專利名稱：山核桃胚根不定芽誘導和生根培養基及組培方法
技術領域：
本發明涉及一種以山核桃幼胚為外植體，發育形成胚根，繼而形成不定芽、誘導生
根的培養基及組培方法。
背景技術：
山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是胡桃科山核桃屬的果、木兼用的優良經濟 樹種，在自然環境下，山核桃靠種子繁殖。山核桃干果可加工成各種特色風味食品、保健品， 山核桃含油率高達70 % 74% ，富含不飽和脂肪酸，含粗蛋白7. 8 % 9. 6 %和含K、Ca、Mg、 Na等人體所必須的礦質元素。山核桃木質堅硬、紋理美、抗腐蝕，在軍工、船舶和建筑業用途 廣泛，是我國一種十分優良的經濟樹種。但山核桃樹的分布區域狹窄，為我國的特有樹種， 且只有浙江西北山地和交界的皖南山地有所分布。需求旺、產品少的矛盾突出。長期以來， 山核桃的繁殖主要是實生和嫁接繁殖，實生繁殖難以保持品種的優良特性。山核桃又因富 含單寧，切口極易氧化褐變，對嫁接的技術要求較高，而且嫁接又要受季節和氣候的限制， 繁殖速度難以滿足生產發展的需求。 林學界，眾多學者對山核桃的繁殖作了許多新的探索和嘗試，如黃有軍先生的幼 樹的根插繁殖技術、裴東等先生對核桃的試管嫩莖生根技術及幼樹的根插繁殖技術等，各 對社會作出了有益的貢獻。經檢索，至今未發現通過山核桃幼胚經試管培育不定芽并繁殖 生根育成植株的相關報道。
發明內容
針對山核桃樹種的經濟價值越來越被人們認識，發展山核桃生產的熱情自發涌 動，依靠傳統的實生繁殖和嫁接繁殖，從質量和數量上均無法滿足現實的需求，為此，本發 明要解決的技術問題是提供一種以山核桃幼胚為外植體，誘導胚根發育、不定芽形成和不 定芽生根的培養基及組培方法。 本發明的技術問題通過如下技術方案解決 1.本山核桃胚根不定芽誘導和生根培養基，包括不同誘導時期的四種培養基，各 種培養基的原料及其附加量分別是 (1)初代培養基以MS為基本培養基，附加蔗糖20 30g/L、Agar type A即瓊脂 A 6. 5 8. 5g/L，培養基的pH值為5. 7 ; (2)胚根不定芽誘導培養基:MS附加蔗糖20 30g/L、瓊脂A 6. 5 8. 5g/L、 Picloram即4-氨基-3， 5， 6-三氯妣啶羧酸0. 01mg/L、6-BA即6-氨基腺嘌呤1. 0 3. Omg/ L，pH值5. 7 ; (3)不定芽增殖培養基MS附加蔗糖20 30g/L、瓊脂A6. 5 8. 5g/L、 PicloramO. 01 0. 02mg/L、6_BAl 2mg/L， pH值為5. 7 ; (4)不定芽生根培養基:MS附加蔗糖20 30g/L，瓊脂A6. 5 8. 5g/L、 IAA即吲 哚乙酸0. 3 0. 8mg/L， pH值5. 7。
用上述的培養基進行山核桃胚根不定芽誘導及生根的組培方法經過下列步驟
(1)外植體采集與消毒選取健壯的山核桃開花后100 120天所結的幼果，依 次進行自來水沖洗2h，超凈工作臺上用75 %乙醇滅菌3min，無菌水沖洗3 4次，濃度為 0. 525 %的NaClO滅菌20min并抽真空，無菌水沖洗5次后，用滅菌濾紙吸干表面水分，并剝 去革質果皮，取出幼胚待用； (2)初代培養將步驟(1)無菌條件下取出的幼胚接入前述的初代培養基中，每天 轉接1次；3天后改為每3天轉接一次，每次均轉接至相同的新鮮培養基中，共轉接三次，其 中前7天置于暗柜中培養，后5天置于光暗周期為光16h/暗8h的條件下培養。培養溫度 為25±2°C ; (3)胚根不定芽誘導將初代培養后胚根發育良好的幼胚接入前述的胚根不定芽 誘導培養基中，經過30d的誘導，獲得不定芽。微電腦時控開關控制培養室每日光照時間， 每日光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40 50iimo1 m—2s—、培養溫度為25±2°C ;
(4)不定芽增殖培養將獲得的不定芽在前述的不定芽增殖培養基上進行增殖培 養，30天繼代1次，共繼代3次，增殖系數為5 8。光照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光 照強度為40 50 ii mol m—2s—、培養溫度為25±2°C ; (5)生根誘導前述的不定芽在生根培養基中誘導生根，培養30天，生根率達 50% 。光照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40 50 ii mol m—2s—、培養溫度為
