用6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(pgl)來增加異戊二烯及其他產物的產量的組合物和方法

專利名稱：用6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(pgl)來增加異戊二烯及其他產物的產量的組合物和方法
技術領域：
本公開涉及用于增加大腸桿菌(E. coli)中生物化學物質的產量的改良組合物和方法、以及用于增加大腸桿菌中異戊二烯產量的改良組合物和方法。
背景技術：
異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是廣泛應用的重要有機化合物。例如，在合成 多種化學組合物和聚合物時，異戊二烯被用作中間材料或原料。異戊二烯還是通過許多植物和動物天然合成的重要生物材料。當異戊二烯的立構規整聚合在二十世紀六十年代早期進入市場時，異戊二烯成為用于合成順式-1，4-聚丁二烯的重要單體。通過這種立構規整聚合所制備的順式-1，4-聚異戊二烯的結構和性質類似于天然橡膠。盡管它與天然橡膠不完全相同，但它在許多應用中可用作天然橡膠的替代品。例如，合成的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠被廣泛用于制備車輛輪胎和其他橡膠產品。對合成的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠的該需求消耗了大部分在世界市場上可獲得的異戊二烯。剩余的異戊二烯被用于制備其他合成橡膠、嵌段共聚物和其他化學產品。例如，異戊二烯被用于制備丁二烯-異戊二烯橡膠、苯乙烯-異戊二烯共聚物橡膠、苯乙烯-異戊二烯-丁二烯橡膠、苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物和苯乙烯-異戊二烯嵌段共聚物。在工業應用中使用的異戊二烯通常作為石油或石腦油熱裂解的副產物而產生，或以其他方式從石化流體中提取。這是相對昂貴的能源密集型過程。世界范圍內對基于石油化工的產品的需求持續增加，與此同時預計長期內對異戊二烯的消耗將上升到高得多的水平，并且在任何情況下它的可獲得性受到限制。存在未來從基于石油化工來源的異戊二烯供應將不足以滿足計劃的需求、且其價格將上升到前所未有的水平的擔憂。因此，存在從環境友好的、低成本、可再生資源中獲得異戊二烯來源的需求。本文所述的改良方法和組合物即提供異戊二烯的這種來源，其能夠以低成本從可再生資源中獲得。最近在由可再生來源產生異戊二烯方面取得了一些進展(參見例如國際專利申請公開No. WO 2009/076676A2)。這些產生異戊二烯的方法在速率、滴度和純度上可能足以符合對一個正常的商業方法的要求，然而需要改良方法以降低與源于生物來源的異戊二烯的生產相關的操作成本并增大異戊二烯的產量，例如用于增大異戊二烯和本文所提供的能夠具有生物活性的其他異源多肽的產量的改良組合物和方法。所有專利、專利申請、文檔、核苷酸和蛋白質序列數據庫記錄號、以及本文中引用的文章均全文以引用方式并入本文中。

發明內容
本文公開用于增大異戊二烯產量的改良組合物和方法。本文還提供用于增大能夠具有生物活性的異源多肽產量的改良組合物和方法。本發明部分地基于觀察到將6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)染色體整合到缺乏編碼PGL多肽的核酸的大腸桿菌菌株內會增大諸如異戊二烯或甲羥戊酸的不同種類產物的產量。因此，在一個方面，本發明提供能夠產生異戊二烯的大腸桿菌菌株的重組細胞或其子代，該細胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細胞產生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細胞的滴度。在本文的任何方面，編碼鑰攝取多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。在本文的任何方面，所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB和modC。在本文的任何方面，編碼半乳糖代謝多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整 合在所述大腸桿菌染色體中。在本文的任何方面，所述半乳糖代謝多肽選自galM、galK、gall^P galE。在本文的任何方面，編碼半乳糖代謝多肽的異源核酸的一個或多個拷貝和編碼鑰攝取多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。在本文的任何方面，(a)所述PGL多肽是大腸桿菌PGL多肽；(b)所述鑰攝取多肽選自m0dF、m0dE、modA、modB和modC ;并且(C)所述半乳糖代謝多肽選自galM、galK、galT和galE。在本文的任何方面，編碼所述PGL多肽、半乳糖代謝多肽和鑰攝取多肽的核酸是如圖20所示的17，257堿基對片段的一部分。在本文的任何方面，所述重組細胞產生異戊二烯的比產率高于不包含(a)和(b)的相同細胞。在本文的任何方面，所述重組細胞具有至少為15mg/0D/h的比產率。在本文的任何方面，編碼PGL多肽、鑰攝取多肽和/或半乳糖代謝多肽的核酸來自大腸桿菌菌株K12MG1655或所述大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在本文的任何方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株B。在本文的任何方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在本文的任何方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。在本文的任何方面，所述重組大腸桿菌細胞還包含(C)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸。在本文的任何方面，所述重組大腸桿菌細胞還包含(d)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸。在本文的任何方面，所述MVA途徑上游的多肽選自(i)乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在本文的任何方面，所述MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)；(iii) 二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構酶(IDI)。在本文的任何方面，(a)所述PGL多肽是大腸桿菌PGL多肽；(b)所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB和modC ;并且(c)所述半乳糖代謝多肽選自galM、galK、galT和galE。在本文的任何方面，所述異戍二烯合酶多肽來自銀白楊(Populus alba)。本發明還提供產生異戊二烯的方法，所述方法包括(a)在適于產生異戊二烯的培養條件下培養包含本文所述任何重組細胞的組合物，以及(b)產生異戊二烯。在一些方面，所述方法還包括回收所述異戊二烯。在其他方面，所述重組細胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產率。本發明還提供產生甲羥戊酸的方法，所述方法包括(a)在適于產生甲羥戊酸的培養條件下培養包含權利要求15所述重組細胞的組合物，以及(b)產生甲羥戊酸。在一些方面，所述方法還包括回收所述甲羥戊酸。本發明還提供制備本文所述任何重組細胞的方法，包括(a)將編碼PGL多肽的異源核酸轉導至大腸桿菌細胞內，其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細胞不包含編碼PGL多肽的核酸；(b)使所述編碼PGL多肽的核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(c)將編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸引入大腸桿菌細胞內。本發明還提供包含本文所述任何重組細胞的組合物。
在其他方面，本文提供不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細胞，其中所述大腸桿菌細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能夠具有生物活性的異源多肽的核酸，并且其中當將所述細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生能夠具有生物活性的異源多肽的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細胞在培養物中。在一些方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。在一些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，使用0.1% (w/v)或更少的酵母提取物以及I % (w/V)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655或大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬(Pseudomonas)。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。在一些方面，能夠具有生物活性的異源多肽包括在生物合成萜類化合物(類異戊二烯)或類胡蘿卜素化合物的過程中所涉及的一種或多種多肽，并且當將所述細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生萜類化合物或類胡蘿卜素的比產率高于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，所述萜類化合物選自半萜、單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和更高級的多萜。在一些方面，所述半萜是異戊烯醇(即，3-甲基-2-丁烯-I-醇)、異戊二烯醇(即，3-甲基-3- 丁烯-I-醇)、2_甲基-3- 丁烯-2-醇、或異戊酸。在一些方面，所述單萜是香葉基焦磷酸、桉葉油素、檸檬烯、或菔烯。在一些方面，所述倍半萜是法尼基焦磷酸、青蒿素、或紅沒藥醇。在一些方面，所述二萜是香葉基香葉基焦磷酸、視黃醇、視黃醛、葉綠醇、紫杉酚、毛喉素、或阿非迪霉素。在一些方面，所述三萜是角鯊烯或羊毛留醇。在一些方面，所述四萜是番茄紅素或胡蘿卜素。在一些方面，所述類胡蘿卜素選自葉黃素和胡蘿卜素。在一些方面，所述葉黃素為葉黃質或玉米黃質。在一些方面，所述胡蘿卜素是α-胡蘿卜素、β_胡蘿卜素、Y-胡蘿卜素、β_隱黃質或番茄紅素。
在另一方面，本文提供不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細胞，其中所述大腸桿菌細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸，并且其中當將所述細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生異戊二烯的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細胞在培養物中。在一些方面，所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途 徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自⑴乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽；( ) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自腸球菌屬(Enterococcus)。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)。在一些方面，所述MVK多肽來自馬氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina mazei)。在一些方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。在一些方面，使用O. I %(w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，使用0.1% (w/v)或更少的酵母提取物以及1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655或大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，所述細胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述細胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且所述細胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且所述細胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的內源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的內源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種核酸。在一些方面，一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，一種質粒編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬(Pueraria)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戍二烯合酶多肽是來自山葛(Pueraria montana)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬(Populus)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊的天然存在的多肽。在一些方面，所述細胞包含(i)包含葡萄糖異構酶啟動子、編碼來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的MVA途徑下游的整合核酸以及編碼甲輕戍酸激酶(MVK)的核酸；編碼磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)的核酸；編碼二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)的核酸；以及編碼異戊烯基二磷酸異構酶(IDI)的核酸；(ii)編碼銀白楊(P. alba)異戊二烯合酶的核酸；(iii)編碼馬氏甲烷球菌(M. mazei)甲羥戊酸激酶的核酸；以及(iv)編碼來自糞腸球菌的MVA途徑上游的核酸，所述核酸包括編碼乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽的核酸；編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽的核酸 ；以及編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽的核酸。在另一方面，本文提供產生能夠具有生物活性的異源多肽的改良方法，所述方法包括(a)培養不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細胞，其中所述大腸桿菌細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸；以及(b)產生能夠具有生物活性的異源多肽，其中當將所述細胞培養在基本培養基中時，細胞產生異源多肽的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，本方法還包括回收能夠具有生物活性的異源多肽的步驟。在一些方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。在一些方面，使用O. I %(w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，使用0.1% (w/v)或更少的酵母提取物以及1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，具有PGL活性的異源多肽來自大腸桿菌菌株K12MG1655或大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，具有PGL活性的異源多肽來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，能夠具有生物活性的異源多肽包括在生物合成萜類化合物(類異戊二烯)或類胡蘿卜素化合物的過程中所涉及的一種或多種多肽，并且當將所述細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生萜類化合物或類胡蘿卜素的比產率高于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，所述萜類化合物選自半萜、單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和更高級的多萜。在一些方面，所述半萜是異戊烯醇(即，3-甲基-2-丁烯-I-醇)、異戊二烯醇(即，3-甲基-3- 丁烯-I-醇)、2_甲基-3- 丁烯-2-醇、或異戊酸。在一些方面，所述單萜是香葉基焦磷酸、桉葉油素、檸檬烯、或菔烯。在一些方面，所述倍半萜是法尼基焦磷酸、青蒿素、或紅沒藥醇。在一些方面，所述二萜是香葉基香葉基焦磷酸、視黃醇、視黃醛、葉綠醇、紫杉酚、毛喉素、或阿非迪霉素。在一些方面，所述三萜是角鯊烯或羊毛留醇。在一些方面，所述四萜是番茄紅素或胡蘿卜素。在一些方面，所述類胡蘿卜素選自葉黃素和胡蘿卜素。在一些方面，所述葉黃素為葉黃質或玉米黃質。在另一方面，本文提供產生異戊二烯的改良方法，所述方法包括(a)培養不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細胞,其中所述大腸桿菌細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸；以及(b)產生異戊二烯，其中當將所述細胞培養在基本培養基中時，所述細胞具有的異戊二烯比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的異戊二烯比產率。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，所述改良方法還包括回收異戊二烯的步驟。在一些方面，所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自⑴乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽；( ) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自腸球菌屬。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自糞腸球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK)；( )磷酸甲羥戊酸激酶(PMK) ； (iii) 二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲燒八疊球菌屬。在一些方面，所述MVK多肽來自馬氏甲燒八疊球菌。在一些方 面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。在一些方面，使用O. I % (w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物以及1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655或大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，所述細胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述細胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且其中所述細胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且其中所述細胞具有大于約25mg/Lss/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的內源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的內源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種核酸。在一些方面，一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，一種質粒編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自山葛的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊的天然存在的多肽。在一些方面，所述細胞包含(i)包含葡萄糖異構酶啟動子、編碼來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的MVA途徑下游的整合核酸以及編碼甲輕戍酸激酶(MVK)的核酸；編碼磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)的核酸；編碼二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)的核酸；以及編碼異戊烯基二磷酸異構酶(IDI)的核酸；(ii)編碼銀白楊異戊二烯合酶的核酸；(iii)編碼馬氏甲烷球菌甲羥戊酸激酶的核酸；以及(iv)編碼來自糞腸球菌的MVA途徑上游的核酸，所述核酸包括編碼乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽的核酸；編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽的核酸；以及編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽的核酸。


圖IA顯不異戍二烯的MVA和DXP代謝途徑(基于F. Bouvier et al. , Progressin Lipid Res. 44 :357-429, 2005 (F. Bouvier 等人，《脂類研究進展》，第 44 卷第 357-429頁，2005年))。以下說明包括途徑中每種多肽的別名以及公開對所示多肽的活性進行測量的檢測分析法的參考文獻。甲羥戊酸途徑=AACT ;乙酰輔酶A乙酰轉移酶，MvaE, EC2. 3. I. 9。檢測分析法J. Bacteriol. 184 :2116-2122,2002(《細菌學雜志》，第 184 卷第2116-2122頁，2002年)；HMGS ;羥甲基戊二酰輔酶A合酶，MvaS，EC 2.3.3.10。檢測分析法J. Bacteriol. 184 :4065-4070,2002(《細菌學雜志》，第 184 卷第 4065-4070 頁，2002年)；HMGR ;3_羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，MvaE, EC I. I. I. 34。檢測分析法 J. Bacteriol. 184 :2116-2122,2002(《細菌學雜志》，第 184 卷第 2116-2122 頁，2002 年)；MVK ;甲羥戊酸激酶，ERG12，EC 2. 7. I. 36。檢測分析法Curr Genet 19 :9-14,1991(《當代遺傳學》，第19卷第9-14頁，1991年)。PMK ;磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8，EC 2. 7. 4. 2，檢測分析法Mol Cell Biol. 11 :620_631，1991 (《分子細胞生物學報》，第11卷第620-631頁，1991年)；DPMDC ;二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，MVD1，EC 4. I. I. 33。檢測分析法=Biochemistry 33 13355-13362，1994(《生物化學雜志》，第33卷第13355-13362頁，1994年)；IDI ;異戊烯二磷酸 δ 異構酶，IDI1，EC5. 3. 3. 2。檢測分析法J. Biol. Chem. 264 :19169-19175，1989 (《生物化學雜志》，第264卷第19169-19175頁，1989年)。DXP途徑DXS ；1-脫氧-5-磷酸木酮糖合酶，dxs, EC 2. 2. I. 7ο檢測分析法PNAS 94 :12857_62，1997 (《美國國家科學院院刊》，第94卷第12857-62頁，1997年)；DXR ;1_脫氧-D-木酮糖_5_磷酸還原異構酶，dxr, EC 2. 2. I. 7。檢測分析法Eur. J. Biochem. 269 :4446-4457,2002(《歐洲生物化學雜志》，第269卷第4446-4457頁，2002年)；MCT ;4_ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇合酶，IspD, EC 2.7.7.60。檢測分析法PNAS 97 :6451-6456,2000(《美國國家科學院院刊》，第97卷第6451-6456頁，2000年);CMK ；4~ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇激酶，IspE, EC
