專利名稱：利用甘蔗汁促進甘蔗壯苗的組培方法
技術領域：
本發明涉及一種甘蔗組織培養的方法，具體涉及一種利用甘蔗汁促進甘蔗壯苗的 組培方法。
背景技術：
妨MXSaccharum Complex)是我國最主要的糖料作物，甘蔗糖產量占我國食糖總 產量的90%以上。種苗質量直接影響甘蔗產量和品質。甘蔗由于育種周期長達10年以上， 常規以營養體蔗莖留種繁殖，使得甘蔗花葉病毒、黃葉病毒、宿根矮化病菌、黑穗病菌和梢 腐病菌等多種病原在蔗莖中長期累積，導致甘蔗品種種性退化，因而，單位面積蔗莖產量、 蔗糖分和宿根性下降。脫毒健康種苗由于去除了這些病原，養分和水分從甘蔗維管束等輸 導組織輸送暢通，蔗莖產量普遍增產15%以上，蔗糖分提高0.5個百分點左右，可見單位土 地面積的增產效果非常顯著。早在20世紀70年代末，巴西等國就開始對甘蔗健康種苗進行 研究，80年代中期，健康種苗生產已獲成功，并在甘蔗生產上推廣使用。國內的許莉萍等在 90年代初期已開始通過組織培養和莖尖培養的方法培育甘蔗健康種苗，以去除甘蔗花葉病 毒，提高產量。目前健康種苗在巴西、古巴、美國、澳大利亞等國家得到了廣泛利用，其中巴 西、古巴等國90%蔗區實現甘蔗用種健康、無毒化。同時，巴西已通過政府立法，在全國建立 甘蔗脫毒健康種苗生產繁殖體系，種植者不得自留甘蔗種莖，通過糖廠提供健康種苗。2008 年，國際糧農組織亞太生物技術合作組織也極力推薦亞太地區國家采用健康種苗。我國也 計劃在甘蔗主要蔗區大面積示范推廣甘蔗健康種苗技術。利用腋芽或莖尖為外植體進行離 體組織培養，生產脫毒組培苗是生產甘蔗健康種苗最重要的環節。眾所周知，甘蔗組培苗 (瓶苗)是在營養物質豐富，光照、溫度、濕度等條件在嚴格的人工控制下培養出來的，幼苗 較瘦弱，根系吸收能力較差，抗逆性不強，在定植大田前需要經過2個月左右的苗圃(苗 床)假植，假植成活率直接關系生產效率和效益。目前，一般假植成活率只有70%左右，有 時甚至低于50%，大多都是因為瓶苗太弱，假植后不能適應外界環境而死亡。目前，這就要 求組培瓶苗在定植大田之前，必須經過2個月左右的苗圃假植，提高組培苗的假植苗成活 率已成為甘蔗健康種苗生產過程中的一個關鍵步驟。另一方面，隨著分子生物學和基因工 程技術的發展，轉基因改良將成為甘蔗育種的重要手段，該技術手段同樣也涉及離體培養 的轉基因小苗的移栽成活問題。雖然假植苗成活率受各種因素影響，但瓶苗的健壯程度對 其至關重要。因此，要提高假植苗成活率，首先要培育健壯的瓶苗。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中存在甘蔗假植苗成活率低的問題，提供一種利用 甘蔗汁促進甘蔗壯苗的組培方法，培養出健壯的甘蔗瓶苗。所述甘蔗瓶苗指增殖階段的甘 蔗組培苗。
本發明的目的是通過以下方法實現的
一種利用甘蔗汁促進甘蔗壯苗的組培方法，包括材料選擇、誘導培養、繼代培養、分化培養和壯苗培養，其特征在于所述壯苗培養的培養基為MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L KT + 5 % 15 %體積甘蔗汁+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂粉；所述MS培養基為1962年，Murashige 和Skoog公開的MS培養基；所述5% 15%體積甘蔗汁，指成熟期的果蔗Badila汁，一 20°C 冷凍保存，保質期半年，解凍后使用，使用量為壯苗培養基總體積的5% 15% ；所述BA，指 6 一芐胺基嘌吟；所述KT，指6 —糠胺基嘌吟。具體實施步驟
1、材料選擇取健壯的甘蔗植株，從最高肥厚帶往下30cm處切下，用75%的酒精表 面消毒；
2、誘導培養切取生長點以上10cm內的幼嫩心葉，將其切成小于3 mm厚度的圓片，接 種到誘導培養基上；培養室溫度為25 °C 28 °C，暗培養；
3、繼代培養愈傷組織形成后轉接到繼代培養基上，每15天繼代一次；培養室溫度為 25 28 °C，暗培養；
4、分化培養選取金黃色的愈傷組織，接種到分化培養基中，培養15天即可分化出叢 芽；培養室溫度為25 V 28 °C，光照12h，光照強度為1 200 Ix 1 500 Ix ；