25士rc。 本發明的有益效果是 應用山核桃胚根不定芽誘導并進行生根培養，能使再生植株較好地保持母本的優 良性狀，有效地提高山核桃的繁殖系數，為山核桃良種快繁打下良好的基礎。與播種繁殖相 比，組織培養法能有效利用種子，其萌發率高，育苗周期短，無菌條件下種子只需2周即可 萌發。與扦插繁殖相比，在一個為期6個月的生長周期內組織培養法的繁殖系數為扦插繁 殖的50 60倍。
具體實施例方式
本發明下面結合實施例作進一步詳述本山核桃胚根不定芽誘導及生根的培養基 中，選用基本培養基是MS培養基，這是經過用MS、1/2MS、 WPM、 DKW四種基本培養基各自均 附加蔗糖20 30g/L、瓊脂A 6. 5 8. 5g/L、 Picloram即4-氨基-3， 5， 6-三氯吡啶羧酸 0. 01mg/L、6-BA即6-氨基腺嘌呤1. 0 3. Omg/L， pH值5. 7，進行試驗，每組重復3次，每 種基本培養基有20個外植體的對比試驗得出的。因MS培養基中處理30天后，胚根發育最 好，誘導的不定芽數最多，質量最好。 總之，本發明所公開的培養基及其配比值，溫度、凝固劑等也可用諸如葡萄糖、水 晶洋菜等替代，培養基各原料的配比值也可分別采用本發明最佳方案定值的接近值取代。
下面給出的是本發明的最佳實施例。 1.本山核桃胚根不定芽誘導和生根培養基，包括不同誘導時期的四種培養基，各 種培養基的原料及其附加量分別是 (1)初代培養基以MS為基本培養基，附加蔗糖20 30g/L、Agar type A即瓊脂 A 6. 5 8. 5g/L，培養基的pH值為5. 7 ;
(2)胚根不定芽誘導培養基:MS附加蔗糖20 30g/L、瓊脂A 6. 5 8. 5g/L、 Picloram即4-氨基-3， 5， 6-三氯妣啶羧酸0. 01mg/L、6-BA即6-氨基腺嘌呤1. 0 3. Omg/ L，pH值5. 7 ; (3)不定芽增殖培養基MS附加蔗糖20 30g/L、瓊脂A6. 5 8. 5g/L、 PicloramO. 01 0. 02mg/L、6_BAl 2mg/L， pH值為5. 7 ; (4)不定芽生根培養基:MS附加蔗糖20 30g/L，瓊脂A6. 5 8. 5g/L、 IAA即吲 哚乙酸0. 3 0. 8mg/L， pH值5. 7。 用上述培養基進行山核桃胚根不定芽誘導及生根方法經過下列步驟
(1)外植體采集與消毒選取健壯的山核桃開花后100 120天所結的幼果，依 次進行自來水沖洗2h，超凈工作臺上用75%乙醇滅菌3min，無菌水沖洗3 4次，濃度為 0. 525 %的NaClO滅菌20min并抽真空，無菌水沖洗5次后，用滅菌濾紙吸干表面水分，并剝 去革質果皮，取出幼胚待用； (2)初代培養將步驟(1)無菌條件下取出的幼胚接入前述的初代培養基中，每天 轉接1次；3天后改為每3天轉接一次，每次均轉接至相同的新鮮培養基中，共轉接三次，其 中前7天置于暗柜中培養，后5天置于光暗周期為光16h/暗8h的條件下培養，光照強度 40 50iimo1 m—2s—、培養溫度為25±2°C ，接種于初代培養基中，該培養基包括磷酸二氫 鈉85g/L、White's維生素和MS鹽類，還有30g/L蔗糖、500mg/L水解酪蛋白、6. 5 8. 5g/L 瓊脂A，加入1. 0 3. Omg/L BA即芐氨基腺嘌呤、0. 01mg/LPicloram即4-氨基-3， 5， 6-三 氯吡啶羧酸配制而成。培養12天，胚根發育良好； (3)胚根不定芽誘導將初代培養后胚根發育良好的幼胚接入附加O.Ol 0.02mg/L Picloram、1. 0 3. Omg/L 6-BA、蔗糖20 30g/L、瓊脂A 6. 5 8. 5g/L的MS培 養基中，pH值5. 7，光照強度40 50iimo1 m—2s—、培養溫度25±2°C ，光照時間16h/天， 培養30天，得發育良好的不定芽； (4)不定芽增殖培養將獲得的不定芽長至O. 5cm左右高時，從胚根切下并接種到 前述的不定芽增殖培養基中培養，30天繼代1次，共繼代3次，每次增殖系數為5 8。光 照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40 50iimo1 m—2s—、培養溫度25±2°C ;