2.7. I. 148。檢測分析法PNAS97 :1062-1067，2000 (《美國國家科學院院刊》，第97卷第1062-1067 頁，2000 年)；MCS ；2C-甲基-D-赤蘚醇 2，4-環二磷酸合酶，IspF，EC4. 6· I. 12。檢測分析法=PNAS 96 :11758-11763，1999(《美國國家科學院院刊》，第96卷第11758-11763頁，1999 年);HDS;1-羥基-2-甲基 _2_ (E) - 丁烯基-4-二磷酸合酶，IspG，EC 1.17.4.3。檢測分析法J. Org. Chem. 70 :9168_9174，2005 (《有機化學雜志》，第70卷第9168-9174頁，2005 年);HDR ;1_ 羥基-2-甲基-2-(E)_ 丁烯基-4-二磷酸還原酶，IspH，ECl. 17. I. 2。檢測分析法JACS，126 :12847-12855，2004(《美國化學會志》，第126卷第12847-12855頁，2004 年)。圖IB示出經典的和改進的MVA途徑。1，乙酰輔酶A乙酰轉移酶(AACT) ;2，HMG輔酶A合酶(HMGS) ;3，HMG輔酶A還原酶(HMGR) ;4，甲羥戊酸激酶(MVK) ;5，磷酸甲羥戊酸激酶(PMK) ;6，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD或DPMDC) ;7，異戊烯基二磷酸異構酶(IDI) ;8，磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC) ;9，異戊烯基磷酸激酶(IPK)。經典的MVA途徑通過反應5和6來從反應I進行到反應7，而改進的MVA途徑經過反應8和9。在結構式中的P和PP分別是憐酸根和焦憐酸根。該圖取自 Koga 和 Morii 的 Microbiology and Mol. Biology Reviews71 :97-120, 2007 (《微生物學與分子生物學評論》，第71卷第97-120頁，2007年)。改進的MVA途徑存在于例如一些古細菌有機體(例如馬氏甲烷八疊球菌)中。圖2 是質粒 ρΕΤ24Ρ· alba HGS 的圖譜。圖3A-B是質粒ρΕΤ24Ρ· alba HGS的核苷酸序列(序列標識號I)。圖4是顯示用于內切酶消化以構建質粒EWL230和介于BspHI和NcoI位點之間的相容粘性末端的限制性位點的示意圖。圖5是質粒EWL230的圖譜。
圖6A-B是質粒EWL230的核苷酸序列(序列標識號2)。圖7是顯示用于內切酶消化以構建質粒EWL244和介于NsiI和PstI位點之間的相容粘性末端的限制性位點的示意圖。圖8是質粒EWL244的圖譜。圖9A-B是質粒EWL244的核苷酸序列(序列標識號3)。圖10A是馬氏產甲烷球菌古細菌的下游操縱子的圖譜。圖10B-C是馬氏產甲烷球菌古細菌下游操縱子的核苷酸序列(序列標識號4)。圖IlA是來自馬氏產甲烷球菌古細菌pET200D下游的MCM376-MVK的圖譜。圖IlB-C是來自馬氏產甲烷球菌古細菌PET200D下游的MCM376-MVK的核苷酸序列(序列標識號5)。圖12 是質粒 pBBRCMPGIl. 5-pgl 的圖譜。 圖13A-B是質粒pBBRCMPGII. 5-pgl的核苷酸序列(序列標識號6)。圖14A-F是通過大腸桿菌菌株來產生異戊二烯的曲線圖，該大腸桿菌菌株表達馬氏產甲烷球菌甲羥戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合酶、以及Pgl (RHM111608-2)，并且在15L規模的分批補料培養物中生長。圖14A顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的光密度的時間進程。圖14B顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的異戊二烯滴度的時間進程。滴度定義為每升發酵肉湯所產生的異戊二烯的量。計算異戊二烯的方法在59小時內累積產生的異戊二烯，g/在59小時時刻的發酵罐體積，L[ = ]g/L肉湯。圖14C也顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的異戊二烯滴度的時間進程。計算異戊二烯的方法/ (異戍二烯的瞬時產率，g/L/h)dt (從t = O至59小時)[=]g/L肉湯。圖14D顯示由使用葡萄糖填充的15L生物反應器產生的總異戊二烯的時間進程。圖14E顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的體積產率。圖14F顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的二氧化碳釋放率(CER)、或代謝活性分布。圖15A-B是顯示對15L生物反應器中的發酵尾氣進行分析的曲線圖。樣品A是在64. 8小時取樣的菌株RM111608-2。樣品B是在34. 5小時取樣的菌株EWL256，該菌株為大腸桿菌 BL21 (DE3), pCL upper, cmR-gil. 2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK。測得兩個樣品的氫在基線(0. 95Χ1(Γ8乇)以上。圖16Α顯示示例性的異戊二烯回收裝置。
圖16B顯示示例性的異戊二烯解吸/冷凝設置。圖17顯示異戊二烯產物的GC/FID色譜圖。測得材料的純度為99. 7%。圖18A-C顯示在(A)之前以及在使用氧化鋁⑶或二氧化硅(C)處理后的異戊二烯樣品的GC/FID色譜圖。異戊二烯峰未顯示在這些色譜圖中。圖19A顯示質粒pDW34的圖譜，該質粒pDW34在PTrc啟動子和馬氏產甲烷球菌MVK的控制下編碼銀白楊異戊二烯合酶的截短形式(MEA變體)。圖19B-D顯示質粒pDW34的完整核苷酸序列(序列標識號7)。圖20顯示大腸桿菌K12菌株MG1655在pgl基因座周圍的染色體結構(該圖從www. ecocyc. com導入)。在括號中顯示與大腸桿菌K12MG655相比在大腸桿菌BL21 (DE3)中刪掉的區域，并且該區域在菌株CMP215和CMP258中恢復。用圓圈標記ybgS基因的預測開 放閱讀框。正向箭頭(一)指示galMF引物的退火位點(序列標識號8)。反向箭頭(一)指示galMR引物的退火位點(序列標識號9)。圖21顯示使用PGL+(CMP312)和PGL_(CMP323)培養物進行的微型發酵實驗的光密度(OD)曲線圖。沿著X軸的黑色三角形指示進行離線取樣的時刻。其他OD值為內插值。圖22顯示使用PGL+(CMP312)和PGL_(CMP323)培養物進行的微型發酵實驗的異戊二烯比產率曲線圖。沿著X軸的黑色三角形指示進行離線取樣的時刻。其他OD值為內插值。圖23顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的光密度的時間進程。圖24顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的異戊二烯滴度的時間進程。將異戊二烯滴度定義為每升發酵肉湯所產生的異戊二烯的量。計算異戊二烯滴度的公式為/ (異戍二烯的瞬時產率，g/L/h) dt (從t = O至t小時)[=]g/L肉湯。圖25顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應器產生的總異戊二烯的時間進程。圖26顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的異戊二烯比產率。計算比產率水平的公式為:(mg異戊二烯t-mg異戊二烯J/[(0D550t*L肉湯t_0D550t()*L肉湯t0)/(2. 70D*L/g 細胞)]/(t-t0) [ = ]mg 異戍二烯 /g 細胞 /h。圖27顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的光密度的時間進程。Pgl+樣品是菌株CMP312的培養物。pgl-樣品是菌株CMP323的培養物。圖28顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的異戊二烯滴度的時間進程。將滴度定義為每升發酵肉湯所產生的異戊二烯的量。pgl+樣品是菌株CMP312的培養物。Pgl-樣品是菌株CMP323的培養物。計算異戊二烯滴度的公式為/ (異戊二烯的瞬時產率，g/L/h) dt (從 t = O 至 20 小時)[=]g/L 肉湯。圖29顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的異戊二烯比產率。Pgl+樣品是菌株CMP312的培養物。pgl-樣品是菌株CMP323的培養物。計算比產率水平的公式為(mg 異戊二烯 t_mg 異戊二烯 J / [ (0D550t*L 肉湯 t_0D550t()*L 肉湯 J / (2. 70D*L/g 細胞)]/(t-t0) [ = ]mg 異戍二烯 /g 細胞 /h圖30顯示使用葡萄糖填充的含有大腸桿菌K12菌株MG1655的15L生物反應器內的光密度的時間進程。圖31顯示使用葡萄糖填充的含有大腸桿菌K-12菌株MG1655的15L生物反應器內的異戊二烯滴度的時間進程。將滴度定義為每升發酵肉湯所產生的異戊二烯的量。計算異戊二烯滴度的公式為/ (異戊二烯的瞬時產率，g/L/h) dt (從t = O至t小時)[=]g/L肉湯。圖32顯示由使用葡萄糖填充的含有大腸桿菌K-12菌株MG1655的15L生物反應器產生的總異戊二烯的時間進程。圖33顯示使用葡萄糖填充的含有大腸桿菌菌株K12MG1655的15L生物反應器中異戊二烯比產率的時間進程。計算比產率的公式為(mg異戊二烯t_mg異戊二烯t。)/[(0D550t*L 肉湯 t-0D550tQ*L 肉湯 t0)/(2. 70D*L/g 細胞)]/ (t_t。) [ = ]mg 異戊二烯/g 細胞/h。圖34A顯示表達來自糞腸球菌的MVA途徑上游的多肽mvaE和mvaS的質粒pDW15的圖譜。圖34B-D顯示質粒pDW15的完整核苷酸序列(序列標識號10)。圖35顯示包含O. I %酵母提取物和I %葡萄糖的TM3基本培養基中細菌菌株的 甲羥戊酸比產率。對獨特的菌落進行三重平行實驗。菌株在表29中有更詳細的描述。BL21+pCL pTrcUpper =菌株 MCM870 ；BL21pgl+pCL pTrcUpper =菌株 MCM874 ；BL21+pBBRpTrcUpper =菌株 MCM871 ；BL21pgl+pBBR pTrcUpper =菌株 MCM875 ；BL21+pTrcUpper =MCM872 ；BL21pgl+pTrcUpper = MCM876。圖36顯示在包含O. 02%酵母提取物和I %葡萄糖的TM3基本培養基中大腸桿菌菌株MCM872和MCM876的生長。圖37顯示在包含O. 02%酵母提取物和I %葡萄糖的TM3基本培養基中大腸桿菌菌株 MCM872(BL2IpTrc-Upper)和 MCM876 (BL21pgl pTrc-Upper)的甲羥戊酸產生速率。圖38顯示在兩個不同的時間點從具有O. 02%酵母提取物的TM3基本培養基中取出的大腸桿菌菌株 MCM872 (BL2IpTrc-Upper)和 MCM876 (BL21pgl pTrc-Upper)中的 MvaS蛋白濃度/OD。圖39顯示在具有O. 02%酵母提取物的TM3基本培養基中生長的大腸桿菌菌株MCM872 (BL2 IpTrc-Upper)和 MCM876 (BL21pgl pTrc-Upper)中的 MvaE 濃度 /OD。圖40A顯示來自大腸桿菌K12MG1655的6_磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)的氨基酸序列(序列標識號11)。圖40B顯示來自銅綠假單胞菌的PGL的氨基酸序列(序列標識號
12)。圖40C顯示來自釀酒酵母的PGL的氨基酸序列(序列標識號13)。圖40D顯示大腸桿菌PGL和銅綠假單胞菌PGL的氨基酸序列比對。相同的氨基酸以灰色突出顯示。保守性氨基酸取代以黑色突出顯示。圖41A-B顯示BL21 (Novagen)和標記為BL21pgl的菌株CMP258 (實例6)的生長速率。所述生長在包含O. 4% (w/v)葡萄糖的M9基本培養基(6g/L Na2HPO4,3g/L KH2PO4,O. 5g/L NaCl、O. 5g/L NH4Cl、(λ ImMCaCl2,2mM MgSO4)中評估。所述生長在 0D600 處測量。圖41A顯示BL21和菌株CMP258 (標記為BL21pgl)的生長。圖41B顯示具有和不具有pgl的BL21的比生長速率(μ )。在BL21中恢復包含17，257bp缺失的pgl導致菌株具有約15%的比生長速率增長。圖42A顯示使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的異戊二烯滴度的時間進程。將異戊二烯滴度定義為每升發酵肉湯所產生的異戊二烯的量。計算異戊二烯滴度的公式為/ (異戍二烯的瞬時產率，g/L/h)dt (從t = O至t小時)[=]g/L肉湯。圖42B顯示在使用葡萄糖填充的15L生物反應器內的異戊二烯比產率。計算比產率水平的公式為(mg異戊二烯 t-mg 異戊二烯 J / [ (0D550t*L 肉湯 rOD550t()*L 肉湯 J / (2. 70D*L/g 細胞)]/大腸桿菌BL21和BL21 (DE3)被廣泛用作產生重組蛋白的宿主。它們也能用于產生其他產物，例如異戊二烯。通過增大戊糖磷酸途徑(對細胞生長很重要的代謝途徑)的活性可改善此類大腸桿菌菌株中重組蛋白、生物化學物質和其他產物的收率 。使用億明達公司的基因組分析儀II (Illumina Genome Analyzer II (GA II))測序體 系，對由CodonGenomics公司(位于密蘇里州圣路易斯市(St. Louis, MO))制備的大腸桿菌BL2 1的基因序列和大腸桿菌MG1655 (GenBank登錄號U00096)的基因序列的比較顯示大腸桿菌BL21基因組在編碼利用半乳糖時所涉及的基因以及如本文中較為詳細地描述的其他基因的區域中攜帶17，257bp的缺失。出乎意料地，該缺失還涵蓋編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)(戍糖磷酸途徑中的第二種酶)的 ybhE 基因(Thomason, L. , Court, D. , Datta, A. , Khanna,R. and Rosner, J. , “Identification of the Escherichia coli K_12ybhE gene as pgl,encoding 6-phosphogluconolactonase, ’’J.Bact· 186 :8248-8253 (2004) (Thomason, L.、Court, D.、Datta, A. > Khanna, R.和Rosner, J., “將編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶的大腸桿菌K-12ybhE基因識別為pgl”，《細菌學雜志》，第186卷第8248-8253頁，2004年))。該缺失通過對大腸桿菌BL21的親本菌株進行紫外線輻照來制備并通過Pl轉導傳遞(StudierF. , Daegelen, P. , Lenski, R. , Maslov, S. , Kim, J. F. , “Understanding the differencesbetween genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 andBL21 (DE3)and comparison of the E. coli B and K_12genomes,，，J. Mol. Biol, published aheadof print Sept. 15, 2009 (Studier F.、Daegelen, P.、Lenski, R.、Maslov, S.、Kim, J. F.,“理解大腸桿菌B菌株REL606和BL21 (DE3)的基因組序列之間的差異并比較大腸桿菌B和K-12基因組”，《分子生物學雜志》，在2009年9月15日早于印刷版出版))。因此，大腸桿菌BL21和BL21 (DE3)不僅缺乏PGL活性，還缺乏利用半乳糖作為碳源的能力。(Aonet al. , “Suppressing posttranslational gluconoylation of heterologous proteinsby metabolic engineering of Escherichia coli,，，Appl. Environ. Microbiol. 74 :950-958(2008) (Aon等人，“通過大腸桿菌的代謝工程抑制異種蛋白的翻譯后葡萄糖酸化”，《應用與環境微生物學》，第74卷第950-958頁，2008年))。此外，所述缺失還包含高親和力鑰酸鹽轉運所需的基因。盡管體內僅需要痕量的鑰，但鑰在所有生物體的數種代謝途徑中扮演重要角色。鑰酸鹽在通過細菌進行的許多氧化/還原反應中用作酶的輔因子、在氮代謝中起著關鍵作用，并且特別是在厭氧呼吸的情況下有助于產生能量。(參見例如Self et al.，Res Microbiol. 152 :311-321 (2001)(Self等人，《微生物學研究》,第152卷第311-321頁,2001年)；Grunden & Shanmugam,ArchMicrobiol. 168 :345-354 (1997) (Grunden 和 Shanmugam,《微生物學文獻集》，第 168 卷第 345-354 頁，1997 年))。在生長期間使用戊糖磷酸途徑(PPP)提供NADPH和戊糖(五碳糖)(Neidhart，F. , Ingraham, J. , and Schaechter, Μ. , 1990, Physiology of the bacterial cell a molecular approach(Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA) (Neidhart, F.、Ingraham, J.和Schaechter,M. , 1990年,《細菌細胞生理學分子途徑》，由位于馬薩諸塞州桑德蘭的Sinauer Associates有限公司出版))。PPP具有兩個不同的階段(I)氧化階段，其中生成了 NADPH ;以及(2)非氧化階段，其中合成五碳糖。PPP是糖酵解的替代方式，并且雖然PPP不涉及葡萄糖的氧化，但其主要作用是合成代謝而非分解代謝。該途徑的主要結果是(1)生成在細胞內的還原性生物合成反應(諸如脂肪酸合成反應)中使用的NADPH形式的還原等價物；(2)產生在核苷酸和核酸的合成中使用的5-磷酸核糖(R5P);以及(3)產生在芳香族氨基酸的合成中使用的4-磷酸赤蘚糖(E4P)。芳香族氨基酸繼而是許多生物合成途徑的前體。源自核酸消化的膳食戊糖可通過戊糖磷酸途徑代謝，并且膳食碳水化合物的碳骨架可轉變為糖酵解或糖異生的中間體 。在哺乳動物體內，PPP只在細胞質中發生，并且是身體產生具有還原力的分子的三種主要方式之一，人體中大約60%的NADPH通過其產生。在大腸桿菌BL21和BL21(DE3)菌株中修復PGL基因及其相關的表達控制序列傳達了可觀的生長收益，這是因為戊糖磷酸途徑提供了在細胞內的還原性生物合成反應(諸如脂肪酸合成反應)中使用的還原當量、在核苷酸和核酸的合成中使用的5-磷酸核糖(R5P)、以及(3)在芳香族氨基酸的合成中使用的4-磷酸赤蘚糖(E4P)。此外，具有能夠利用半乳糖的同源菌株(如，大腸桿菌BL21或BL21(DE3)菌株)，從而可用碳源的范圍，這對于工業目的而言將是有用的。另外，編碼高親和力鑰酸鹽轉運蛋白的恢復基因將提供額外的生長收益，這是因為細胞將能夠在需要鑰作為輔因子的那些代謝反應中更有效地利用鑰酸鹽。本發明涵蓋表達編碼整合到細菌染色體內的PGL多肽的異源核酸的重組細菌細胞的改良方法和組合物。單獨的PGL整合或聯合編碼用于半乳糖代謝和/或鑰轉運的多肽的一種或多種其他異源核酸的PGL整合可改善重組細菌細胞產生異戊二烯的能力。因此，在一個方面，本發明涵蓋能夠產生異戊二烯的大腸桿菌菌株的重組細胞，其中所述細胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在整合之前，所述大腸桿菌細胞不包含(a)編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細胞產生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細胞的滴度。在一些情況下，重組大腸桿菌細胞能使用其自身的內源性啟動子和/或其他調節體系來調節整合的PGL核酸的轉錄和隨后的表達。在這種情況下，異源核酸的表達(如，PGL或異戊二烯)不是被質粒或質粒上的因子驅動的組成型表達。在其他情況下，重組大腸桿菌細胞能使用已引入大腸桿菌細胞的啟動子和/或其他調節體系來調節整合的PGL核酸的轉錄和隨后的表達。本發明還涵蓋不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株細胞，其中所述大腸桿菌細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸。在一個方面，PGL多肽不通過質粒上的核酸編碼。在一些方面，當將所述大腸桿菌細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生能具有生物活性的多肽的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。本文還提供產生能具有生物活性的異源多肽的改良方法，包括在基本培養基中培養不編碼PGL多肽的大腸桿菌細胞和產生異源多肽的步驟，其中所述細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸。在一些方面，當將所述細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生異源多肽的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在另一方面，本文提供不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株細胞，其中所述大腸桿菌細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽、MVA途徑下游的多肽和/或異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，當將所述大腸桿菌細胞培養在基本培養基中時，所述細胞具有的異戊二烯比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的異戊二烯比產率。本發明還提供產生異戊二烯的改良方法，包括在基本培養基中培養不編碼PGL多肽的大腸桿菌細胞和產生異戊二烯的步驟，其中所述細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽、MVA途徑下游的多肽或異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，當將所述細胞培養在基本培養基中時，所述細胞具有的異戊二烯比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多 個拷貝的相同細胞的異戊二烯比產率。誦用摶術除非另外指明，否則對本發明的實施將采用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學領域的常規技術，這些技術均為本領域的現有技術。這些技術在以下文獻中有完整解釋“Molecular Cloning A Laboratory Manual”，secondedition(Sambrook et al. , 1989)(《分子克隆實驗手冊》第二版，Sambrook 等人，1989年)^iOligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed.，1984)(《寡核苷酸合成》，M. J. Gait編輯，1984 年);“Animal Cell Culture” (R. I. Freshney，ed.，1987)(《動物細胞培養》，R. I. Freshney 編輯，1987 年);“Methods in Enzymology”(Academic Press, Inc.)(《酶學方法》，美國學術出版社)；uCurrent Protocols in Molecular Biology”(F. M. Ausubelet al.，eds. , 1987, and periodic updates)(《分子生物學實驗室指南》，F. M. Ausubel 等人編輯，1987年,周期性更新);“PCR :The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis et al.,eds. , 1994)(《聚合酶鏈反應》，Mullis 等人編輯，1994 年)。Singleton et al. ,Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology 2nded. , J. ffiley&Sons(New York, N. Y. 1994)(Singleton等人，《微生物學和分子生物學詞典》第二版，約翰·威利父子公司，紐約州
Organic Chemistry Reactions, Mechanisms andStructure 4th ed.，John ffiley&Sons (New York, N. Y. 1992) (March,《高等有機化學反應、機理和結構》第4版，約翰 威利父子公司，紐約州紐約市，1992年)向本領域的技術人員提供對本申請中使用的許多術語的一般性指導。定義術語“異戍_■稀”是指2-甲基-1，3_ 丁_■稀(CAS號78-79-5)。其可以是由3,3-二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)消除焦磷酸酯所得的直接和最終揮發性C5碳氫化合物產物。其可不涉及將IPP分子鍵合或聚合至DMAPP分子。除非本文中另外指明，否則術語“異戊二烯”通常不旨在受其產生方法的限制。
