專利名稱：基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及微流控芯片，特別提供了一種基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片。
背景技術：
現有技術中，微流控芯片(microfluidic chip)又稱芯片實驗室(lab on achip)，指的是把生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網絡，以可控流體貫穿整個系統，用以取代常規生物或化學實驗室的各種功能的一種技術。它的基本特征和最大優勢是多種單元技術在微小平臺上的靈活組合和規模集成。發展至今，微流控芯片技術已經開始在生命科學的不同領域得到應用，并已成為系統生物學研究中的重要技術平臺之一。同時，秀麗隱桿線蟲以其生命周期和壽命短、全身透明、全基因組測序等特征，成為生物學研究領域中常用的一種重要模式生物。最近，微流控芯片因其與秀麗隱桿線蟲尺寸匹 配、環境可控、通量高、易于實現自動化、集成化等特征而成為線蟲相關研究的重要平臺。在很多生物研究中，人們期待或者一種單個線蟲長期培養及觀察的簡易平臺。
發明內容
本發明的目的在于提供一種操作簡單、通量高的秀麗隱桿線蟲單個分析的微流控芯片平臺，具體說是一種基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及運動成像雙檢測的PDMS (聚二甲基硅氧烷)微流控芯片平臺。本發明提供了一種用于線蟲長期培養及雙檢測的微流控芯片平臺，基于微閥，對線蟲進行操控，其特征在于該芯片由三層組成，材料均為PDMS聚合物，采用PDMS軟刻蝕及不可逆封接技術構建，上層為用于線蟲培養及固定的液路層，中間層為用于線蟲固定的可形變PDMS膜，下層為提供用以PDMS膜形變的氣壓的氣路控制層。其中液路層由2(T50個線蟲分析功能單元組成，所有功能單元共用一個中心廢液池；每個分析功能單元由蟲及藥品入口、進樣通道、線蟲固定及培養室、廢液通道組成；蟲及藥品入口通過進樣通道與線蟲固定及培養室連接，然后通過廢液通道連接到與其它分析功能單元共用的中心廢液池；
所述氣路控制層的氣路通道中設有閥A和閥B，閥A位于進樣通道的中間位置下方，用于控制單個蟲進入培養室中；閥B在線蟲固定及培養室下方，用于進行線蟲固定。本發明提供的基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其特征在于所述線蟲固定及培養室的尺寸為2 _ X 1_ X80 Pm。本發明提供的基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其特征在于所述閥A由真空負壓驅動，閥B由氣體正壓驅動。本發明提供的基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其特征在于所述閥A寬度為250 Pm，閥B寬度為2 mm。
本發明提供的基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其線蟲及藥品進樣方式為利用負壓驅動的方式，將單個蟲引入培養室，培養室的尺寸(2 mm X ImmX 80 )可使其自由游動；熒光成像時利用氣壓使PDMS膜形變，將蟲體壓在通道側壁上使其固足并成像；每天進行三次物質交換，目的為添加新鮮食物，排出線蟲代謝廢物，方式為負壓抽取。本發明提供的基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其閥的操控方法如下當蟲進入進樣通道并到達閥A處時，利用真空將閥A下的PDMS膜吸起，蟲通過進樣通道進入培養室后釋放真空，關閉閥A，利用尺寸限制蟲的運動范圍，防止進入培養室中的蟲游出；當成像時利用正壓將閥B下的PDMS膜壓下，使蟲體被壓在通道側壁上，實現蟲的固定并進行熒光成像，成像后釋放線蟲，使其恢復自由運動狀態。本發明采用通道設計，操作簡單，且易于實現物質交換，有利于線蟲的長期培養；線蟲固定方法采用膜形變的方式，對蟲體安全無害，可對單個線蟲進行長期培養及運動、成像雙檢測。
本發明有以下優點
(I)采用通道灌流的方式進行食物添加及廢液排出，操作簡單，效率高，有利于線蟲的長期培養。(2)培養室同樣作為線蟲固定成像通道，且蟲的固定方式對蟲體無損傷，方法簡
單，通量高。(3)單個培養室中培養單個線蟲的設計使得每只蟲的壽命、運動行為及熒光特征得到實時及長期追蹤，可滿足生物研究的需要。
圖I芯片三層設計圖，從上到下依次為液路層、PDMS膜、氣路控制層；其中7為中心廢液池；
圖2單元放大圖，I為蟲及藥品入口，2為進樣通道，3為線蟲固定及培養室，4為廢液通道，5為閥A，6為閥B;
圖3線蟲進樣錄像截 圖4芯片上線蟲(野生型N2)的生長；
圖5芯片上線蟲(野生型N2)的存活率曲線；
圖6芯片上線蟲(野生型N2)的擺動頻率曲線；
圖7不同因素對線蟲(突變株CL2166)壽命的影響；
圖8不同因素對線蟲(突變株CL2166)運動行為的影響(第3天)；
圖9不同因素對線蟲(突變株CL2166)運動行為的影響(第5天)；
圖10不同因素對線蟲(突變株CL2166)運動行為的影響(第7天)；
圖11不同因素對線蟲(突變株CL2166)熒光特征的影響。
具體實施例方式實驗室自行設計并制作的微流控芯片制備基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及運動、熒光成像雙檢測微流控芯片的材料為PDMS聚合物，熱不可逆封接，該芯片由三層組成，上層為液路層，中間層PDMS膜，下層氣路控制層(如圖I所示)。