(5)生根誘導當前述的不定芽長至0. 5 1. Ocm高時，切成單芽并接種到前述的 生根培養基中，培養30天，生根率達50%。光照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光照強度 為40 50 ii mollis—1,培養溫度為25±2°C。 上述培養基中MS鹽類和White's維生素及其它相關化學品可市售獲得，按商品說 明書配用，為同行所公知。
權利要求
一種山核桃胚根不定芽誘導和生根培養基，其特征是包括不同誘導時期的四種培養基，各種培養基的原料及其附加量分別是(1)初代培養基以MS為基本培養基，附加蔗糖20～30g/L、Agar type A即瓊脂A 6.5～8.5g/L，培養基的pH值為5.7；(2)胚根不定芽誘導培養基MS附加蔗糖20～30g/L、瓊脂A 6.5～8.5g/L、Picloram即4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸0.01mg/L、6-BA即6-氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/L，pH值5.7；(3)不定芽增殖培養基MS附加蔗糖20～30g/L、瓊脂A6.5～8.5g/L、Picloram0.01～0.02mg/L、6-BA1～2mg/L，pH值為5.7；(4)不定芽生根培養基MS附加蔗糖20～30g/L，瓊脂A6.5～8.5g/L、IAA即吲哚乙酸0.3～0.8mg/L，pH值5.7。
2. —種用權利要求1所述的培養基進行山核桃胚根不定芽誘導及生根的組培方法，其 特征是經過下列步驟(1) 外植體采集與消毒選取健壯的山核桃開花后100 120天所結的幼果，依次進行 自來水沖洗2h，超凈工作臺上用75%乙醇滅菌3min，無菌水沖洗3 4次，濃度為0. 525% 的NaClO滅菌20min并抽真空，無菌水沖洗5次后，用滅菌濾紙吸干表面水分，并剝去革質 果皮，取出幼胚待用；(2) 初代培養將步驟(1)無菌條件下取出的幼胚接入前述的初代培養基中，每天轉 接1次；3天后改為每3天轉接一次，每次均轉接至相同的新鮮培養基中，共轉接三次，其中 前7天置于暗柜中培養，后5天置于光暗周期為光16h/暗8h的條件下培養。培養溫度為 25±2°C ;(3) 胚根不定芽誘導將初代培養后胚根發育良好的幼胚接入前述的胚根不定芽誘導培養基中，經過30d的誘導，獲得不定芽。微電腦時控開關控制培養室每日光照時間，每日 光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40 50iimo1 m—2s—、培養溫度為25±2°C ;(4) 不定芽增殖培養將獲得的不定芽在前述的不定芽增殖培養基上進行增殖培養， 30天繼代1次，共繼代3次，增殖系數為5 8。光照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光照 強度為40 50iimo1 m—2s—、培養溫度為25±2°C ;(5) 生根誘導前述的不定芽在生根培養基中誘導生根，培養30天，生根率達50%。光 照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40 50iimo1 m—2s—、培養溫度為25士1。C。
全文摘要
一種山核桃胚根不定芽誘導和生根培養基，包括不同誘導時期的四種培養基(1)初代培養基，(2)胚根不定芽誘導培養基，(3)不定芽增殖培養基，(4)不定芽生根培養基，這四種培養基均以MS為基本培養基，附加蔗糖、瓊脂A等物質，pH5.7。用上述四種培養基進行山核桃胚根不定芽及生根的組培方法經過如下五個步驟一是外植體的采集與消毒，二是初代培養，三是胚根不定芽誘導，四是不定芽增殖培養，五是生根誘導。經過上述五步驟的培育為快速而優質地培養出山核桃幼苗打好堅實的基礎。應用本培養基組培，再生植株能保持母本優良性狀，提高幼苗繁殖速度，擴大繁殖數量，并能有效利用種子、縮短育苗周期，利于滿足社會需求。
文檔編號A01H4/00GK101785432SQ20101914604
公開日2010年7月28日 申請日期2010年2月5日 優先權日2010年2月5日
發明者張啟香, 王正加, 胡恒康, 黃堅欽, 黃有軍 申請人:浙江林學院