如本文所用，術語“6-磷酸葡萄糖酸內酯”是指6-磷酸-D-葡萄糖酸-I，5-內酯(CAS號2641-81-8)。如本文所用，術語“6-磷酸葡萄糖酸”是指6-磷酸-D-葡萄糖酸(CAS號 921-62-0)。如本文所用，術語“多肽”包括多肽、蛋白質、肽、多肽的片段和融合多肽。如本文所用，“分離的多肽”不是多肽庫(諸如2種、5種、10種、20種、50種或更多種不同多肽的庫)的一部分，并且與和其一起存在于自然界中的至少一種組分分離。分離的多肽可例如通過編碼多肽的重組核酸的表達來獲得。分離的多肽可以為非天然存在的多肽。所謂“異源多肽”，是指通過源自與宿主細胞不同的有機體、菌種或菌株的核酸序列編碼的多肽。在一些方面，異源多肽不同于存在于自然界中的相同宿主細胞內的野生型多肽。如本文所使用，“核酸”是指以單股或雙股形式共價連接在一起的兩個或更多個脫 氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。所謂“重組核酸”，是指目標核酸由其而來的有機體的天然存在的基因組中目標核酸的側面沒有一個或多個核酸(如，基因)的目標核酸。因此，該術語包括(例如)整合到載體中、整合到自主復制的質粒或病毒中、或整合到原核生物或真核生物的基因組DNA中、或者獨立于其他序列作為單獨的分子(例如，cDNA、基因組DNA片段、或通過PCR或限制性內切酶消化制備的cDNA片段)存在的重組DNA。在一些方面，重組核酸是編碼非天然存在的多肽的核酸。所謂“異源核酸”，是指源自與宿主細胞不同的有機體、菌種或菌株的核酸序列。在一些方面，異源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主細胞內的野生型核酸。例如，從大腸桿菌K12菌株MG1655或其衍生物分離、通過Pl轉導整合到大腸桿菌BL21 (DE3)的染色體內并在細胞中表達的編碼PGL多肽的核酸為異源核酸。在一個方面，“異源核酸”可意味著將核酸引入不具有該核酸的宿主細胞中。在一些情況下，異源核酸可以為異源基因。本領域的技術人員將會知道不同之處，并因此還能夠使用所述教導的上下文。如本文所用，“表達控制序列”是指指導目標核酸轉錄的核酸序列。表達控制序列可以為啟動子(例如組成型或誘導型啟動子)或增強子。表達控制序列可以為“天然的”或異源的。天然表達控制序列源自與當前表達的基因相同的有機體、菌種或菌株。異源表達控制序列源自與當前表達的基因不同的有機體、菌種或菌株。“誘導型啟動子”是在環境或發育調節下具有活性的啟動子。表達控制序列可操作地連接至待轉錄的核酸片段。如本文所用，術語“基本培養基”是指包含對細胞生長可能的最少營養物質的生長培養基，其通常不存在氨基酸。基本培養基通常包含(I)用于細菌生長的碳源；(2)各種鹽，其可根據細菌種類和生長條件而變化；以及(3)水。碳源可能有很大的差異，從簡單的糖類(諸如葡萄糖)到其他生物質(諸如酵母提取物)的較為復雜的水解產物均可，如下文更為詳細的討論。鹽通常提供必需元素，例如鎂、氮、磷和硫，以使得細胞可合成蛋白質和核酸。基本培養基還可補充以諸如抗生素等選擇性試劑，用于有選擇地維持某些質粒等。例如，如果微生物對某種抗生素(例如氨芐青霉素或四環素)具有抗性，則可將該抗生素加入培養基以避免細胞在生長過程中缺乏抗性。如選擇期望的生理或生化特性所必需的，培養基可補充以其他化合物，例如特定的氨基酸等。
如本文所用，術語“萜類化合物”或“類異戊二烯”是指類似于萜烯的一大類各種各樣的天然存在的有機化學物質。萜類化合物源自以多種方式組裝和修飾的五碳異戊二烯單元，并且以組成員中使用的異戊二烯單元的數目為基礎進行分類。半萜具有一個異戊二烯單元。單萜具有兩個異戊二烯單元。倍半萜具有三個異戊二烯單元。二萜具有四個異戊二烯單元。二倍半萜具有五個異戊二烯單元。三萜具有六個異戊二烯單元。四萜具有八個異戊二烯單元。多萜具有多于八個異戊二烯單元。如本文所用，術語“類胡蘿卜素”是指在植物、一些其他光合生物體(諸如藻類)的葉綠體和成色素細胞中、在一些類型的真菌中、以及在一些細菌中產生的一組天然存在的有機色素。類胡蘿卜素包括含氧的葉黃素和不含氧的胡蘿卜素。除非本文另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同。如本文所用，除非上下文另有明確說明，否則單數“一個”、“一種”和“該”包括復 數含義。在本說明書通篇中給出的每一個上限值旨在包括每一個下限值，仿佛此類下限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一個下限值將包括每一個上限值，仿佛此類上限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一個數值范圍將包括落入此類較寬數值范圍內的每一個較窄數值范圍，仿佛此類較窄數值范圍在本文中全部明確地寫出一樣。修復至大腸桿菌B121或BL21(DE3)的編碼多肽的基因在大腸桿菌BL21和BL21(DE3)基因組中的17，257bp缺失包括yghE基因(PGL)、編碼利用半乳糖作為碳源時所涉及的蛋白質的基因、編碼鑰轉運時所涉及的蛋白質的基因，以及功能未知的幾種其他基因。參見(例如)圖20。利用半乳糖時所涉及的基因是編碼半乳糖-I-差向異構酶的galM、編碼半乳糖激酶的galK、編碼半乳糖_1_磷酸尿苷酰轉移酶的galT，以及編碼UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的galE。編碼鑰轉運時所涉及的蛋白質的基因是編碼ABC超家族的融合鑰酸鹽轉運子亞基的modF、編碼用于鑰轉運的modABC操縱子的阻遏蛋白的modE,以及各自編碼鑰酸鹽轉運子亞基蛋白質的modA、modB和modC。因此，可將細菌(如，大腸桿菌)細胞設計為在大腸桿菌染色體中整合編碼PGL多肽的核酸。引入編碼異戊二烯合酶(如，銀白楊異戊二烯合酶)的異源核酸可增大異戊二烯產生過程的總滴度和/或比活性。此外，除PGL整合之外，還可以將編碼利用半乳糖作為碳源時所涉及的蛋白質或鑰轉運時所涉及的蛋白質的一種或多種基因引入大腸桿菌細胞以增大重組細胞的綜合適應度，這繼而可導致異戊二烯產量增大。可以設想的是，單獨整合的PGL或者與編碼利用半乳糖作為碳源時所涉及的蛋白質或鑰轉運時所涉及的蛋白質的一種或多種基因相結合而整合PGL的各種選擇均在本發明的范圍之內。因此，在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL和galM。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL和galK。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL和galT。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL和galE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM和galK。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM和galT。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM和galE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGUgalK和galT。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK和galE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galT和galE。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK和galT。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK和galE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galT和galE。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGUmodF和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、modF、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、modE、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL> modF、modE、modA、modB 和 modC。
在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGUgalM和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGUgalK和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galT和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galT和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galT、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galK和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE和modE。在一些方面，修復至BL21 或 BL21 (DE3)基因組的基因是 PGL、galE、modA、modB 和 modC。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galT和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galT和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galT、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galE和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galE和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galE、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galT和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galT和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galT、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galE和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galK、galE和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是 PGL、galK、galE、modA、modB 和 modC。在一些方面，修復至 BL21 或 BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galT和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galT和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL> galE、galT、modA、modB 和 modC。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galT和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galT和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21(DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galT、modA、modB和mod C。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galE和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galE和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galM、galK、galE、modA、modB和modC。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galK、galT和modF。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galK、galT和modE。在一些方面，修復至BL21或BL21 (DE3)基因組的基因是PGL、galE、galK、galT、modA、modB 和 modC。在一些方面，將在17，257bp基因組片段上編碼的一種或多種基因的一個或多個拷貝(除PGL外)修復至質粒上的大腸桿菌BL21或BL21(DE3)。在一些方面，將在17，257bp基因組片段上編碼的一種或多種基因的一個或多個拷貝修復至組成型表達質粒上的大腸桿菌BL21或BL21 (DE3)。在一些方面，將在17，257bp基因組片段上編碼的一種或多種基因的一個或多個拷貝修復至誘導型質粒上的大腸桿菌BL21或BL21 (DE3)。在一些方面，整個17，257bp基因組片段是被轉染到大腸桿菌BL21或BL21(DE3)細胞內的質粒。在一些方面，通過染色體整合將在所述17，257bp基因組片段上編碼的一種或多種基因的一個或多個拷貝修復(如圖20中所示)至大腸桿菌BL21或BL21(DE3)。在一些方面，通過染色體整合將整個17，257bp基因組片段修復至大腸桿菌BL21或BL21 (DE3)。示例件PGL多肽和核酸6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)將6-磷酸葡萄糖酸內酯轉化為6_磷酸葡萄糖酸。示例性PGL多肽包括具有PGL多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性PGL多肽和核酸包括具有PGL多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。突變型PGL多肽包括其中一種或多種氨基酸殘基經氨基酸取代但仍保留PGL活性(SP，將6-磷酸葡萄糖酸內酯轉化為6-磷酸葡萄糖酸的能力)的那些。氨基酸取代可以為保守性或非保守性的，并且此類取代的氨基酸殘基可以被或可以不被遺傳密碼編碼。已經基于氨基酸側鏈的相似性將標準的二十種氨基酸“字母表”劃分為各個化學家族。那些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電極性側鏈的氨基酸(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支化側鏈的氨基酸(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側鏈的氨基酸(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸殘基被替換為具有化學上相似的側鏈的氨基酸殘基(如，使用具有堿性側鏈的另一種氨基酸替換具有堿性側鏈的氨基酸)的一種取代。“非保守性氨基酸取代”是其中氨基酸殘基被替換為具有化學上不同的側鏈的氨基酸殘基(如，使用具有芳香側鏈的另一種氨基酸替換具有堿性側鏈的氨基酸)的一種取代。可在PGL多肽中引入氨基酸取代以改善分子的功能性。例如，可將增大PGL多肽對其基底的親和力、或改善其將6-磷酸葡萄糖酸內酯轉化為6-磷酸葡萄糖酸的能力的氨基酸取代引入到PGL多肽內。在一些方面，突變型PGL多肽包含一種或多種保守性氨基酸取代。在一些方面，突變型PGL多肽包含一種或多種非保守性氨基酸取代。可使用標準方法，諸如通過A. Sinha and P. K. Maitra, “ Induction of specificenzymes of the oxidative pentose phosphate pathway by glucono-delta—lactonein Saccharomyces cerevisiae,，，J. Gen. Microbiol. 138 :1865-1873 (1992) (A. Sinha 和p. K. Maitra，“通過釀酒酵母中的葡萄糖酸-δ -內酯誘導特定酶的氧化戊糖磷酸途徑”，《普通微生物學雜志》，第138卷第1865-1873頁，1992年)所述的那些，通過測定多肽將NADP+還原至NADPH的能力來確定多肽是否具有PGL活性。在示例性檢測分析中，PGL活性通過如下方式測定預先溫育包含50 μ M葡萄糖-6-磷酸、O. 5mM NADP+、和溶于50mM MES緩沖液(pH = 6. 5)中的O. 5單位葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、25mM KClUOmM MgCl2的反應混合物，直至反應完成。隨后加入I單位的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，其導致熒光緩慢增加，這是因 為在較早的反應中形成的內酯自發地水解。接著，加入無細胞提取物，從而通過由PGL催化的內酯酶反應導致NADP+還原為NADPH的速率增大。通過從該最終速率中減去之前的空白速率來計算實際的內酯酶速率。作為另外一種選擇，可通過核磁共振(NMR)光譜監測6-磷酸葡萄糖酸內酯向6_ 憐酸葡萄糖酸的轉化。參見例如 E. Miclet et al. , “NMR Spectroscopic Analysis ofthe First Two Steps of the Pentose-Phosphate Pathway Elucidates the Role of6-Phosphogluconolactonase, ” J. Biol. Chem. 276 (37) :34840-34846 (2001) (Miclet 等人，“對戊糖磷酸途徑的前兩個步驟的核磁共振光譜分析闡明6-磷酸葡萄糖酸內酯酶的作用”，《生物化學雜志》，第276卷第37期第34840-34846頁，2001年)。示例性PGL核酸包括編碼具有PGL多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性異戊二烯合酶多肽和核酸包括來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。示例性PGL核酸包括(例如)從大腸桿菌K12MG1655或其衍生物(EcoGene登錄號EG13231 ；其為參考GenBank登錄號U0096的大腸桿菌K12MG1655基因序列的一部分；還可參見UniProtKB/Swiss-Prot登錄號P52697 (PGL多肽))中分離的PGL (參見圖40A和序列標識號11);從銅綠假單胞菌菌株PA01L(GenBank登錄號AE004091的基因座標簽PA3182 ；還可參見GenBank登錄號AAG06570. I (PGL多肽))中分離的PGL(參見圖40B和序列標識號12);以及從釀酒酵母(GenBank登錄號NC_001140的基因座標簽YHR163W ;還可參見UNIProtKB/Swiss-Prot登錄號P38858 (PGL多肽))中分離的PGL (參見圖40C和序列標識號
13)。其他示例性PGL核酸可從腸桿菌(Enterobacteriaceae)科的任何屬中分離,包括例如Alishewanella、交替球菌屬(Alterococcus)、Aquamonas、朽1 樣酸桿菌屬(Citrobacter)、克羅諾桿菌屬(Cronobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)(如，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、泛菌屬(Pantoea)(如,朽1檬泛菌(Pantoea citroea))、變形桿菌屬(Proteus)(如,普通變形桿菌(Proteus vulgaris))、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)(如,粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens))、志賀氏菌屬(Shigella)、以及耶爾森菌屬(Yersinia)(如,鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis))。示例性半乳糖代謝多肽和核酸半乳糖-I-差向異構酶(galM)催化β-D-半乳糖向a-D-半乳糖的轉化。示例性的半乳糖-I-差向異構酶多肽包括具有半乳糖-I-差向異構酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性半乳糖-I-差向異構酶多肽和核酸包括具有半乳糖-I-差向異構酶多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。半乳糖激酶(galK)催化D-半乳糖向D-半乳糖_1_磷酸的磷酸化。示例性半乳糖激酶多肽包括具有半乳糖激酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性半乳糖激酶多肽和核酸包括具有半乳糖激酶多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型 多肽和核酸。半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉移酶(galT)催化通過將UDP-葡萄糖和半乳糖_1_磷酸轉化為葡萄糖-I-磷酸和UDP-半乳糖的半乳糖代謝的Leloir途徑的第二步。示例性半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉移酶多肽包括具有半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉移酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉移酶多肽和核酸包括具有半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉移酶多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。UDP-半乳糖-4-差向異構酶(galE)催化UDP-半乳糖向UDP-葡萄糖的可逆轉化。示例性UDP-半乳糖-4-差向異構酶多肽包括具有UDP-半乳糖-4-差向異構酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性UDP-半乳糖-4-差向異構酶多肽和核酸包括具有UDP-半乳糖-4-差向異構酶多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。示例性半乳糖代謝核酸包括編碼具有半乳糖代謝多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性半乳糖代謝核酸包括(例如)從大腸桿菌K12MG1655或其衍生物中分離的半乳糖代謝基因；從銅綠假單胞菌菌株PAOl中分離的半乳糖代謝基因；以及從釀酒酵母中分離的半乳糖代謝基因。其他示例性的半乳糖代謝核酸可從腸桿菌科的任何屬中分離，包括例如Alishewanella、交替球菌屬、Aquamonas、朽1檬酸桿菌屬、克羅諾桿菌屬、愛德華氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬(如，肺炎克雷伯氏菌)、泛菌屬(如，檸檬泛菌)、變形桿菌屬(如，普通變形桿菌)、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬(如，粘質沙雷氏菌)、志賀氏菌屬、以及耶爾森菌屬(如，鼠疫耶爾森菌)。示例件鉬轉運子多肽和核酸由modF基因編碼的多肽是ABC超家族的融合鑰酸鹽轉運子亞基的非特征性成員。示例性的由modF編碼的多肽包括具有由modF編碼的多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的由modF編碼的多肽和核酸包括具有由modF編碼的多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。鑰轉運(modE)多肽的modABC操縱子的阻遏蛋白是調節蛋白，據信在存在鑰酸鹽的情況下，該調節蛋白反饋性抑制modABC操縱子的轉錄。示例性的由modE編碼的多肽包括具有由modE編碼的多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的由modE編碼的多肽和核酸包括具有由modE編碼的多肽的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。通過modA、modB和modC編碼的高親和力三聚體鑰轉運子蛋白是用于將鑰攝取進入細胞的膜相關ABC型轉運子體系。當modABC基因中的任何一者發生突變或缺失時，鑰酸鹽轉運通過ABC型硫酸鹽轉運體系或通過非特異性陰離子轉運子來完成，但效率低約100倍。(Self et al.，2001，Res. Microbiol. 152 :311-321 (Self 等人，2001 年，《微生物學研究》，第152卷第311-321頁))。示例性的由modABC編碼的多肽包括具有由modABC編碼的多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的由modABC編碼的多肽和核酸包括具有由modABC編碼的多肽的其中之一的至少一種活性的來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。
