粒1號為材料，取種子材料用氯氣消毒10小時后，在&培養基(培養基配方蔗糖，0. 8 瓊脂粉(sigma)，1XGAMB0RG B-5BASAL(Phyto Technology Laboratories，貨號:G398)，pH調至5. 7左右；)上萌發5天，待子葉剛要張開時切下子葉， 在子葉節處縱橫切割數刀，浸在活化的農桿菌K599中侵染30min(0D :0. 6左右)后，將外植體轉至1/2MS培養基(培養基配方2%蔗糖，0. 8瓊脂粉(sigma)，0. 5XMURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，貨號G519)，pH調至 5. 7左右；)上共培生長3天后，再轉至1/2 MS培養基上誘導毛狀根，7天后，毛狀根長出， 取根進行GUS染色分析；(5)⑶S染液的配制首先配制GUS反應緩沖液Tris Buffer，其中包括IOOmM Tris和50mM NaCl以濃鹽酸調pH至7. 4 ；然后以Tris buffer配制0. 5mM K3 [Fe (CN)6]溶液。按lmg/ml的濃度稱取x-glu(5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)，按照每mg加入10 μ 1 DMSO (二甲基亞砜)的比例溶解x-glu，加入1Tris buffer配制的0.5mM K3 [Fe (CN)6]溶液定容，可加入幾滴TritonX-100以增強染色效果。迅速分裝后于_20°C避光保存；(6)脅迫處理及⑶S染色將轉基因毛狀根浸沒在1/2MS培養基，100 μ M ABA, 150mM NaCl中脅迫處理3，6， 24h后進行⑶S染色，以V2MS培養基中的毛狀根作為對照；(7)結果結果如圖2所示，表明在ABA，NaCl，處理條件下該基因表達上調，ΙΟΟμΜ ABA處理后3 Jh表達上調；150mM NaCl處理池后表達上調；這表明本發明的基因與植物的抗逆性具有緊密聯系，利用現有常規基因工程方法將本發明的基因導入到植物體內，能夠得到具有高抗逆性的轉基因植物，對提高作物的產量具有重大意義。上述描述僅作為本發明可實施的技術方案提出，不作為對其技術方案本身的單一限制條件。
權利要求
1.一種與植物抗逆性相關的基因，其特征在于其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述基因的重組表達載體，其特征在于所用空載體為PEGAD。
3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于將目的基因插入到pEGAD的限制性內切酶Kpn I和BamH I酶切識別位點之間，得到重組表達載體。
4.權利要求1所述的基因在培育高抗逆轉基因植物中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于首先構建含有SEQID NO :1所示基因的重組表達載體，然后利用所得重組表達載體構建轉化體，再利用轉化體轉化目的植物，篩選陽性植株，得到與正常植物相比具有高抗逆性的轉基因植物。
6.根據權利要求4或5所述的應用，其特征在于所述目的植物為大豆。
全文摘要
本發明公開了一種與植物抗逆性相關的基因，其具有序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，其與植物的抗逆性具有緊密聯系，基于此，利用現有的基因工程方法能夠培育出具有高抗逆性的轉基因植物，對提高作物的產量具有重大意義。
文檔編號A01H5/00GK102226191SQ20111015480
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者李霞, 鄒艷敏 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所