其中液路層由30個線蟲分析功能單元組成，所有功能單元共用一個中心廢液池7(圖I);每個分析功能單元由蟲及藥品入口 I、進樣通道2、線蟲固定及培養室3 (尺寸為2mm X Imm X80 pm )、廢液通道4組成(圖2);蟲及藥品入口 I通過進樣通道2與線蟲固定及培養室3連接，然后通過廢液通道4通向與其它分析功能單元共用的中心廢液池7 ;氣路控制層的氣路通道中設有閥A5 (寬度為250 ^m)和閥B6 (寬度為2 mm)，閥A5位于進樣通道2的中間位置下方，由真空負壓驅動，用于在制單個蟲進入培養室中；_B6在線蟲固定及培養室3下方，由氣體正壓驅動，用于進行線蟲固定。使用前事先灌好線蟲培養液K Medium。秀麗隱桿線蟲野生型蟲株N2及突變型蟲株CL2166瓊脂板上培養至大蟲后，進行bleach操作將大量卵取出，并使其孵化，長至L4期。實施例I
利用實驗室自行設計并制作的微流控芯片系統，構型如圖1、2所示，將L4期線蟲進樣到培養室中，具體過程如圖3。芯片共30個單元，利用負壓將蟲子進樣到培養室中，并且同樣利用負壓將多余的線蟲抽出培養室。各個單元相互獨立，進樣互不干擾，可達到單個培養室都只有單條蟲。實施例2
利用實驗室自行設計并制作的微流控芯片系統，將線蟲野生型N2擬合至幼蟲L4期后引入芯片中培養，線蟲在K Medium培養基中逐漸長大，見圖4。經過培養，N2在芯片上的平均壽命為9天(圖5)，擺動頻率曲線見圖6。線蟲在芯片上壽命、運動、產卵等生理行為正常，顯示該芯片微環境適于線蟲長期培養，驗證了該平臺可行性。實施例3
利用實驗室自行設計并制作的微流控芯片系統，研究不同因素對線蟲壽命、運動及熒光特征的影響
采用帶有氧化應激綠色熒光蛋白(GFP)表達的線蟲突變型蟲株CL2166進行相關實驗，當外界因素致氧化應激產生時，GFP表達增強。實驗中施加六種條件對照組、Cu2+、VE、VE+Cu2\PD (白藜蘆醇苷)、ro+cu2+。每種試劑作用時間均為一天，觀察線蟲存活狀態，并與對照組進行對比。實驗發現蟲株CL2166對照組的平均壽命為9天，在一定濃度下，Cu2+使線蟲壽命 明顯縮短(7天)，而VE和PD可延長線蟲壽命(平均壽命分別為11天和13天)并可部分修復Cu2+帶來的壽命縮短效應(平均壽命分別為8. 5天和11天)，比VE的效果更加顯著(如圖7所示)。研究還發現，這些因素對線蟲運動頻率的影響與其對壽命的影響結果相似(圖8-10)。進一步的研究發現，Cu2+使線蟲氧化應激顯著增強即加重了線蟲體內的氧化環境，而ro可減弱線蟲體內的氧化水平，而相應的VE則不能在正常條件下降低氧化應激(圖11)，兩者均使Cu2+導致升高的體內氧化水平恢復到正常水平(圖11)。
權利要求
1.基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其特征在于所述芯片由三層組成，上層為用于線蟲培養及固定的液路層，中間層為可形變PDMS膜，下層為氣路控制層； 其中液路層由2(Γ50個線蟲分析功能單元組成，所有功能単元共用ー個中心廢液池；每個分析功能単元由蟲及藥品入口、進樣通道、線蟲固定及培養室、廢液通道組成；蟲及藥品入口通過進樣通道與線蟲固定及培養室連接，然后通過廢液通道連接到與其它分析功能單元共用的中心廢液池； 所述氣路控制層的氣路通道中設有閥A和閥B，閥A位于進樣通道的中間位置下方，閥B在線蟲固定及培養室下方。
2.按照權利要求I所述基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其特征在于所述線蟲固定及培養室的尺寸為2 _ X 1_ Χ80 μιη。
3.按照權利要求I所述基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其特征在于所述閥A由真空負壓驅動，閥B由氣體正壓驅動。
4.按照權利要求3所述基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其特征在于所述閥A寬度為250 μηι，閥B寬度為2 mm。
5.按照權利要求I所述基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其特征在于所述芯片的材料均為PDMS聚合物，采用PDMS軟刻蝕及不可逆封接技術構建。
6.按照權利要求I所述基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及雙檢測微流控芯片，其特征在于線蟲進樣及培養方法為利用負壓驅動的方式，將單個蟲引入培養室，培養室的尺寸可使其自由游動；熒光成像時利用氣壓使PDMS膜形變，將蟲體壓在通道側壁上使其固定并成像。
全文摘要
本發明提供了一種基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養及運動、熒光成像雙檢測微流控芯片平臺，該芯片由三層PDMS組成，上層為液路層，用于線蟲長期培養及觀測；下層為氣路控制層，用于提供操控微閥所需氣壓；上下兩層中間為PDMS膜，膜在氣壓作用下發生形變以實現線蟲固定。所述的微流控芯片平臺的線蟲培養方法操作簡單，易于實現，該芯片可以實現營養物質的交換及代謝廢物的排出，有利于線蟲的長期培養，并可對單個線蟲進行行為及成像的長期觀察。
文檔編號A01K67/033GK102669058SQ20111006549
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月18日 優先權日2011年3月18日
發明者溫慧, 秦建華 申請人:中國科學院大連化學物理研究所