示例性的鑰轉運核酸包括編碼具有鑰轉運多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的鑰轉運核酸包括例如從大腸桿菌K12MG1655或其衍生物中分離的鑰轉運基因；從銅綠假單胞菌菌株PAOl中分離的鑰轉運基因；以及從釀酒酵母中分離的半乳糖代謝基因。其他示例性的鑰轉運核酸可從腸桿菌科的任何屬中分離，包括例如Alishewanella、交替球菌屬、Aquamonas、朽1檬酸桿菌屬、克羅諾桿菌屬、愛德華氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬(如，肺炎克雷伯氏菌)、泛菌屬(如，檸檬泛菌)、變形桿菌屬(如，普通變形桿菌)、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬(如，粘質沙雷氏菌)、志賀氏菌屬、以及耶爾森菌屬(如，鼠疫耶爾森菌)。示例件宿主細胞可使用大腸桿菌宿主細胞來表達本文所述方法中的異戊二烯合酶、PGL多肽、DXP途徑多肽、IDI和MVA途徑多肽。在一個方面，宿主細胞是能夠產生異戊二烯的大腸桿菌菌株的重組細胞或其子代，所述細胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細胞產生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細胞的滴度。在一些方面，宿主細胞是不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細菌細胞，該細胞還包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸。在一些方面，當將所述細菌細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生異源多肽的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細胞在培養物中。在一些方面，能夠具有生物活性的異源多肽包括在生物合成萜類化合物(類異戊二烯)或類胡蘿卜素化合物的過程中所涉及的一種或多種多肽，并且當將所述細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生萜類化合物或類胡蘿卜素的比產率高于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，所述方法還包括回收萜類化合物或類胡蘿卜素的步驟。在一些方面，宿主細胞是不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細菌細胞，該細胞還包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，當將所述細菌細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生異戊二烯的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，該細胞還包含MVA途徑多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自(i)乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自腸球菌屬。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自糞腸球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)； (iii) 二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，所述MVK多肽來自馬氏甲烷八疊球菌。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細胞在培養物中。在一些方面，所述細菌細胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細菌菌株屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面,所述細菌細胞屬于大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。示例性細胞培養基如本文所用，術語“基本培養基”是指包含對細胞可能生長的最少營養物質的生長培養基，其通常(但并非總是)不存在一種或多種氨基酸(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種氨基酸)。基本培養基通常包含(I)用于細菌生長的碳源；(2)各種鹽，其可根據細菌種類和生長條件而變化；以及⑶/K。碳源可能有很大的差異，從簡單的糖類(諸如葡萄糖)到其他生物質(諸如酵母提取物)的較為復雜的水解產物均可，如下文更為詳細的討論。鹽通常提供必需元素，例如鎂、氮、磷和硫，以使得細胞可合成蛋白質和核酸。基本培養基還可補充以諸如抗生素等選擇性試劑，用于有選擇地維持某些質粒等。例如，如果微生物對某種抗生素(例如氨芐青霉素或四環素)具有抗性，則可將該抗生素加入培養基以避免細胞在生長過程中缺乏抗性。如選擇期望的生理或生化特性所必需的，培養基可補充以其他化合物，例如特定的氨基酸等。可使用任何基本培養基配方來培養宿主細胞。示例性的基本培養基配方包括(例如)M9基本培養基和TM3基本培養基。每升的M9基本培養基包含(I) 200ml無菌M9鹽(每升有 64g Na2HP04-7H20、15g KH2PO4'2. 5g NaCl 和 5. Og NH4Cl) ； (2) 2ml 的 IM MgSO4 (無菌)；(3) 20ml的20% (w/v)葡萄糖(或其他碳源)；以及(4) 100 μ I的IM CaCl2 (無菌)。每升的 ΤΜ3 基本培養基包含(I) 13. 6g K2HPO4 ； (2) 13. 6g KH2PO4 ； (3) 2gMgS04*7H20 ； (4) 2g一水檸檬酸;(5)0. 3g檸檬酸鐵銨；(6) 3. 2g(NH4)2SO4 ； (7)0. 2g酵母提取物；以及(8) Iml的1000X痕量元素溶液；將pH調節到約6. 8，隨后將溶液過濾滅菌。每1000升中微量元素包含(l)40g—水檸檬酸；(2)30g MnSO4^H2O ； (3) IOg NaCl ; (4) Ig FeS04*7H20 ; (4) IgCoC12*6H20 ； (5) Ig ZnS04*7H20 ； (6) IOOmg CuS04*5H20 ； (7) IOOmg H3BO3 ；以及(8) IOOmgNaMo04*2H20 ;將 pH 調節至約 3· 0。任何碳源都可用于培養宿主細胞。術語“碳源”是指能夠被宿主細胞或生物體代謝的一種或多種含碳化合物。例如，用于培養宿主細胞的細胞培養基可包含任何適于維持生存能力或使宿主細胞生長的碳源。在一些方面，碳源是碳水化合物(例如單糖、二糖、低聚糖或多糖)、或轉化糖(如，通過酶促方法處理的蔗糖糖漿)。示例性的單糖包括葡萄糖和果糖；示例性的低聚糖包括乳糖和蔗糖，并且示例性的多糖包括淀粉和纖維素。示例性的碳水化合物包括C6糖(如，果糖、甘露糖、半乳糖、或葡萄糖)和C5糖(如，木糖或阿拉伯糖)。示例性細胞培養條件適于本發明的重組細胞的維持和生長的材料和方法在下文(如，在實例部分)中有所描述。適于細菌培養物的維持和生長的其他材料和方法是本領域眾所周知的。示例性 的技術可在國際專利公開No. W02009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、W02009/132220、美國專利公開 2010/0003716、Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtet al. , eds, American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1994)(〈〈普通細菌學方法手冊》，Gerhardt等人編輯，美國微生物學會出版，華盛頓哥倫比亞特區，1994年)或 Brock 的 Biotechnology A Textbook of Industrial Microbiology, SecondEdition (1989) Sinauer Associates, Inc.，Sunderland, MA (工業微生物學教材《生物技術》，第二版(1989年)，由位于馬薩諸塞州桑德蘭的Sinauer Associates有限公司出版)中找到。在一些方面，所述細胞在容許通過插入宿主細胞的核酸編碼的一種或多種異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑多肽或MVA途徑多肽表達的條件下的培養基中培養。可使用標準的細胞培養條件來培養細胞(參見例如WO 2004/033646和其中所引用的參考文獻)。在一些方面，細胞在適當的溫度、氣體混合物和PH下(例如在約20°C至約37°C、在約6%至約84%的CO2以及在介于約5至約9的pH下)生長并保持在所述條件下。在一些方面，細胞在適當的細胞培養基中于35°C下生長。在一些方面，發酵的pH范圍介于約pH 5. O至約pH 9. O之間(例如，約pH 6. O至約pH 8. O、或約pH 6. 5至約7. 0)。根據宿主細胞的需求，所述反應可在有氧、缺氧或無氧條件下進行。可以使用的標準培養條件和發酵方式(諸如分批發酵、分批補料發酵或連續發酵)在國際專利公開No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335,071 (美國專利公開No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、WO 2009/132220、美國專利公開No. 2010/0003716中有所描述。分批發酵和分批補料發酵是常見的，并且為本領域所熟知，其實例可在Brock的Biotechnology :ATextbook of IndustrialMicrobiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc.(工業微生物學教材《生物技術》，第二版(1989年)，Sinauer Associates有限公司)中找到。在一些方面，細胞在葡萄糖受限制的條件下培養。所謂“葡萄糖受限制的條件”，是指加入的葡萄糖的量小于或為約105% (例如約100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、
或10% )被細胞消耗的葡萄糖的量。在特定的方面，加入培養基的葡萄糖的量與在特定的時間內細胞所消耗的葡萄糖的量大致相同。在一些方面，通過限制加入的葡萄糖的量來控制細胞生長的速率，使得細胞以能夠被細胞培養基中的葡萄糖的量所支持的速率生長。在一些方面，葡萄糖沒有在培養細胞的時間內積累。在各種方面，細胞在葡萄糖受限制的條件下培養超過或約1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60或70小時。在各種方面，細胞在葡萄糖受限制的條件下培養超過或約5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95或100%的細胞培養總時間長度。盡管無意于受任何具體理論的限制，但據信葡萄糖受限制的條件可更有利于對細胞進行管理。在一些方面，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一種或多種組分。在一些方面，酵母提取物的濃度是 O. I % (w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)或 0.01% (w/v)酵母提取物。在一些方面，碳源不僅包括酵母提取物(或其一種或多種組分)，還包括另外的碳源(諸如葡萄糖)。在一些方面，大腸桿菌細胞在分批培養物中生長。在一些方面，大腸桿菌細胞在分批補料培養物中生長。在一些方面，大腸桿菌細胞在連續培養物中生長。在一些方面，大腸 桿菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，基本培養基是M9培養基或TM3培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基。在一些方面,基本培養基是TM3培養基。在一些方面,使用1.0% (w/v)或更少的葡萄糖來補充基本培養基。在一些方面,使用I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7% (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5% (w/v) >0. 4% (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2%(w/v)或0. 1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養基。在某些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用O. 1% (w/v), O. 09% (w/v), O. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)、或0. 01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及0.1% (w/v)或更少來補充基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6% (w/v) >0. 5% (w/v) >0. 4% (w/v) >0. 3% (w/v) >0. 2%(w/v)或 0. 1% (w/v)的葡萄糖和 0.1% (w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v)、0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)或 0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。本發明涵蓋能夠產生異戊二烯的大腸桿菌菌株的重組細胞，所述細胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在整合之前，大腸桿菌細胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細胞產生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細胞的該滴度。在一些方面，宿主細胞是不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細菌細胞，該細胞還包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，宿主細胞是不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽、由半乳糖代謝基因轉錄的多肽(例如，galM、galK、galT和galE)或由鑰酸鹽轉運基因轉錄的多肽(例如，modF、modE、modA、modB和modC)的大腸桿菌菌株的細菌細胞，該細胞還包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝、編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的一個或多個拷貝的異源核酸，以及編碼一種或多種鑰酸鹽轉運子多肽的一個或多個拷貝的異源核酸。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個拷貝、和/或編碼一種或多種鑰酸鹽轉運多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面,所述細菌細胞屬于大 腸桿菌菌株B。在一些方面,所述細菌菌株屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細菌細胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。在一些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充所述基本培養基。在一些方面，使用I. 0%(w/v)或更少的葡萄糖來補充基本培養基。在一些方面,使用I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8%(w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v) >0. 4 % (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2 % (w/v)或0. 1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養基。在某些方面，使用0. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用O. 1% (w/v), O. 09% (w/v), O. 08% (w/v) ,0. 07%(w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05 % (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02 % (w/v)、或 0. 01 %(w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及O. I % (w/v)或更少來補充基本培養基。在一些方面，使用I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8%(w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v) >0. 4 % (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2 % (w/v)或0. I % (w/v)的葡萄糖和 0.1% (w/v) >0. 09 % (w/v) >0. 08 % (w/v) >0. 07 % (w/v) >0. 06 %(w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)或 0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基或TM3培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基。在一些方面，基本培養基是TM3培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基。在一些方面，基本培養基是TM3培養基。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，該細胞還包含MVA途徑多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自(i)乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自腸球菌屬。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自糞腸球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)；(iii) 二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，所述MVK多肽來自馬氏甲烷八疊球菌。當將本文所述的重組細菌細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生異戊二烯的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些情況下，編碼PGL多肽的異源基因是整合到宿主細胞的染色體內的編碼PGL多肽的異源核酸。在一些方面，當將所述細菌細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生異戊二烯的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個拷貝、和/或編碼一種或多種鑰酸鹽轉運多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約5、6、7、8、9、10、11、12、13或14mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約16mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約17mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約18mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約19mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約20mg/Lsa/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約21mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約22mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約23mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約24mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞 具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產率。在其他方面，所述大腸桿菌細胞具有約25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、或5mg/0D/h的異戊二烯比產率的上限。在其他方面，所述大腸桿菌細胞具有約 5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、*25mg/0D/h
的異戊二烯比產率的下限。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約16mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約17mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約18mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約19mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約21mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約22mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約23mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約24mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且細胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼IDI多肽的內源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的內源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途徑多肽的一種或多種核酸。在一些方面，一種核酸編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，一種質粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，多種質粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些情況下，異戊二烯合酶多肽可以是內源異戊二烯合酶的一個或多個拷貝。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自山葛的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊的天然存在的多肽。可用于實踐本發明的其他異戊二烯合酶多肽或異戊二烯合酶變體包括但不限于如在WO 2009/132220或WO 2010/124146中所述的異戊二烯合酶、其變體和/或異戊二烯合酶突變體(所述專利的內容全文以引用方式 并入，特別是與異戊二烯合酶、其變體和/或異戊二烯合酶突變體相關的內容)。