5、壯苗培養壯苗培養基的配方為MS+1.0 mg/L ΒΑ+0. 5 mg/L KT + 5 % 15 %體積 甘蔗汁+20 g/L蔗糖+ 6 g/L瓊脂粉；按上述配方先稱取瓊脂粉、蔗糖，加入占壯苗培養 基總體積1/3的蒸餾水中，煮沸后再加入所述配方中的其余各種原料，用蒸餾水定容至所 要配制的培養基總量后，再用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl調節pH值至5. 8 ；然后，分 裝到容器中封口 ；在1. 1 kg/cm2壓力下滅菌20分鐘，冷卻凝固后即為壯苗培養基；將步驟 4分化培養的叢芽切成0. 2 cm2大小，接種到壯苗培養基中，在培養室溫度為25°C 28°C， 光照12 h，光照強度為1 200 Ix 1 500 Ix的條件下培養15天，叢芽即可長成大苗。在甘蔗的腋芽繁殖，莖尖培養，轉基因的愈傷組織分化培養過程中，經常出現芽叢 生長旺盛，而能轉入生根培養的有效芽苗不多，需要多代的轉接才能使芽叢逐漸健壯。為了 探討有效增加甘蔗瓶苗壯苗數量的的方法，我們將甘蔗汁作為甘蔗組織培養的添加劑，設 計了壯苗培養基，并作了壯苗培養基中使用0% 30%體積甘蔗汁對甘蔗叢芽壯苗的影響試 驗。結果如表1所示，壯苗培養基中含5% 10%體積的甘蔗汁，可以有效提高甘蔗瓶苗的 壯苗數量；其中，以含10%體積甘蔗汁的壯苗效果為最好。甘蔗汁中除了糖分本身外，蔗汁 中的一些微量元素和未知的內源激素也是促進甘蔗瓶苗健壯的主要因素。經多次試驗和統 計分析，表明甘蔗組織培養分化叢芽后，使用含10%體積甘蔗汁的壯苗培養基，平均每叢提 高壯苗數3. 5株，提高了 56%，效果顯著。所述壯苗指莖粗>1.5 mm，苗高>2.0 cm的甘蔗瓶
田ο 表1 壯苗培養基中含不同體積甘蔗汁對甘蔗叢芽壯苗的影響
甘蔗汁(％)接種芽叢量(叢)壯苗數壯苗株數/叢顯著性長 勢0452806. 2Bb苗淡黃、高、長勢弱5503607. 2Bb苗淺綠、高、長勢中10504809. 6Aa苗綠、高、長勢壯15605108. 5Aa苗綠、高、長勢壯20603666. 1Bb苗綠、高、長勢壯30502925. 8Bb苗綠、高、長勢壯
表1采用字母標記方法來表示多重比較結果，按照統計分析平均數多重比較標記字母法規定，用小寫拉丁字母a、b、c、d......表示差異顯著水平α =0.05，用大寫拉丁字母A、
B、C、D......表示差異顯著水平α =0.01。先將各處理平均數由大到小排列，最大平均數
后標記a或Α，并將該平均數與以下各平均數相比，差異顯著的依次標記b或B。依次類推， 不顯著的標記同一字母。兩平均數之間凡有相同字母的即為差異不顯著，否則為差異顯著。使用壯苗培養基與使用椰乳汁替代壯苗培養基中甘蔗汁的對比試驗，結果如表2 所示，以使用壯苗培養基為佳，每叢壯苗數達到9. 6株，比使用椰乳汁替代甘蔗汁培養的壯 苗數提高了 41%，呈顯著性差異。從苗的長勢上看，經過甘蔗汁培養的甘蔗苗粗壯，葉片直 立，而使用椰乳汁替代甘蔗汁培養的甘蔗苗細弱，葉片細長且下垂。所述椰乳汁為90 %成 熟度的新鮮椰乳汁。表2 壯苗培養基中使用甘蔗汁與使用椰乳汁對比試驗結果
權利要求
一種利用甘蔗汁促進甘蔗壯苗的組培方法，包括材料選擇、誘導培養、繼代培養、分化培養和壯苗培養，其特征在于所述壯苗培養的培養基為MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L KT＋5 %～15 % 體積甘蔗汁＋20 g/L蔗糖＋6 g/L瓊脂粉；所述MS培養基為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養基；所述5%～15% 體積甘蔗汁，指成熟期的果蔗Badila汁，－20℃冷凍保存，保質期半年，解凍后使用，使用量為壯苗培養基總體積的5%～15%；所述BA，指6－芐胺基嘌吟；所述KT，指6－糠胺基嘌吟。
2.根據權利要求1所述的一種利用甘蔗汁促進甘蔗壯苗的組培方法，其特征在于所述 壯苗培養的培養基為MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L KT+ 10 %體積甘蔗汁+20 g/L蔗糖+ 6g/L瓊脂粉。
全文摘要
一種利用甘蔗汁促進甘蔗壯苗的組培方法，包括材料選擇、誘導培養、繼代培養、分化培養和壯苗培養；其中，壯苗培養的培養基為MS+1.0mg/LBA+0.5mg/LKT＋5%～15%體積甘蔗汁＋20g/L蔗糖＋6g/L瓊脂粉。甘蔗汁中除了糖分本身外，蔗汁中的一些微量元素和未知的內源激素也是促進甘蔗瓶苗健壯的主要因素。經多次試驗和統計分析，表明甘蔗組織培養分化叢芽后，使用含10%體積甘蔗汁的壯苗培養基，壯苗數提高了56%，移苗成活率達94.5%，效果顯著，而且操作方法簡單，實用性強，推廣性好。
文檔編號A01H4/00GK101983558SQ20101057886
公開日2011年3月9日 申請日期2010年12月8日 優先權日2010年12月8日
發明者傅華英, 楊颕颕, 林慶良, 許莉萍, 陳如凱, 高世武, 黃國強 申請人:福建農林大學