_3] 增大異戊二烯產暈的方法生物反應器中的遺傳工程細胞培養物更有效地產生異戊二烯，所述異戊二烯的量更大、純度更高和/或具有獨特的雜質分布，由可再生資源產生商業用途量的異戊二烯的方法在例如國際專利申請公開No. W02009/076676A2、美國專利申請公開No. US2009/0203102A1, US2010/0003716A1, US2010/0048964A1, US2010/0086978A1,US2010/0167370A1、US2010/0113846A1、US2010/0184178A1、US2010/016737IAUUS2010/0196977A1、US2010/0196977A1、以及美國臨時專利申請 No. 61/187，930、61/187，941和61/187，959中進行描述和例證。本文還提供用于產生異戊二烯的改良方法。在一些方面，產生異戊二烯的改良方法包括(a)培養能夠產生異戊二烯的包含大腸桿菌菌株的重組細胞或其子代的組合物，所述細胞包含(i)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；以及(ii)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細胞產生的異戊二烯的滴度大于不包含(i)和(ii)的相同細胞的該滴度，以及(b)產生異戊二烯。在一些方面，產生異戊二烯的改良方法包括以下步驟(a)在基本培養基中培養不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細菌細胞，其中所述大腸桿菌細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸；以及(b)產生異戊二烯，其中將所述大腸桿菌細胞培養在基本培養基中時，所述細胞具有的異戊二烯比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，產生異戊二烯的改良方法還包括回收異戊二烯的步驟。在一些方面,產生異戍二烯的改良方法包括在適于產生異戍二烯的條件下培養本文所述的重組細胞以及使所述重組細胞產生異戊二烯的步驟。在一些方面，產生異戊二烯的改良方法還包括回收異戊二烯的步驟。不受理論的約束，具有編碼PGL多肽的染色體整合的異源核酸的重組細胞產生的異戊二烯的滴度和比產率高于異源PGL核酸位于質粒上的細胞的該滴度和比產率。出人意料地，包含染色體整合的PGL多肽的一個或多個拷貝、以及任選地具有通過染色體整合的半乳糖代謝基因(例如，galM、galK、galT和galE)編碼的一種或多種多肽的一個或多個拷貝、和/或通過染色體整合的鑰轉運基因(例如,1110(^、1]10(^、1]10(^、1]10(113和modC)編碼的一種或多種多肽的一個或多個拷貝的重組細胞傳達了可觀的細胞生長收益相比質粒上包含異源PGL核酸的細胞，其產生滴度更高的異戊二烯、和/或比產量更高的異戊二烯。因此，在一個方面，產生異戊二烯的改良方法包括以下步驟(a)培養不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽、通過用于半乳糖代謝的基因(例如，galM、galK、galT和galE)編碼的一種或多種多肽和/或通過用于鑰轉運的基因n^l^n,modF、modE、modA、modB和modC)編碼的一種或多種多肽的大腸桿菌菌株的細菌細胞，其中所述大腸桿菌細胞包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的染色體整合的異源基因的一個或多 個拷貝、編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽和/或一種或多種鑰轉運多肽的染色體整合的異源核酸的一個或多個拷貝；以及(b)產生異戊二烯，其中所述大腸桿菌細胞較之其中編碼PGL的異源基因位于質粒上的相同細胞，具有更高的比生長速率、異戊二烯比產率、和/或產生的異戊二烯的滴度。在一些方面，該細胞還包含MVA途徑多肽。在這種情況下，本發明還設想了制備甲羥戊酸的組合物和方法。使用染色體整合的PGL宿主細胞體系來產生甲羥戊酸的方法可任選地包括回收甲羥戊酸。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑上游的多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游的多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽選自⑴乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽；( ) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽是乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)。在一些方面，MVA途徑上游的多肽是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游的多肽是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶。在一些方面，MVA途徑上游的多肽來自細菌。在一些方面，細菌來自腸球菌屬。在一些方面，細菌來自糞腸球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVK。在一些方面，所述MVK來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，所述甲烷八疊球菌是馬氏甲烷八疊球菌。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是PMK、MVD或IDI。在一些方面，PMK、MVD或IDI來自酵母屬(Saccharomyces)。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是PMK。在一些方面，PMK來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是MVD。在一些方面，MVD來自酵母屬。在一些方面,所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，MVA途徑下游的多肽是IDI。在一些方面，MVA途徑下游的多肽來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，異戊二烯合酶多肽來自植物。在一些方面，該植物是野葛(kudzu)。在一些方面，該植物是楊樹(poplar)(銀白楊X歐洲山楊(tremula) CAC35696)。在一些方面，該植物是白楊(aspen)(美洲山楊(Populus tremuloides))。在一些方面，該植物是英國橡樹(歐洲櫟(Quercus robur))。在一個方面,該植物是銀白楊。可用于實踐本發明的其他異戊二烯合酶多肽或異戊二烯合酶變體包括但不限于如在W02009/132220或WO2010/124146中所述的異戊二烯合酶、其變體和/或異戊二烯合酶突變體(所述專利的內容全文以引用方式并入，特別是與異戊二烯合酶、其變體和/或異戊二烯合酶突變體相關的內容)。在一些方面，大腸桿菌細胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，大腸桿菌細胞還包含編碼IDI多肽的內源核酸的一個或多個拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼IDI多肽的內源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的內源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述大腸桿菌細胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途徑多肽的一種或多種核酸。在一些方面，一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，一種質粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，多種質粒編 碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽，以及DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽為序列標識號11。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標識號11相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標識號11相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85% 的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽為序列標識號12。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽與序列標識號12相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標識號12相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽為序列標識號13。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽與序列標識號13相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株 MG1655 多肽與序列標識號 13 相比具有 99 % ,98 % ,97 % ,96 % ,95 % ,95 % ,93 % ,92 %,91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株的細菌細胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面，所述細菌細胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面,所述細菌細胞屬于大腸桿菌菌株 BL21(DE3)。在一些方面，大腸桿菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，大腸桿菌菌株B的大腸桿菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21的大腸桿菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21 (DE3)的大腸桿菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，使用 I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7% (w/v) >0. 6% (w/v) >0. 5% (w/v)、0. 4% (w/v) >0. 3% (w/v) >0. 2% (w/v)或0.1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養基。在某些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用O. 1%(w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v),0. 03% (w/v),0. 02% (w/v)、或0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及O. 1% (w/v)或更少來補充基本培養基。在一些方面，使用 I % (w/v) >0. 9 % (w/v) >0. 8 % (w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v)、0. 4% (w/v)、0. 3% (w/v)、0. 2% (w/v)或 0. I % (w/v)的葡萄糖和 0. I % (w/v)、0· 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v)、0. 02% (w/v)或0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基或TM3培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基。在一些方面，基本培養基是TM3培養基。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約15mg/Lw/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約16mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約17mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約18mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約19mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約21mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約22mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約23mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約24mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，所述大腸桿菌細胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約16mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約17mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約18mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約19mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約20mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約21mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約22mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約23mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約24mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約25mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約25mg/0D/h至約100mg/0D/h的異戊二烯比產率。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至啟動子，并且大腸桿菌細胞具有大于約15mg/0D/h至約100mg/0D/h的異戊二烯比產率。本發明還提供已被工程化以產生異戊二烯的具有PGL整合的重組大腸桿菌細胞，由于它們具有提高的綜合適應度，故也具有較佳的生長。本領域的技術人員可以認識到，生長速率增大可導致異戊二烯產量提高，例如更高的比活性、在一段時間內產生更多的異戊 二烯、或更高的異戊二烯滴度。在一個方面，已被工程化以產生異戊二烯的具有PGL整合的重組大腸桿菌細胞同不具有PGL整合和/或如本文所述修復的17，257堿基對片段(參見例如圖20)的那些細胞相比具有至少10%增加的生長。在其他方面，已被工程化以產生異戊二烯的具有PGL整合的重組大腸桿菌細胞同不具有PGL整合和/或如本文所述修復的17，257堿基對片段的那些細胞相比具有至少約11 %、12 %、13 %、14 %、15 %、16 %、17 %、18%,19%,20%,21%,22%,23%,24%^； 25%的生長。增大能夠具有生物活性的其他異源多肽產暈的方法本文還提供用于產生能夠具有生物活性的其他異源多肽或其他產物的改良方法。產物的一個非限制性例子是甲羥戊酸。本領域的技術人員可通過以下步驟制備甲羥戊酸(a)培養能夠產生異戊二烯的包含大腸桿菌菌株的重組細胞或其子代的組合物，所述細胞包含(i)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在大腸桿菌染色體中；(ii)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸；以及(iii) (c)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸；其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且其中所得的重組細胞在適于產生甲羥戊酸的培養條件下產生的異戊二烯的滴度大于不包含(i)和(ii)的相同細胞的該滴度，以及(b)產生甲羥戊酸。在一些方面，產生能具有生物活性的異源多肽的改良方法包括以下步驟(a)培養不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細胞，該細胞還包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能具有生物活性的異源多肽的核酸；以及(b)產生異源多肽，其中當將所述大腸桿菌細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生異源多肽的比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細胞在培養物中。在一些方面，產生能夠具有生物活性的異源多肽的改良方法還包括回收多肽的步驟。在一些方面，不編碼PGL多肽的大腸桿菌菌株的細菌細胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面，所述細菌細胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面,所述細菌細胞屬于大腸桿菌菌株 BL21(DE3)。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽為序列標識號11。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標識號11相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與序列標識號11相比具有99%,98%,97%,96%,95%,95%,93%,92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85% 的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽為序列標識號12。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽與序列標識號12相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的銅綠假單胞菌多肽與序列標識號12相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽的異源基因來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽為序列標識號13。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽與序列標識號13相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的大腸桿菌K12菌株 MG1655 多肽與序列標識號 13 相比具有 99 % ,98 % ,97 % ,96 % ,95 % ,95 % ,93 % ,92 %,91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85% 的氨基酸序列同一性。在一些方面，不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽的大腸桿菌菌株的細菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，大腸桿菌菌株B的細菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21的細菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21(DE3)的細菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8%(w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v) >0. 4 % (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2 % (w/v)或
0.1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養基。在某些方面，使用0. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用O. 1% (w/v), O. 09% (w/v), O. 08% (w/v) ,0. 07%(w/v) >0. 06 % (w/v) >0. 05 % (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03 % (w/v) >0. 02% (w/v)、或 0. 01 %(w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及
O.I % (w/v)或更少來補充基本培養基。在一些方面，使用I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8%(w/v) >0. 7 % (w/v) >0. 6 % (w/v) >0. 5 % (w/v) >0. 4 % (w/v) >0. 3 % (w/v) >0. 2 % (w/v)或
0.I % (w/v)的葡萄糖和 0.1% (w/v) >0. 09 % (w/v) >0. 08 % (w/v) >0. 07 % (w/v) >0. 06 %(w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)或 0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基或TM3培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基。在一些方面，基本培養基是TM3培養基。本文還提供產生能夠具有生物活性的其他異源多肽的改良方法。在一些方面，產生能具有生物活性的異源多肽的改良方法包括以下步驟(a)培養不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的基因(例如，galM、galK、gall^PgalE)和/或編碼一種或多種鑰轉運子多肽的基因n^l^n,modF、modE、modA、modE^[ImodC)的大腸桿菌菌株的細胞，該細胞還包含使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝和編碼能夠具有生物活性的異源多肽的核酸、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個拷貝、和/或編碼一種或多種鑰轉運多肽的異源基因的一個或多個拷貝；以及(b)產生異源多肽，其中當將所述大腸桿菌細胞培養在基本培養基中時，所述細胞具有的異源多肽比產率大于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個拷貝、和/或編碼一種或多種鑰轉運多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽 的異源基因的一個或多個拷貝、編碼一種或多種半乳糖代謝多肽的異源基因的一個或多個 拷貝、和/或編碼一種或多種鑰轉運子多肽的異源基因的一個或多個拷貝是染色體拷貝(如，整合到大腸桿菌染色體中)。在一些方面，大腸桿菌細胞在培養物中。在一些方面，產生能夠具有生物活性的異源多肽的改良方法還包括回收多肽的步驟。在一些方面，不編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝基因、和/或一種或多種鑰轉運基因的大腸桿菌菌株的細菌細胞屬于大腸桿菌菌株B。在一些方面，所述細菌細胞屬于大腸桿菌菌株BL21。在一些方面，所述細菌細胞屬于大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。在一些方面，編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝基因、和/或一種或多種鑰轉運基因的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655。在一些方面，編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝基因、和/或一種或多種鑰轉運基因的異源基因來自大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉運活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與天然的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉運活性的大腸桿菌K12菌株MG1655多肽與天然的大腸桿菌K12 菌株 MG1655 多肽相比具有 99%,98%,97%,96%,95%,95%,93%,92%,91%,90%,89%、88%、87%、86%或85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝多肽、和/或一種或多種鑰轉運多肽的異源基因來自假單胞菌屬。在一些方面，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉運活性的銅綠假單胞菌多肽與天然的銅綠假單胞菌多肽相比包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉運活性的銅綠假單胞菌多肽與天然的銅綠假單胞菌多肽相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85% 的氨基酸序列同一性。在一些方面，編碼PGL多肽、一種或多種半乳糖代謝多肽、和/或一種或多種鑰轉運多肽的異源基因來自酵母屬。在一些方面，所述酵母是釀酒酵母。在一些方面，具有PGL活性、半乳糖代謝活性、和/或鑰轉運活性的釀酒酵母多肽與天然的釀酒酵母相比包含I、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個或更多個氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代是保守性的。在一些方面，所述氨基酸取代是非保守性的。在一些方面，具有PGL活性的釀酒酵母多肽與天然的釀酒酵母多肽相比具有99%、98%、97%、96%、95%、95%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%或 85%的氨基酸序列同一性。在一些方面，不編碼6-磷酸葡萄糖酸內酯酶(PGL)多肽、一種或多種半乳糖代謝多肽、和/或一種或多種鑰轉運多肽的大腸桿菌菌株的 細菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，大腸桿菌菌株B的細菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21的細菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，大腸桿菌菌株BL21(DE3)的細菌細胞被培養在基本培養基中。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖來補充所述基本培養基。在一些方面，使用 I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7% (w/v) >0. 6% (w/v) >0. 5% (w/v) >0. 4% (w/v) >0. 3% (w/v) >0. 2% (w/v)或 0.1% (w/v)的葡萄糖來補充基本培養基。在某些方面，使用O. 1% (w/v)或更少的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用 0.1% (w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05%(w/v) >0. 04% (w/v) >0. 03% (w/v) >0. 02% (w/v)、或 0. 01 % (w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，使用1% (w/v)或更少的葡萄糖以及O. 1% (w/v)或更少來補充基本培養基。在一些方面，使用 I % (w/v) >0. 9% (w/v) >0. 8% (w/v) >0. 7% (w/v) >0. 6% (w/v) >0. 5% (w/v) >0. 4% (w/v) >0. 3% (w/v) >0. 2% (w/v)或 0.1% (w/v)的葡萄糖和 0.1%(w/v) >0. 09% (w/v) >0. 08% (w/v) >0. 07% (w/v) >0. 06% (w/v) >0. 05% (w/v) >0. 04% (w/v),0. 03% (w/v),0. 02% (w/v)或0.01% (w/v)的酵母提取物來補充基本培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基或TM3培養基。在一些方面，基本培養基是M9培養基。在一些方面，基本培養基是TM3培養基。在一些方面，能夠具有生物活性的異源多肽包括在生物合成萜類化合物(類異戊二烯)或類胡蘿卜素化合物的過程中所涉及的一種或多種多肽，并且當將所述細胞培養在基本培養基中時，所述細胞產生萜類化合物或類胡蘿卜素的比產率高于缺乏使用一種或多種相關的表達控制序列編碼PGL多肽的異源基因的一個或多個拷貝的相同細胞的該比產率。在一些方面，所述方法還包括回收萜類化合物或類胡蘿卜素的步驟。如本文所用，術語“萜類化合物”或“類異戊二烯”是指類似于萜烯的一大類各種各樣的天然存在的有機化學物質。萜類化合物源自以多種方式組裝和修飾的五碳異戊二烯單元，并且以組成員中使用的異戊二烯單元的數目為基礎進行分類。半萜具有一個異戊二烯單元。單萜具有兩個異戊二烯單元。倍半萜具有三個異戊二烯單元。二萜具有四個異戊二烯單元。二倍半萜具有五個異戊二烯單元。三萜具有六個異戊二烯單元。四萜具有八個異戊二烯單元。多萜具有多于八個異戊二烯單元。本領域的普通技術人員將能識別能夠具有生物活性(如，能夠通過組裝適當數量的異戊二烯單元并根據情況對它們進行修飾而制備各種類型的萜類化合物)的異源多肽。如本文所用，術語“類胡蘿卜素”是指在植物、一些其他光合生物體(諸如藻類)的葉綠體和成色素細胞中、在一些類型的真菌中、以及在一些細菌中產生的一組天然存在的有機色素。類胡蘿卜素包括含氧的葉黃素和不含氧的胡蘿卜素。
在一些方面,所述職類化合物選自半職、單職、倍半職、二職、二倍半職、三職、四職和更高級的多萜。在一些方面，所述半萜是異戊烯醇(即，3-甲基-2-丁烯-I-醇)、異戊二烯醇(即，3-甲基-3- 丁烯-I-醇)、2_甲基-3- 丁烯-2-醇、或異戊酸。在一些方面，所述單萜是香葉基焦磷酸、桉葉油素、檸檬烯、或菔烯。在一些方面，所述倍半萜是法尼基焦磷酸、青蒿素、或紅沒藥醇。在一些方面，所述二萜是香葉基香葉基焦磷酸、視黃醇、視黃醛、葉綠醇、紫杉酚、毛喉素、或阿非迪霉素。在一些方面，所述三萜是角鯊烯或羊毛留醇。在一些方面，所述四萜是番茄紅素或胡蘿卜素。在一些方面，所述類胡蘿卜素選自葉黃素和胡蘿卜素。在一些方面，所述葉黃素為葉黃質或玉米黃質。在一些方面，所述胡蘿卜素是α-胡蘿卜素、β_胡蘿卜素、Y-胡蘿卜素、β_隱黃質或番茄紅素。在一些方面，能具有生物活性的異源多肽的來源生物體是真菌。在一些方面，真菌是諸如米曲霉(A. oryzae)和黑曲霉(A. niger)的曲霉屬菌種、諸如釀酒酵母的酵母屬菌種、諸如裂殖酵母(S. pombe)的裂殖酵母屬菌種、或諸如瑞氏木霉(T. reesei)的木霉屬菌種。在一些方面，能具有生物活性的異源多肽的來源生物體是絲狀真菌細胞。在一些方面，所述絲狀真菌細胞來自長枝木霉(Trichoderma Iongibrachiatum)、綠色木霉(T. viride)、康氏木霉(T. koningii)、哈茨木霉(T. harzianum)、海泥青霉(Penicillium sp·)、特異腐質霉(Humicola insolens)、疏棉狀腐質霉(H. Ianuginose)、灰腐質霉(H. grisea)、金孢 霉(Chrysosporium sp.)、C. lucknowense、粘帚霉(Gliocladium sp·),曲霉屬諸如米曲霉、黑曲霉、醬油曲霉(A. sojae)、日本曲霉(A. japonicus)、構巢曲霉(A. nidulans)或泡盛曲霉(A. awamori),鐮孢菌屬(Fusarium sp.)諸如粉紅鐮刀菌(F. roseum)、禾谷鐮刀菌(F. graminum)、F. cerealis、大豆根腐病菌(F. oxysporuim)或腐皮鐮刀菌(F. venenatum),鏈孢霉菌屬(Neurospora sp.)諸如粗糙鏈孢霉(N. crassa)、肉座菌屬(Hypocrea sp.)、毛霉屬(Mucor sp.)諸如米黑毛霉(M. miehei)、根霉屬菌(Rhizopus sp.)或泡波曲霉屬(Emericella sp.)。在一些方面，真菌是構巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A. aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、瑞氏木霉、綠色木霉、尖鐮孢霉(F. oxysporum)或腐皮鐮孢霉(F. solani)。在一些方面,來源生物體是酵母,例如酵母屬(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces sp.)、畢赤酵母屬(Pichia sp.)或假絲酵母屬(Candidasp.)。在一些方面，所述酵母屬是釀酒酵母。在一些方面，能具有生物活性的異源多肽的來源生物體是細菌。在一些方面，細菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),諸如地衣芽孢桿菌(B. Iichenformis)或枯草芽孢桿菌(B. subtilis);泛菌屬，諸如朽1檬假交替單胞菌(P. citrea);假單胞菌屬，諸如產堿假單胞菌(P. alcaligenes)、惡臭假單胞菌(P. putida)或螢光假單胞菌(P. fluorescens);鏈霉菌屬(Streptomyces),諸如變鉛青鏈霉菌(S. Iividans)、天藍色鏈霉菌(S. coelicolor)、灰色鏈霉菌(S. griseus)或銹赤鏈霉菌(S. rubiginosus);棒狀桿菌屬(Corynebacterium),諸如谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum);紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas),諸如沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；或埃希氏菌屬(Escherichia),諸如大腸桿菌。在一些方面，細菌選自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(B. Ientus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)、嗜喊芽抱桿菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(B. amyIoIiquefaciens)、克勞氏芽抱桿菌(B. clausii)、耐喊芽抱桿菌(B. halodurans)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、凝結芽孢桿菌(B. coagulans)、環狀芽孢桿菌(B. circulans)、燦爛芽抱桿菌(B. Iautus)和蘇云金芽抱桿菌(B. thuringiensis)。在一些方面，來源生物體是植物，例如來自豆科(Fabaceae)(諸如蝶形花亞科(Faboideae))的植物。在一些方面，來源生物體是野葛、楊樹(例如銀白楊或銀白楊x歐洲山楊CAC35696)、白楊(例如美洲山楊)或歐洲櫟。在一些方面，來源生物體是藻類，例如綠藻(green algae)、紅藻(red algae)、灰藻(glaucophytes)、chlorarachniophytes、眼蟲藻(euglenids)、假菌界(chromista)或溝鞭藻類(dinoflagellates)。在一些方面,來源生物體是藍細菌(cyanobacterium),例如基于形態歸類到以下任意組的藍細菌綠球藻目(Chlorococcales)、寬球藻目(Pleurocapsales)、_藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或多列藻目(Stigonematales)。由可再生資源產生的異戊二烯組合物由可再生資源產生的異戊二烯組合物有別于石油-異戊二烯組合物，這是因為 由可再生資源產生的異戊二烯是與其他生物副產物(源自生物來源和/或與伴隨異戊二烯一起獲得的生物過程相關的化合物)一起產生的，所述生物副產物諸如醇、醛、酮等在石油-異戊二烯組合物中不存在或以低得多的含量存在。所述生物副產物可包括但不限于乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯酮、2-甲基-2-乙烯基噁丙環、順式和反式3-甲基-1，3-戊二烯、C5異戊烯醇(例如3-甲基-3-丁烯-I-醇或3-甲基_2_ 丁烯-I-醇)、2_庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、二乙酰、2- 丁酮、2-甲基-3- 丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I-丁醛、3-甲基-2-丁酮、I-丁醇、2-戊酮、3-甲基-I-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、3-甲基-3- 丁烯-I-基乙酸酯、3-甲基-2- 丁烯-I-基乙酸酯、3-己烯-I-醇、3-己烯-I-基乙酸酯、檸檬烯、香葉醇(反式_3，7-二甲基-2，6-辛二烯-I-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-I-醇)、(E)_3，7_ 二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、或線性異戊二烯聚合物(例如源自多個異戊二烯單元的聚合反應的線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三聚體)。衍生自由可再生資源產生的異戊二烯的產物包含生物副產物或由任意所述副產物衍生的化合物中的一種或多種。此外，衍生自由可再生資源產生的異戊二烯的產物可包含在隨后的化學轉化過程中由這些副產物所形成的化合物。此類化合物的例子包括衍生自親二烯體至異戊二烯的Diels-Alder環加成反應、或異戊二烯的氧化的那些化合物。由可再生資源產生的、包含特定副產物或雜質的異戊二烯組合物在美國臨時專利申請No. 61/187，959和WO 2010/14825中有更詳細地描述。通過將編碼異戊二烯合酶多肽(如，植物異戊二烯合酶多肽)、DXS多肽、其他DXP途徑多肽和/或MVA途徑多肽的異源核酸引入到細胞內能大大地增加由細胞產生的異戊二烯的量，例如，如國際專利申請公開No. W02009/076676A2、美國專利申請No. 12/335，071、美國專利申請 No. 12/429，143、12/496，573、12/560，390、12/560，317、12/560，370、12/560，305 和 12/560，366，美國臨時專利申請 No. 61/187，930,61/187, 941,61/187, 959，以及美國專利公開No. 2010/0196977和WO 2010/078457中所述。示例性的異戊二烯合酶多肽(如，植物異戊二烯合酶多肽)、DXS、DXP途徑或MVA途徑多肽和核酸包括來自本文所述任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。示例性異戊二烯合酶多肽和核酸在一些方面，大腸桿菌細胞包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸來自豆科，例如蝶形花亞科。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸是來自以下植物的多肽或核酸山葛(野葛)(Sharkey et al. , Plant Physiology137 :700-712, 2005 (Sharkey 等人，《植物生理學》，第 137 卷第 700-712 頁，2005 年))、葛根(Pueraria Iobata)、楊樹(例如銀白楊、黑楊(Populus nigra)、毛果楊(Populustrichocarpa)、或銀白楊 X 歐洲山楊(CAC35696) (Miller et al. , Planta 213:483-487,2001 (Miller等人，《植物學》，第213卷第483-487頁，2001年))、白楊(例如美洲山楊)(Silver et al.，JBC270 (22) : 13010-1316，1995 (Silver 等人，《生物化學雜志》，第 270卷第22期第13010-1316頁，1995年))、或者英國橡樹(歐洲櫟)(Zimmer等人，WO 98/02550)。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸是天然存在的異戊二烯合酶多肽或核酸。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸是非天然存在的異戊二烯合酶多肽或核酸。示例性的異戊二烯合酶多肽和核酸以及測量異戊二烯合酶活性的方法在國際專利公開No. W02009/076676、 美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公開No. 2009/0203102)、W0 2010/003007、美國專利公開No. 2010/0048964,W02009/132220以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細地描述。示例件DXS多狀和核酸示例性DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用標準方法(例如本文所述的那些)通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉化為I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及測量DXS活性的方法在國際專利公開 No. W02009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細地描述。示例件DXP涂徑多肽和核酸示例性DXP途徑多肽包括但不限于下列多肽中的任何一種DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽、IDI多肽以及具有DXP途徑多肽的一種、兩種、或多種活性的多肽(如，融合多肽)。具體地講，DXP途徑多肽包括具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性DXP途徑核酸包括編碼具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXP途徑多肽和核酸包括來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。示例性DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用標準方法(例如本文所述的那些)通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉化為I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及測量DXS活性的方法在國際專利公開 No. W02009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細地描述。具體地講，DXS多肽將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉化為1_脫氧-d_木酮糖-5-磷酸(DXP)。可使用標準方法通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內轉化丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。DXR多肽將I-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)轉化為2-C-甲基-D-赤蘚醇_4_磷酸(MEP)。可使用標準方法通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內轉化DXP的能力來確定多肽是否具有DXR多肽活性。MCT多肽將2-C-甲基-D-赤蘚醇_4_磷酸(MEP)轉化為4_(胞苷_5 ' - 二磷酸)-2-甲基-D-赤蘚醇(CDP-ME)。可使用標準方法通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內轉化MEP的能力來確定多肽是否具有MCT多肽活性。CMK多肽將4-(胞苷-5丨-二磷酸)-2_C_甲基-D-赤蘚醇(OTP-ME)轉化為2_ 二 磷酸4-(胞苷-5' - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(⑶P-MEP)。可使用標準方法通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內轉化CDP-ME的能力來確定多肽是否具有CMK多肽活性。MCS多肽將2-磷酸-4-(胞苷-5' - 二磷酸)-2_C_甲基-D-赤蘚醇(CDP-MEP)轉化為2-C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。可使用標準方法通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內轉化CDP-MEP的能力來確定多肽是否具有MCS多肽活性。HDS多肽將2-C-甲基_D_赤蘚醇_2，4_環二磷酸轉化為(E)_4_羥基_3_甲基丁 -2-烯-I-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。可使用標準方法通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內轉化ME-CPP的能力來確定多肽是否具有HDS多肽活性。HDR多妝將(E) _4_輕基-3-甲基丁 -2-稀_1_基二憐酸轉化為異戍稀基二憐酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。可使用標準方法通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內轉化HMBPP的能力來確定多肽是否具有HDR多肽活性。IDI多肽將異戊烯基二磷酸轉化為二甲基烯丙基二磷酸。可使用標準方法通過測定多肽在體外、細胞提取物內或體內轉化異戊烯基二磷酸的能力來確定多肽是否具有IDI多肽活性。示例件IDI多肽和核酸異戊烯基二磷酸異構酶多肽(異戊烯基二磷酸-δ -異構酶或IDI)促成異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的互變(如，將IPP轉化為DMAPP和/或將DMAPP轉化為IPP)。示例性IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用標準方法(例如本文所述的那些)通過測量多肽在體外、細胞提取物內或體內使IPP和DMAPP互變的能力來確定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI多肽和核酸以及測量IDI活性的方法在國際專利公開No. W02009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開No. 2010/0048964、W02009/132220以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細地描述。示例件MVA涂徑多肽和核酸示例性MVA途徑多肽包括乙酰輔酶A乙酰轉移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3_羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)多肽、甲羥戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC)多肽、異戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽，以及具有兩種或更多種MVA途徑多肽的活性的多肽(例如，融合多肽)。具體地講，MVA途徑多肽包括具有MVA途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途徑多肽和核酸以及測量IDI活性的方法在國際專利公開 No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、W02010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716中有更詳細地描述。 在一些方面,所述細胞包含MVA途徑上游,所述MVA途徑上游包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶以及HMG-CoA還原酶核酸。在一些方面，所述細胞包含MVA途徑下游，所述MVA途徑下游包含MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些方面，所述細胞包含整個MVA途徑，所述整個MVA途徑包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA還原酶、MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些方面，所述細胞包含整個MVA途徑，所述整個MVA途徑包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA 還原酶、MVK、PMDC, IPK 和 IDI 核酸。本文所述的大腸桿菌細胞也可用于產生異戊二烯和副產物(諸如氫氣、乙醇、或丙二醇(如，1，2_丙二醇或1，3_丙二醇))的改良方法。示例性氫化酶多肽和核酸、與產生發酵副產物有關的基因的多肽和核酸、以及與氫氣再攝取相關的基因的多肽和核酸也可與本文所述的組合物和方法一起使用。這些多肽和核酸在美國專利公開No. 2010/0196977和W02010/078457中有所描述。公離核酸的示例性方法使用標準方法可分離異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉錄因子核酸。從所關注的來源生物體(例如細菌基因組)中獲得期望的核酸的方法是分子生物學領域常見和眾所周知的(參見例如WO 2004/033646和其中所引用的參考文獻)。分離核酸的標準方法，包括已知序列的PCR擴增、核酸的合成、基因組文庫的篩選、粘粒文庫的篩選，在國際專利公開No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、W02010/003007、美國專利公開No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公開 No. 2010/0003716 中有所描述。示例性的啟動子和載體本文所述的異戊二烯合酶、DXS、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸中的任一者能包含在一種或多種載體內。因此，具有編碼本文所述的異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子多肽、半乳糖代謝多肽和/或鑰轉運多肽中的任一者的一種或多種核酸的載體也描述在本文中。在一些方面，載體包含受表達控制序列控制的核酸。在一些方面，表達控制序列是天然的表達控制序列。在一些方面，表達控制序列是非天然的表達控制序列。在一些方面，載體包含選擇性標記或可選擇標記。在一些方面，異戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄調節、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸整合到不具有可選擇標記的細胞的染色體內。在一些方面，異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄調節、半乳糖代謝、和/或鑰轉運核酸整合到具有可選擇標記的細胞的染色體內。
合適的載體是與所采用的宿主細胞相容的那些。合適的載體可源自例如細菌、病毒(例如源自噬菌體的抗菌素T7或M-13)、粘粒、酵母或植物。合適的載體可在宿主細胞中維持低、中或高拷貝數。獲得和使用這些載體的方案為本領域的技術人員所知(參見例如 Sambrook et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd ed. , Cold SpringHarbor, 1989 (Sambrook等人，《分子克隆實驗指南》第2版，冷泉港實驗室出版社，1989年))。與本文所述的細胞和方法相容的合適的載體在國際專利公開No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公開No. 2009/0203102)、W0 2010/003007、美國專利公開No. 2010/0048964、W02009/132220以及美國專利公開No. 2010/0003716中有所描述。
啟動子為本領域所熟知。在宿主細胞中起作用的任何啟動子能用于表達宿主細胞中的異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸。有多種用于驅動各種宿主細胞中的異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸表達的初始控制區域或啟動子，并且這些為本領域的技術人員所熟知(參見例如WO 2004/033646和其中所引用的參考文獻)。實際上，可使用能夠驅動這些核酸的任何啟動子，包括葡萄糖異構酶啟動子(參見例如美國專利No. 7，132，527和其中所引用的參考文獻)。與本文所述的細胞和方法相容的合適的啟動子在國際專利公開No. WO 2009/076676A2和美國專利申請公開No. US2009/0203102A1中有所描述。在一些方面，表達載體還包括終止序列。終止控制區域還可源自宿主細胞中天然存在的各種基因。在一些方面，終止序列和啟動子序列源自相同的源。與本文所述的細胞和方法相容的合適的終止序列在國際專利公開No. WO 2009/076676A2和美國專利申請公開 No. US2009/0203102A1 中有所描述。使用標準技術可將異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰核酸整合到載體(諸如表達載體)內(Sambrooket al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1982(Sambrook等人，《分子克隆實驗指南》，冷泉港實驗室出版社，1982年))。與本文所述的細胞和方法相容的合適的技術在國際專利公開No. WO 2009/076676A2和美國專利申請公開No. US2009/0203102A1 中有所描述。在一些方面，以遠高于目前在天然存在的細胞中所發現的水平過表達異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸可能是有利的。在一些方面，以遠低于目前在天然存在的細胞中所發現的水平以受限方式表達(如，突變、失活、或缺失)異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子多肽、半乳糖代謝多肽和/或編碼鑰轉運多肽的核酸可能是有利的。與本文所述的細胞和方法相容的過表達或受限表達異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸的合適的方法在國際專利公開No. WO 2009/076676A2和美國專利申請公開No. US2009/0203102A1中有所描述。示例件來源牛物體異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸(以及它們所編碼的多肽)能從天然包含異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸的任何生物體中獲得。如上所述，異戊二烯由多種生物體(例如細菌、酵母、植物和動物)天然地形成。生物體包含MVA途徑、DXP途徑、或MVA和DXP途徑兩者來產生異戊二烯(圖IA和1B)。因此，DXP途徑核酸能從例如包含DXP途徑或包含MVA和DXP途徑兩者的任何生物體中獲得。IDI和異戊二烯合酶核酸能從例如包含MVA途徑、DXP途徑、或MVA和DXP途徑兩者的任何生物體中獲得。MVA途徑核酸能從例如包含MVA途徑或包含MVA和DXP途徑兩者的任何生物體中獲得。氫化酶核酸能從例如使氫氧化或使氫離子還原的任何生物體中獲得。發酵副產物基因能從例如經歷氧受限或厭氧呼吸(例如糖酵解)的任何生物體中獲得或識別。異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸的核酸序列能從細菌、真菌、植物、藻類或藍細菌中分離。示例性來源生物體包括例如酵母，例如酵母屬(如，釀酒酵母)；細菌，例如埃希氏菌屬(如，大腸桿菌)、或甲烷八疊球菌屬(如，馬氏甲烷八疊球菌)；植物，例如野葛或楊樹(如，銀白楊或銀白楊X歐洲山楊CAC35696)或白楊(如，美洲山楊)。示例性的宿主生物體在國際專利公開 No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、 W02010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716 中有所描述。示例性轉化方法可使用用于將DNA構建體或載體引入宿主細胞內的標準技術，例如轉化、電穿孔、細胞核顯微注射、轉導、轉染(如，脂質體介導轉染或DEAE葡聚糖介導轉染、或者使用重組噬菌體病毒的轉染)、使用磷酸鈣-DNA沉淀進行孵育、使用包覆DNA的微粒進行高速轟擊、以及原生質體融合，來將異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟、轉錄因子、半乳糖代謝和/或鑰轉運核酸或含有它們的載體插入宿主細胞(如，本文所述的植物細胞、真菌細胞、酵母細胞或細菌細胞)內。常規的轉化技術是本領域已知的(參見例如 Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds)Chapter 9,1987(《分子生物學實驗室指南》，F. Μ· Ausubel等人編輯，第9章，1987年)；Sambrook et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd ed. , Cold SpringHarbor, 1989 (Sambrook等人,《分子克隆實驗指南》第2版,冷泉港實驗室出版社，1989年)；以及 Campbell et al.，Curr. Genet. 16 :53-56,1989 (Campbell 等人，《當代遺傳學》，第 16卷第53-56頁，1989年))。引入的核酸可整合到染色體DNA內，或維持為染色體外復制序列。轉化株可通過本領域中已知的任何方法選擇。選擇轉化株的合適的方法在國際專利公開 No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公開 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公開 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公開No. 2010/0003716 中有所描述。示例件純化方法在一些方面，本文所述的任何方法還包括回收產生的化合物的步驟。在一些方面，本文所述的任何方法還包括回收異戊二烯的步驟。在一些方面，通過吸收與汽提法來回收異戊二烯(參見例如美國臨時申請No. 61/288，142或美國專利申請No. 12/969,440)。在一些方面，本文所述的任何方法還包括回收異源多肽的步驟。在一些方面，本文所述的任何方法還包括回收萜類化合物或類胡蘿卜素的步驟。合適的純化方法在美國專利申請公開US2010/0196977A1和美國臨時專利申請No. 61/187，959中有更詳細地描述。其他技術產生和回收異戊二烯與副產物(諸如氫氣)的有效方法的另外的實例在美國專利申請公開No. US2010/0196977中有所描述。可與本文所述的細胞和方法一起使用的其他技術的實例(如，從細胞生長培養物中分離產生的異戊二烯、在安全操作范圍內產生異戊二烯的方法、在高異戊二烯滴度下的細胞活性、用于產生和回收異戊二烯和副產物(如，氫氣、乙醇或1，3_丙二醇)的有效方法)在國際專利公布No. W02009/076676A2，美國專利申請公開No. US2010/0048964A1、 US2010/0086978A1、US2010/0113846A1、US2010/0184178A1 和 US2010/0167371A1、US2010/0196977A1，美國臨時專利申請 No. 61/187，930,61/187, 959 和 61/187，941 以及國際專利申請公開No. W02004/033646A2以及WO 1996/035796A2中有所描述。通過參照以下實例能進一步理解本發明，這些實例以舉例說明的方式提供而非旨在進行限制。實M實例I :構建表達釀酒酵母gil.2KKDyI操縱子、銀白楊異戊二烯合酶、馬氏產甲烷球菌甲羥戊酸激酶、PCL上游MVA(糞腸球菌mvaE和mvaS)以及ybhE (prI)的大腸桿菌菌株( )構律菌株 EWL201 (BL21, Cm-GIl. 2~ΚΚΡνΙ)大腸桿菌BL21 (Novagen品牌，來自EMD生命科學有限公司(EMD Biosciences,Inc.))是受體菌株，使用MCM331P1溶菌產物(根據Ausubel等人在Current Protocolsin Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.(《分子生物學實驗室指南》，約翰·威利父子出版公司)中所述的方法制備的溶菌產物)轉導。MCM331細胞包含編碼釀酒酵母甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶、以及IPP異構酶的染色體構建體gil. 2KKDyI( S卩，來自釀酒酵母的gil. 2-KKDyI操縱子；其構建在國際專利公開No. WO 2009/076676A2的實例10和美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公開No. 2009/0203102)中有所描述)。將細胞鋪展到L瓊脂和20 μ g/ μ I氯霉素上，對轉導子進行選擇。將平板在30°C下溫育過夜。對轉導子的分析顯示在對照平板(用于回復突變的水+細胞對照平板，以及用于溶菌產物污染的水+Pl溶菌產物對照平板)上沒有菌落。挑選四種轉導子并用于接種5ml L-肉湯和20 μ g/μ I氯霉素。在30°C和200rpm的振蕩下使培養物生長過夜。對I. 5mL的過夜細胞培養物進行離心，以獲得用于PCR分析的各種轉導子的基因組DNA制備物。將細胞沉淀置于400 μ I重懸緩沖液(20mMTrisUmM EDTA、50mM NaCl, pH7. 5)中重新懸浮，并加入不含DNase (脫氧核糖核酸酶)的4μ1 RNase(核糖核酸酶)(來自羅氏公司(Roche))。將管在37°C下溫育30分鐘，隨后加入4μ1 10% SDS和4μ I 10mg/ml的蛋白酶K儲備液(來自西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))。將管在37°C下溫育I小時。將細胞裂解液轉移至2ml Phase LockLight Gel管(來自艾本德公司(Eppendorf))中，隨后分別加入200 μ I的pH 7. 9飽和酚(來自Ambion有限公司)和氯仿。將各管充分混勻并微量離心5分鐘。使用400 μ I氯仿進行第二次萃取，并將水層轉移至新的Eppendorf管中。通過加入Iml的100%乙醇并離心5分鐘來使基因組DNA沉淀。使用Iml 70%乙醇來洗滌基因組DNA沉淀。移除乙醇，然后使基因組DNA沉淀短暫風干。使用200 μ I TE將基因組DNA沉淀重新懸浮。使用Pfu Ultra II DNA聚合酶(來自Stratagene公司)和200ng/ μ I的基因組DNA作為模板，根據制造商的方案制備兩組不同的PCR反應管。對于第I組，使用引物MCMl30和GB Cm-Rev (表I)確保轉導子被成功整合進attTn7基因座。第I組的PCR參數為95°C下2分鐘(僅第一次循環)、95°C下25秒、55°C下25秒、72°C下25秒(重復步驟2到4，循環28次)、72°C下I分鐘。對于第2組，使用引物MVD For和MVD Rev (表I)確保gil. 2-KKDyI操縱子被恰當地整合。第2組的PCR參數為95°C下2分鐘(僅第一次循環)、95°C下25秒、55°C下25秒、72°C下10秒(重復步驟2到4，循環28次)、72°C下I分鐘。對I. 2% E-凝膠(來自英杰公司(Invitrogen Corp.))上的PCR擴增子的分析顯示全部4種轉導克隆均是恰當的。挑選一個菌落并命名為菌株EWL201。(ii)構律菌株 EWL204(BL21,環Hi GIl. 2~ΚΚΡνΙ)
使用質粒pCP20將氯霉素標記從菌株EWL201中環出，如Datsenko和Wanner (2000年)(Datsenko et al. , Proc Natl. Acad. Sci USA 97 :6640-6645, 2000 (Datsenko 等人，《美國國家科學院院刊》，第97卷第6640-6645頁，2000年))所述。使EWL201細胞在L-肉湯中生長至對數中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50μ I細胞懸液的等分試樣與
Iμ I的pCP20混合，然后將細胞懸液混合物置于2mm比色皿(來自英杰公司)中使用GenePulser電穿孔儀(來自伯樂有限公司(Bio-Rad Inc.))在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細胞，然后轉移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管(來自莎斯特公司(Sarstedt))中。通過使細胞在30°C下生長I小時而使其恢復。在L瓊脂和20 μ g/μ I氯霉素以及50 μ g/ μ I羧芐青霉素上挑選轉化株，并且在30°C下溫育過夜。次日，使單克隆在IOml L-肉湯和50 μ g/ μ I羧芐青霉素中于30°C下生長直至對數早期。然后使生長的培養物的溫度變為42°C并維持2小時。進行連續稀釋，然后將細胞鋪展到LA平板上(無抗生素選擇性)，并在30°C下溫育過夜。次日，挑選20個菌落，并影印到L瓊脂(無抗生素)和LA與20 μ g/μ I氯霉素平板上。然后將平板在30°C下溫育過夜。能夠在LA平板而非LA與20 μ g/μ I氯霉素平板上生長的細胞被認為其氯霉素標記被環出(挑出一個并命名為菌株 EWL204)。(iii)構建質粒 pEWL230 (pTrc P. alba)將編碼銀白楊異戊二烯合酶(P. alba HGS)的合成基因的生成外包給位于加利福尼亞州門洛帕克市(Menlo Park, CA)的DNA2. O公司，因為該公司擁有大腸桿菌表達的密碼子優化方法。將所述合成基因定制克隆為質粒pET24a (Novagen品牌，來自EMD生命科學有限公司)，并以凍干形式遞送(圖2、3A-B ;序列標識號I)。根據制造商的方案使用pET24P. alba HGS作為模板、引物MCM182和MCM192、以及Herculase II融合型DNA聚合酶(來自Stratagene公司)來進行PCR反應,從而擴增銀白楊異戊二烯合酶(P. alba HGS)基因。PCR條件如下95°C下2分鐘(僅第一次循環)、95°C下25秒、55°C下20秒、72°C下I分鐘，重復這樣的循環25次，最后在72°C下延伸3分鐘。使用QIAquick PCR純化試劑盒(來自凱杰公司(Qiagen Inc.))對銀白楊異戍二烯合酶PCR產物進行純化。
銀白楊異戊二烯合酶PCR產物然后在包含1μ I BspHI核酸內切酶(來自紐英倫生物技術公司(New England Biolabs))和2μ I IOXNEB緩沖液4的20 μ I反應物中進行消化。將該反應物在37°C下溫育2小時。然后使用QIAquick PCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。在包含Iyl PstI核酸內切酶(來自羅氏公司)和2μ I IOX緩沖液H的20 μ I反應物中進行第二次限制酶切消化。將該反應在37°C下溫育2小時。然后使用QIAquick PCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。質粒pTrcHis2B (來自英杰公司)在包含Iyl NcoI核酸內切酶(來自羅氏公司)、1 μ I PstI核酸內切酶和2μ IlOX緩沖液H的20 μ I反應物中進行消化。將反應在37°C下溫育2小時。已消化的pTrcHis2B載體使用I. 2% E-凝膠(來自英杰公司)來凝膠純化，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒(來自凱杰公司)進行提取(圖4)。使用BspHI和NcoI位點的相容粘性末端，制備包含5 μ I銀白楊異戍二烯合酶插入子、2 μ I 1'1^載體、]^1 T4DNA連接酶(來自紐英倫生物技術公司)、
2μ I IOX連接酶緩沖液和10 μ I ddH20的20 μ I連接反應物。將連接混合物在室溫下溫育40分鐘。通過在ddH20的有蓋培養皿中懸浮O. 025 μ m硝化纖維膜過濾膜(來自密理博公司(Millipore))并在室溫下將連接混合物輕輕地施加到硝化纖維膜過濾膜之上30分鐘 來對連接混合物進行脫鹽。使MCM446細胞在LB中生長至對數中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I細胞懸液的等分試樣與5 μ I的脫鹽pTrc P. alba HGS連接混合物混合。將細胞懸液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細胞，然后轉移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管(來自莎斯特公司)中。通過使細胞在30°C下生長2小時而使其恢復。在L瓊脂和SOyg/yl羧芐青霉素以及IOmM甲羥戊酸上挑選轉化株，并在30°C下溫育。次日，挑選6個轉化株，并使其在5ml L-肉湯和50 μ g/μ I羧芐青霉素的管中于30°C下生長過夜。使用QIAquickSpin Minipr印試劑盒(來自凱杰公司)對過夜的培養物進行質粒提取。由于使用了 BL21細胞來繁殖質粒，所以將使用PB緩沖液5X和PE緩沖液3X來洗滌吸附柱的修改形式并入標準制造商方案以便得到高質量的質粒DNA。使用在20 μ I反應物中的PstI來消化質粒以確保線性片段的尺寸正確。全部6種質粒均為正確的尺寸，將其裝運至位于加里福利亞州伯克利市的昆塔納生物科學公司(Quintara Biosciences (Berkeley, CA)),以便使用弓丨物MCM65、MCM66、EL1000 (表I)進行測序。DNA測序結果顯示全部6種質粒均是正確的。挑出一種質粒并命名為質粒EWL230(圖5、6A-B ;序列標識號2)。iv)構建質粒 pEWL244 (pTrc P. alba~mMVK)根據制造商的方案使用MCM376作為模板、引物MCM165和MCM177(參見表I)以及Pfu Ultra II融合型DNA聚合酶(來自Stratagene公司)來進行PCR反應,從而擴增馬氏甲烷八疊球菌(M.mazei)MVK基因。PCR條件如下95°C下2分鐘(僅第一次循環)、95 0C下25秒、55 °C下25秒、72 °C下18秒，重復28次循環，最后在72 °C下延伸I分鐘。使用QIAquick PCR純化試劑盒(來自凱杰公司)來純化馬氏產甲烷球菌MVK PCR產物。馬氏產甲烷球菌MVK PCR產物然后在包含8μ I PCR產物、2 μ I PmeI核酸內切酶(來自紐英倫生物技術公司)、4 μ I 10ΧΝΕΒ緩沖液4、4 μ 110 XNEB BSA以及22 μ I ddH20的40 μ I反應物中進行消化。將該反應物在37°C下溫育3小時。然后使用QIAquick PCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。在包含2μ1 NsiI核酸內切酶(來自羅氏公司)、4. 7μ I IOX緩沖液H以及40 μ I經PmeI消化的馬氏產甲烷球菌MVK片段的47 μ I反應物中進行第二次限制酶切消化。將該反應物在37°C下溫育3小時。已消化的PCR片段然后使用I. 2% E-凝膠來凝膠純化，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒進行提取。質粒EWL230在包含 ΙΟμΙ 質粒、2μ1 PmeI 核酸內切酶、4μ I 10 XNEB 緩沖液 4、4 μ I 10ΧΝΕΒ BSA 和 20μ1ddH20的40μ I反應物中進行消化。將該反應在37°C下溫育3小時。然后使用QIAquickPCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。在包含2μ I PstI核酸內切酶、4. 7μ I IOX緩沖液H以及40 μ I經PmeI消化的EWL230線性片段的47 μ I反應物中進行第二次限制酶切消化。將反應在37°C下溫育3小時。已消化的PCR片段然后使用I. 2% E-凝膠來凝膠純化，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒進行提取(圖7)。使用NsiI和PstI位點的相容粘性末端，制備包含8μ I馬氏產甲烷球菌MVK插入子、3 μ I EWL230 質粒、lμl T4DNA連接酶、 2μ I IOX連接酶緩沖液和6 μ I ddH20的20 μ I連接反應物。將連接混合物在16°C下溫育過夜。次日，通過在ddH20的有蓋培養皿中懸浮O. 025 μ m硝化纖維膜過濾膜并在室溫下將連接混合物輕輕地施加到硝化纖維膜過濾膜之上30分鐘來對連接混合物進行脫鹽。使MCM446細胞在LB中生長至對數中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I細胞懸液的等分試樣與5 μ I的脫鹽pTrc P. alba_mMVK連接混合物混合。將細胞懸液混合物置于2_比色皿中使用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細胞，然后將細胞轉移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管。通過使細胞在30°C下生長2小時而使其恢復。在LA和50 μ g/ μ I羧芐青霉素以及5mM甲羥戊酸平板上選擇轉化株，并在30°C下溫育。次日，挑選6個轉化株，并使其在5ml LB和50 μ g/ μ I羧芐青霉素的管中于30°C下生長過夜。使用QIAquick Spin Miniprep試劑盒對過夜的培養物進行質粒提取。由于使用了 BL21細胞來繁殖質粒，所以將使用PB緩沖液5 X和PE緩沖液3 X來洗滌吸附柱的修改形式并入標準制造商方案以便得到高質量的質粒DNA。使用在20 μ I反應物中的PstI來消化質粒以確保線性片段的尺寸正確。6種質粒中的3種為正確的尺寸，將其裝運至昆塔納生物科學公司以便使用弓I物MCM65、MCM66、EL1000、EL1003和EL1006 (表I)進行測序。DNA測序結果顯示全部3種質粒均是正確的。挑選一種并命名為質粒EWL244(圖8和9A-B ;序列標識號3)。V)構津來自馬氏產甲烷球菌古細菌PET200D下游的質粒MCM376-MVK。使用英杰公司的Platinum HiFi PCR混合物、使用引物MCM161和MCM162 (表I)對來自馬氏產甲烷球菌古細菌下游操縱子(圖10A-C ;序列標識號4)的MVK ORF進行PCR擴增。將45 μ L的PCR混合物與I μ L模板、I μ L引物(每種引物的濃度分別為10 μ Μ)以及2μ L水合并。對反應進行如下循環在94°C下2:00分鐘；在941下0:30分鐘、在55°C下0:30分鐘，并且在68°C下1:15分鐘，循環30次；然后72°C下7:00分鐘，并且在4°C下直至冷卻。根據制造商的方案將3 μ L的該PCR反應物連接至英杰公司的PET200D質粒。將
3μ L的該連接體引入英杰公司的Τ0Ρ10細胞，并且在LA/kan50上選擇轉化株。分離來自轉化株的質粒，并對插入子測序，得到MCM376 (圖11A-C)。vi)構津菌株 EWL251(BL21(DE3)、Cm-GIl. 2-KKDyI、pTrc P. alba~mMVK)使MCM331細胞(其包含編碼釀酒酵母甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶和IPP異構酶的染色體構建體gil. 2KKDyI)在LB中生長至對數中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I的細胞懸液與I μ I的質粒EWL244混合。將細胞懸液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細胞，然后將細胞轉移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管。通過使細胞在30°C下生長2小時而使其恢復。在LA和50 μ g/ μ I羧芐青霉素以及5mM甲羥戊酸的平板上選擇轉化株，并在37°C下溫育。選擇一個菌落并命名為菌株EWL251。vii)構津菌株 EWL256 (BL21 (DE3) .Cm-GIl. 2~KKDvKpTrc P. alba-mMVK.pCL 卜游MVA)。使EWL251細胞在LB中生長至對數中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。使50 μ I的細胞懸液與I μ I的質粒MCM82 (包含pCL Ptrc上游途徑(也稱為“pCL上游MVA”)，編碼糞腸球菌mvaE和mvaS)混合。如國際專利公開No. WO 2009/076676A2的實例8和美國專利申請No. 12/335, 071 (美國專利公開No. 2009/0203102)中所述構建質粒pCL Ptrc上游途徑。將細胞懸液混合物置于2mm比色皿中使用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25yFd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加入細胞中。然后將細胞轉移至具有金屬蓋的14ml聚丙烯管。通過使細胞在30°C下生長2小時而使其恢復。在LA和50 μ g/ μ I羧芐青霉素以及50 μ g/μ I大觀霉素的平板上選擇轉化株，并在37°C下溫育。挑選一個菌落并命名為菌株EWL256。 表I :引物序列
引福名稱 I弓丨物序列.............................................................................................................................................................................................—
IiCMBO P^C^TTGCACCCGGCAGA (序列標~ —
.....GB'Cmlw^TAAA^GCATGCTCCAOAcT^ 列標瓦號15)
MVDFor GACTGGCCT(^ATGAAAGcTfW#i0x^- 16)..........................................................................................................—^
MVDRev CAAACATGTGGCATGGAAAG (序列標識號 17)~
MCMl 82 GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTCTGCAGTTAGCGTTCAAAC GGCAGAA (序列標識號18)
MCMl92 CGCATGCATGTCATGAGATGTAGCGTGTCCACCGAAAA (序列標
__識號 19)___
MCM65 ACAATTTCACACAGGAAACAGC (序列標識號 20)""
MCM66 CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG (序列標識號 21)^
EL1000 GCACTGTCTTTCCGTCTGCTGC (序列標識號 22)^
MCM165 GCGAACGATGCATAAAGGAGGTAAAAAAACATGGTATCCTGTTC TGCGCCGGG
__TAAGATTTACCTG (序列標識號 23 ) __
MCM177^— GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTTTAATCTACTTTCAGACCTT__GC (序列標識號24)___
ELlOOl GATAGTAAeGGCTGCGCTGCTACC i 序列標識夸'
EL1006^^GACAGCTTATCATCGACTGCACG (序列標識號 26)— ^
MCM161 CACCATGGTATCCTGTTCTGCG (序列標識號 27 )_
MCM162 TTAATCTACTTTCAGACCTTGC (序列標識號 28 )
viii)構律菌株 RM111608-2(Cm-GIl. 2-KKDvI, DTrc P. alba~mMVK, pCL h游 MVA、pBBRCMPGIl. 5~pgl)使用復制質粒pBBRlMCS5 (慶大霉素)(由路易斯安那州立大學的K. Peterson博士獲得)時的ybhE基因(編碼大腸桿菌6-磷酸葡萄糖酸內酯酶)的組成型表達來構建產生異戊二烯的大腸桿菌BL21菌株(EWL256)。從德國的基因橋股份有限公司(Gene Bridges GmbH)獲得基于FRT的重組表達盒、用于Red/ET介導的整合及抗生素標記環出的質粒。根據基因橋公司的方案使用這些材料來執行工序。根據制造商的方案使用Stratagene Herculase II融合試劑盒將引物Pgl-F (序列標識號29)和PglGIl. 5-R (序列標識號30)用于擴增得自FRT-gb2-Cm_FRT模板的抗性表達盒。PCR反應(50 μ L的最終體積)包含5 μ L緩沖液、I μ L模板DNA (得自基因橋公司的FRT-gb2-Cm-F)、10皮摩爾的每種引物，以及I. 5 μ L 25mM dNTP混合物，使用dH20將體積增至50yL。對反應進行如下循環1X2分鐘，95°C，然后進行(在95°C下30秒、在63°C下30秒、在72°C下3分鐘)的30次循環。
所得的PCR產物使用QlAquicf PCR純化試劑盒(來自凱杰公司)來純化，并通過電穿孔進入如下具有包含pRed-ET重組酶的質粒的電感受態MG1655細胞內。如下制備細胞使其在5ml L-肉湯中于30°C下生長至0D600為約O. 6。通過加入4%阿拉伯糖來誘導細胞進行重組酶表達，并使細胞在30°C下生長30分鐘，隨后在37°C下生長30分鐘。將I. 5ml細胞的等分試樣在冰冷的dH20中洗滌3至4次。將最終的細胞沉淀重新懸浮在40 μ L的冰冷dH20中，并加入2至5 μ L的PCR產物。在Imm間隙的比色皿中，使用Gene Pulser電穿孔儀(來自伯樂有限公司)在I. 3kV下進行電穿孔。將細胞在30°C下恢復I至2小時，然后使其平鋪在含有氯霉素(5μ g/mL)的L瓊脂上。通過PCR來分析五個轉化株，并使用與整合位點側面相接的引物來測序(2個引物組pgl和49rev以及3' EcoRV-pglstop ;底部Pgb2和頂部GB’ s CMP(946))。選擇正確的轉化株，并將該菌株命名為MG1655GI1. 5_pgl: :CMP。使用MG1655GI1. 5-pgl: :CMP的染色體DNA作為模板以產生包含FRT-CMP-FRT-GI1. 5-ybhE構建體的PCR片段。將該構建體如下克隆到pBBRlMCS5 (慶大霉素)中。使用5'弓丨物Pglconfirm-F(序列標識號31)和3'引物3' EcoRV-pglstop (序列標識號32)將在此稱為CMP-GI1. 5-pgl的片段擴增。按照制造商的建議，使用英杰公司的TOPO-Blunt克隆試劑盒將所得的片段克隆到質粒載體pCR-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0中。將包含CMP-GI1. 5-pgl片段的NsiI片段克隆到pBBRlMCS5(慶大霉素)的PstI位點中。制備包含5μ I CMP-GI1. 5-pgl插入片段、2 μ I pBBRlMCS5 (慶大霉素)載體、I μ I T4DNA連接酶(來自紐英倫生物技術公司)、2 μ I 10Χ連接酶緩沖液以及10 μ I (1(1!120的2(^1連接反應物。將連接混合物在室溫下溫育40分鐘，然后使用以上公開的參數通過電穿孔使2至4μ L所述連接混合物進入電感受態ToplO細胞(來自英杰公司)內。在含有10μ g/ml氯霉素和5ug/ml慶大霉素的L瓊脂上挑選轉化株。使用許多以上所述的引物以及由位于加利福尼亞州的Sequetech公司(Sequetech,CA)提供的內部引物T3和反向引物來確定所選克隆的序列。將該質粒命名為pBBRCMPGIl. 5-pgl (圖12、13A-B，序列標識號6)。如本文所述將質粒pBBRCMPGIl. 5-pgl電穿孔到EWL256內，并且將轉化株平鋪在含有氯霉素( ο μ g/mL)、慶大霉素(5 μ g/mL)、大觀霉素(50 μ g/mL)和羧芐青霉素(50 μ g/mL)的L瓊脂上。選擇一個轉化株并命名為菌株RMl11608-2。
引物:Pgl-F5， -ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC-3’(序列標識號29)PglGIL 5-R5，-GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGCGTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’(序列標識號 30)3' EcoRV-pglstop
5’ -CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC (序列標識號 31)pgl+49rev CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG (序列標識號 32)Bottom Pgb2 :GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC (序列標識號 33)Top GB，s CMP(946) :ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(序列標識號 34)Pglconfirm-F5’ -ACCGCCAAAAGCGACTAAITTTAGCT-3’ (序列標識號 35)實例2 :通過來自大腸桿菌的質粒的ybhE (pgl)的組成型表達來改進異戊二烯的
牛產此實例顯示與以野生型水平表達ybhE的對照菌株(即EWL256)相比在組成型表達大腸桿菌ybhE(pgl)的菌株中異戍二烯的生成。基因ybhE(pgl)編碼抑制異源表達的蛋白質的轉譯后葡糖酰化的大腸桿菌6-磷酸葡萄糖酸內酯酶并改進產物的溶解度和收率，同時還提高通過磷酸戍糖途徑的生物質收率和流量(Aon et al. , Applied andEnvironmental Micrrobiology74 (4) :950-958, 2008 (Aon 等人，《應用與環境微生物學》第74卷第4期第950-958頁，2008年))。I)小規模分析培養基配方(每升發酵培養基):Κ2ΗΡ0413·6g、KH2PO413. 6g、MgS04*7H20 2g、一水檸檬酸2g、檸檬酸鐵銨0. 3g、(NH4) 2S043. 2g、酵母提取物lg、1000X痕量金屬溶液1ml。將所有組分一起加入并溶解在去離子水中。使用氫氧化銨(30% )將pH調節至6. 8，然后定容。使用0. 22微米過濾膜對培養基進行過濾滅菌。在滅菌和調節pH后加入葡萄糖5. Og和抗生素。1000X痕量金屬溶液(每升發酵培養基)一水檸檬酸40g、MnS04*H20 30g、NaCl 10g、FeS04*7H20 lg、CoC12*6H20 lg、ZnS04*7H20 lg、CuS04*5H20 IOOmg、H3BO3 100mg、NaMo04*2H20100mg。以每次溶解一種組分的方式將各組分溶解在去離子水中。使用HCl/NaOH來將pH調節至3. 0，然后將溶液定容，并使用0. 22微米過濾膜來過濾滅菌。(a)實驗稈序通過使菌株在得自MicroReactor Technologies有限公司的Cellerator 中生長來分析異戊二烯的生成。24孔的每一個中的工作容積為4. 5mL。將溫度維持在30°C下，pH設定值為7. 0，氧氣流量設定值為20SCCm并且攪拌速率為800rpm。將從冷凍小瓶中取出的大腸桿菌菌株的接種物劃線接種到LB肉湯瓊脂平板(具有抗生素)上，然后在30°C下溫育。將單個菌落接種到具有抗生素的培養基中，并使其生長過夜。將細菌稀釋到具有抗生素的4. 5mL培養基中，達到在550nm處測得的O. 05光密度。使用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)(來自安捷倫公司(Agilent))頂空分析法來進行異戊二烯的尾氣分析。樣品的制備如下將100 μ L的全部肉湯放置于密封的GC小瓶中，并在30°C下溫育30分鐘的固定時間。在由70°C下溫育5分鐘組成的加熱殺菌步驟之后，將樣品加載到GC上。在運行過程中使用酶標儀(Spectramax)獲得550nm波長處的光密度(OD)。通過將異戊二烯濃度(μ g/L)除以OD讀數和時間(小時)來獲得比產率。在200和400 μ M IPTG誘導水平下評估兩種菌株EWL256和RMl 1608-2。在誘導后
1、2. 5、4. 75和8小時分析樣品的異戊二烯產量和細胞生長(0D550)。制備雙份試樣。 (b)結果實驗表明，與對照菌株相比，在2種不同濃度的IPTG下，表達ybhE (pgl)的菌株的異戊二烯比產率具有顯著的2到3倍的增長。ii)在15L規模下來自表達Cm-GI1.2-KKDyI、馬氏產甲烷球菌甲羥戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合酶以及ybhE(pgl) (RMl11608-2)且分批補料的培養物中生長的大腸桿菌的
異戊二烯發酵。培養基配方(每升發酵培養基)Κ2ΗΡ047· 5g、MgS04*7H20 2g、一水朽1檬酸2g、朽1檬酸鐵銨O. 3g、酵母提取物O. 5g、1000X改進的痕量金屬溶液1ml。將所有組分一起加入并溶解在去離子水中。對該溶液進行高壓滅菌。使用氫氧化銨(30%)將pH調節至7.0，然后定容。在滅菌和調節PH之后加入葡萄糖10g、鹽酸硫胺素O. Ig和抗生素。1000 X改進的痕量金屬溶液一水檸檬酸40g、MnSO4^H2O 30g、NaCl 10g、FeS04*7H20 lg、CoCl2*6H20 lg、ZnS04*7H20 lg、CuS04*5H20 lOOmg、H3BO3 100mg、NaMo04*2H20IOOmgo以每次溶解一種組分的方式將各組分溶解在去離子水中，用HCl/NaOH將pH調節為3. 0，然后定容，并使用0. 22微米過濾膜來過濾滅菌。在具有BL21 (DE3)大腸桿菌細胞的15L生物反應器中進行發酵，該BL21 (DE3)大腸桿菌細胞包含甲羥戊酸(MVA)途徑上游(pCL上游)、整合的MVA途徑下游(gil. 2KKDyI)、來自馬氏產甲燒球菌的甲輕戍酸激酶和來自銀白楊的異戍二烯合酶(pTrcAlba-mMVK)的高效表達、以及大腸桿菌pgl(pBBR-pgl)的高效表達。進行該實驗以監測在期望的發酵pH7. O和溫度34°C下從葡萄糖中形成的異戊二烯。將冷凍小瓶的大腸桿菌菌株解凍并接種至胰蛋白胨-酵母提取物培養基中。在種菌生長至OD為1.0(在550nm處測量)之后，將500mL用于在15L生物反應器中接種，使初始體積為5L。以指數速率進料葡萄糖，直至細胞達到靜止期。在此之后，減少葡萄糖進料以滿足代謝需求。在40小時(59小時)的發酵期間遞送到生物反應器的葡萄糖總量為3. Ikg(在59小時為4. 2kg)。通過加入IPTG來完成誘導。當在550nm處的光密度(OD55tl)達到為4的值時，IPTG濃度變為110 μ M。當OD55tl達到150時，IPTG濃度升至192 μ Μ。在生物反應器內的OD55tl隨著時間推移的分布顯示在圖14Α中。使用Hiden質譜儀測定來自生物反應器的尾氣中的異戊二烯含量。在發酵過程中異戊二烯滴度在40小時處增加至33. 2g/L的最大值(在59小時處為48. 6g/L)(圖14B)。在發酵過程中異戊二烯滴度在40小時處增加至40. 0g/L的最大值(在59小時處為60. 5g/L)(圖14C)。在40小時(59小時)的發酵期間產生的異戊二烯的總量為281. 3g (在59小時為451. Og)，并且產量的時間進程顯示在圖14D中。體積產率的時間進程顯示在圖14E中，并且顯示在O至40小時之間維持I. Og/L/h的平均速率(在19和59小時之間為I. 4g/L/h)。如通過CER所測定的代謝活性分布顯示在圖14F中。在發酵期間參與產生異戊二烯所利用的碳的摩爾產率在40小時為19. 6%(在59小時為23.6% )。得自葡萄糖的異戊二烯重量百分比產率在40小時為8. 9% (在59小時為10. 7% )。實例3:由可再生資源產生的異戊二烯的回收由一組四個14L規模的發酵罐以兩步操作來回收異戊二烯，該兩步操作涉及通過吸附到活性炭來將異戊二烯從發酵尾氣流中脫除、隨后是離線水蒸汽解吸和冷凝從而得到液態異戊二烯(圖16A和16B)。由四個發酵罐產生的異戊二烯的總量為1150g(16. 9mol)，其中953g(14m0l，83%)被碳過濾器吸附。在蒸汽解吸/冷凝步驟之后，回收的液態異戊二烯的量為810g，對應于70%的總回收率。分析回收的異戊二烯，確定是否存在雜質。對異戊二烯液體的分析及其雜質分布 通過GC/MS和氣相色譜法/火焰離子化檢測(GC/FID)來分析回收的異戊二烯液體，從而確定雜質的性質和含量。測得產物的純度> 99. 5%，并且除了多種微量組分之外，該產物包含幾種主要雜質。GC/FID色譜圖在圖17中示出，并且雜質的代表性含量在表19中示出。雜質分布類似于以該規模產生的其他異戊二烯批次的分布。表2:在由可再生資源產生的幾批異戊二烯中觀察到的雜質的性質和含暈匯總
化厶物1........................................................................._一—.J濃度范s
■.…GC/MSGC/m
.....乙.蜂1.591 .89<50ppm
丙 同1.62412.673<1 OOppm
甲基丙烯酸·1.85115.369<200ppm
甲基乙烯酮1.92316.333<20pp_
乙酸乙釀2.03717.145100 至 800ppm
3-f# 2.2718.87550 至 SOOppm
I濃度范圍 I (K.7MS(；('/!■[[)
丙卻2.54819.931<100ppm ^
異戌二烯醇2,96221.583<500ppm
3-甲基-I-丁醇2.9921.783<50ppm
3-己烯-I-醇4.01924.819<\ (Kippm
異戌烯乙酸酯4.46625.733200至IOOOppm
3-己烯-I-基乙酸酯5.33927.223<400ppm
檸檬烯5.71527.971<500ppm
其他環狀化合物__5.50-6.5027.5-28.0<200ppm通過用吸附劑處理來純化由可再生資源產生的異戊二烯業內廣泛地使用吸附劑來從烴原料中移除痕量雜質。合適的吸附劑包括基于沸石、氧化鋁和二氧化硅的材料。通過在硅膠上經過能將由可再生資源產生的異戊二烯基本上純化，并在較小程度上使用氧化鋁。圖18顯示在處理之前(A)以及在使用氧化鋁(B)或二氧化硅(C)處理后的異戊二烯樣品的GC/FID色譜圖。來自巴斯夫公司(BASF)的Selexsorb 吸附劑產品是用于從由可再生資源產生的異戊二烯中移除極性雜質的優選的吸附劑之一。具體地講，考慮到Selexsorb ⑶和⑶X產品具有經證實的從異戊二烯和丁二烯原料中移除極性雜質的效用，因此它們是優選的。實例4 :構律菌株MCM518-521和528-531 λ啟動子驅動糖合的mKKDvIPl轉導能夠使至多IOOkb的DNA在細菌菌株之間移動(Thomason等人，2007年)。通過使用Pl轉導將來自大腸桿菌K12MG1655的一片細菌染色體移動至大腸桿菌BL21 (DE3)來置換在大腸桿菌BL21 (DE3)中的17，257bp缺失(參見圖20)。 采用使用不同的可選擇標記的兩種策略來鑒定包含重組的細菌染色體的菌落。首先，將抗生素標記插入接近待轉移的17，257bp序列的基因中，該序列的缺失不會對菌株不利。包含該抗生素標記的菌株將可能具有與所述標記同時轉導的17，257bp的一片細菌染色體。在這種情況下，將編碼卡那霉素抗性(“kanK”)的基因插入編碼未知功能的126種氨基酸蛋白質的ybgS基因內。其次，因為已知的是在利用半乳糖的過程中涉及的若干基因靠近在待轉導至大腸桿菌BL21(DE3)的17，257bp碎片中的pgl，所以使用得自大腸桿菌K12MG1655 (其包含在大腸桿菌BL21 (DE3)中缺失的17，257bp序列)的Pl溶菌產物轉導且在包含 O. 4% (w/v)半乳糖的 M9 培養基(6g/L Na2HPO4,3g/L KH2PO4、O. 5g/L NaCl、O. 5g/LNH4CUO. ImMCaCl2,2mM MgSO4)中分離的菌落將可能包含17，257bp的一片細菌染色體。根據制造商的方案使用Stratagene Herculase II融合試劑盒(得自位于加利福尼亞州拉荷亞市的安捷倫科技有限公司的Stratagene產品部(Agilent Technologies,Stratagene Products Division,La Jolla,California)),將引物MCM120(序列標識號36)和MCM224(序列標識號37)用于擴增來自基因橋公司FRT-gb2-Cm_FRT模板的氯霉素抗性(“CmK)表達盒。對四次50 μ L PCR反應進行如下循環95°C /2分鐘、95°C /20秒、55°C /20秒、72°C/1分鐘，循環30次；并且72°C/3分鐘。然后將反應物冷卻至4°C。根據制造商的方案將四種反應物合并、加載到凱杰公司的PCR柱上，然后使用55°C下的60 μ L洗脫緩沖液(“ΕΒ”)洗脫。使用標準程序將質粒pRedET-羧芐青霉素R (來自位于德國海德堡的基因橋公司)電穿孔到大腸桿菌BL21(DE3)菌株MCM446(CmK，gil. 6mKKDyI A1-3)內。通過在30°C的SOC培養基中振蕩一小時來使轉化株恢復，然后在LB+50 μ g/mL羧芐青霉素(“LB/carb50”)平板上于30°C下培養過夜，選擇出轉化株。將羧芐青霉素抗性菌落冷凍為菌株MCM508。使來自新劃線的菌株MCM508在30°C下的5mL LB/carb50中生長至OD6tltl為約0. 5。此時，加入40mM L-阿拉伯糖，然后將培養物在37°C下溫育I. 5小時。然后通過離心收集細胞、如上所述使3 μ L純化的擴增子通過電穿孔進入細胞，然后使細胞在37°C下的500 μ LSOC培養基中恢復I. 5至3小時。在37°C下的LB+ΙΟμ g/mL卡那霉素(LB/kanl0)平板上挑選轉化株。通過使用弓丨物GB-DW (序列標識號38)和MCM208 (序列標識號39)的PCR來確認在目標基因座處的擴增子重組。對所得的擴增子測序，以鑒定具有以下所列的序列的四種克隆。將四種對羧芐青霉素敏感的克隆冷凍為菌株MCM518-MCM521。將菌株MCM518-MCM521再次劃線接種至LB/kanl0上并在37°C下生長過夜。挑選菌株MCM518-MCM521的菌落,在37°C下的LB/kanlO中培養并使用質粒pCP20電轉化,所述質粒編碼酵母Flp重組酶、氯霉素和氨芐青霉素抗性基因并賦予宿主細胞溫度敏感性復制體(Cherepanov, P. P. et al. , Gene 158(1) :9-14(1995) (Cherepanov, P. P.等人，《基因》，第158卷第I期第9-14頁，1995年))。通過使細胞在500 μ LSOC培養基中在30°C下振蕩I小時而使細胞恢復。通過在LB/carb50平板上于30°C下培養過夜而選擇出轉化株。次日早晨，使來自各個平板的菌落在30°C下的LB/carb50培養基中生長直至明顯渾濁。然后將培養物轉移至37°C并維持至少3小時。將細胞從該培養物劃線到LB平板上，并在37°C下生長過夜。次日，將菌落影印到LB、LB/carb50和LB/kanlO上。將對羧芐青霉素和卡那霉素均敏感(即，不會在carb50和kanlO上生長)的克隆培養在液體LB中，并冷凍為菌株MCM528-MCM531。表3 :大腸桿菌菌株
權利要求
1.一種能夠產生異戊二烯的大腸桿菌(E.coli)菌株的重組細胞或其子代，所述細胞包含(a)編碼PGL多肽的異源核酸的一個或多個拷貝，其中所述核酸整合在所述大腸桿菌染色體中；以及(b)編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸； 其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細胞不包含編碼PGL多肽的核酸，并且 其中所述所得的重組細胞產生的異戊二烯的滴度大于不包含(a)和(b)的相同細胞的該滴度。
2.根據權利要求I所述的重組大腸桿菌細胞，其中編碼鑰攝取多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。
3.根據權利要求2所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB 和 modC。
4.根據權利要求I所述的重組大腸桿菌細胞，其中編碼半乳糖代謝多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。
5.根據權利要求4所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述半乳糖代謝多肽選自galM、galK、galT 和 galE。
6.根據權利要求I所述的重組大腸桿菌細胞，其中編碼半乳糖代謝多肽的異源核酸的一個或多個拷貝和編碼鑰攝取多肽的異源核酸的一個或多個拷貝被額外整合在所述大腸桿菌染色體中。
7.根據權利要求6所述的重組大腸桿菌細胞，其中(a)所述PGL多肽是大腸桿菌PGL多肽；(b)所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB和modC ;并且(c)所述半乳糖代謝多肽選自 galM、galK、galT 和 galE。
8.根據權利要求7所述的重組大腸桿菌細胞，其中編碼所述PGL多肽、半乳糖代謝多肽和鑰攝取多肽的核酸是如圖20中所示17，257堿基對片段的一部分。
9.根據權利要求I所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述細胞產生異戊二烯的比產率高于不包含(a)和(b)的相同細胞的該比產率。
10.根據權利要求I所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述比產率為至少15mg/0D/h。
11.根據權利要求7所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述編碼PGL多肽、鑰攝取多肽和/或半乳糖代謝多肽的核酸來自大腸桿菌菌株K12MG1655或為大腸桿菌菌株K12MG1655的衍生物。
12.根據權利要求I所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述細胞屬于大腸桿菌菌株B。
13.根據權利要求12所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21。
14.根據權利要求12所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述細胞屬于大腸桿菌菌株BL21(DE3)。
15.根據權利要求I所述的重組大腸桿菌細胞，還包含(c)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸。
16.根據權利要求7所述的重組大腸桿菌細胞，還包含(d)編碼甲羥戊酸(MVA)途徑上游的多肽和/或MVA途徑下游的多肽的異源核酸。
17.根據權利要求15或16所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述MVA途徑上游的多肽選自(i)乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。
18.根據權利要求15或16所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述MVA途徑下游的多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)；以及(iv)異戊烯基二磷酸異構酶(IDI)。
19.根據權利要求16所述的重組大腸桿菌細胞，其中(a)所述PGL多肽是大腸桿菌PGL多肽；(b)所述鑰攝取多肽選自modF、modE、modA、modB和modC ;并且(c)所述半乳糖代謝多肽選自 galM、galK、galT 和 galE。
20.根據權利要求I所述的重組大腸桿菌細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽來自銀白楊(Populus alba)。
21.—種產生異戊二烯的方法，所述方法包括 (a)在適于產生異戊二烯的培養條件下培養包含權利要求I或7所述重組細胞的組合物，以及 (b)產生異戊二烯。
22.根據權利要求21所述的方法，還包括回收所述異戊二烯。
23.根據權利要求21所述的方法，其中所述重組細胞具有大于約15mg/0D/h的異戊二烯比產率。
24.一種產生甲羥戊酸的方法，所述方法包括 (a)在適于產生甲羥戊酸的培養條件下培養包含權利要求15所述重組細胞的組合物，以及 (b)產生甲羥戊酸。
25.一種制備根據權利要求I所述的重組細胞的方法，包括 (a)將編碼PGL多肽的異源核酸轉導至大腸桿菌細胞內，其中在所述整合之前，所述大腸桿菌細胞不包含編碼PGL多肽的核酸； (b)使所述編碼PGL多肽的核酸整合在所述大腸桿菌染色體中；以及 (c)將編碼異戊二烯合酶的一種或多種異源核酸引入大腸桿菌細胞內。
26.一種包含根據權利要求I或7所述的重組細胞的組合物。
全文摘要
本文提供用于增大異戊二烯產量的改良組合物和方法。本文還提供用于增大能夠具有生物活性的異源多肽產量的改良組合物和方法。
文檔編號C12P7/00GK102906268SQ201080064358
公開日2013年1月30日 申請日期2010年12月23日 優先權日2009年12月23日
發明者Z·Q·貝克, M·A·塞爾溫, A·T·尼爾森, C·M·派瑞斯 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司