專利名稱:BGIos386基因及其用途的制作方法
技術領域:
本發明涉及一種基因,特別是涉及BGIOS386基因,及其促進植物、特別是單子葉 植物分蘗數目增多的用途。
背景技術:
水稻是我國重要的經濟作物,栽種面積為4. 5億畝左右,世界上約有60%的人口 以稻米作為日常主食。通過水稻的分子育種提高產量,給全球的糧食生產帶來了巨大收益。 矮稈基因的利用和多分蘗水稻的育成,使我國水稻產量取得了巨大飛躍。但在相當長的一 段時間里,我國的水稻單產出現了徘徊不前的局面。由此,許多育種工作者從育種理論和方 法上提出了新的思路和設想,希望使水稻單產取得新的突破。在水稻的高產育種理論上,國 際水稻研究所于20世紀90年代初就提出了基于新株型的超級稻理論,然而,到目前為止, 在水稻的育種科研與實踐中對水稻地下部分的形態、生理性狀的改良卻未能在水稻的分子 育種中得以具體體現。分蘗是決定水稻產量的重要農藝性狀,在生產實踐中主要通過栽培措施和育種手 段來增加有效分蘗,減少無效分蘗。同時,分蘗又是水稻生長發育過程中的一種特殊的分枝 現象。根據形態解剖學的研究,水稻分蘗的生長過程分為兩個階段1)在每個葉子的葉腋 里分化形成一個分蘗芽;幻分蘗芽進一步生長發育成分蘗。分蘗是水稻生長的基本特性, 它包含有分蘗角和分蘗力兩個方面,前者反映了主莖與分蘗的集散程度,影響到株間和株 內對光、氣等條件的競爭;后者表現了莖蘗數的多少,決定了穗數、光合面積大小和成穗率 的高低,直接影響著產量(梁康逕等,秈型三系雜交稻莖蘗數的發育遺傳研究.中國農業科 學,2002,35(9) :1033-1039)。分離鑒定各種分蘗突變體并且克隆相應的基因,將有助于揭 示控制水稻分蘗乃至高等植物分枝的分子機理,分蘗機理的研究結果對于水稻的生產具有 重要的指導意義。水稻分蘗是一個復雜的發育性狀,易受環境影響,故分蘗數目通常被認為受數量 性狀位點WTLs)控制。至今至少已發現了 27個影響分蘗數目的數量性狀位點,分布在除 第9條染色體之外的其余11條染色體上,但不同研究者的結果很不一致,不僅QTL數目、 在染色體上分布不一致,而且QTL的貢獻率、效應也不同。Xu等(Diallel analysis of tiller number at different growth stages in rice(Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet, 1991,83 :243-249)在研究水稻不同發育階段的分蘗遺傳規律時發現,植株的高分 蘗能力受2個或多個部分顯性基因調控,在不同生長階段的分蘗數以及田間有效穗是受同 一個多基因系統控制的,但隨著植株的生長,非加性基因和環境對分蘗數的相對貢獻減少, 而加性基因的效應將增加。Wu 等(Identification of QTL controlling quantitative characters in rice using RFLP markers. Euphytica, 1996,89 :349-354)在禾[!用 RFli3 標 記定位控制水稻數量性狀的QTLs時發現兩個控制分蘗數的QTLs位于第4和第12染色體 上。 Yan 等(Quantitative trait loci analysis for the developmental behavior of tiller number in rice (Oryza sativa L ) · Theor. Appl. Genet,1998,97 :267-274)發現 1個QTLs能在整個生育期中被探測出,位于第1染色體上。而mi等(Time-related mapping of quantitative trait loci underlying tillering number in rice. Genetics,1999, 151 (5) :297-303)通過與時間相關的基因作圖法,發現5個控制水稻分蘗數的QTLs位于第 1、3、5染色體上,其中3個位點在分蘗盛期表達達到最高值。梁康逕等(秈型三系雜交稻莖 蘗數的發育遺傳研究.中國農業科學,2002,35 (9) :1033-1039)采用數量性狀的加性-顯 性發育遺傳模型分析了按NC II交配設計的2套秈型三系雜交水稻莖蘗數的發育遺傳規律。 結果發現,在不同的發育階段中,莖蘗數均以顯性效應基因的表達為主,環境和基因型互作 會影響莖蘗數加性效應基因的表達,而對顯性效應基因表達的影響不明顯;隨著發育進程 的推進,莖蘗數在生長中期的雜種優勢最強;加性效應基因和顯性效應基因在莖蘗數發育 的全過程中有選擇地表達。任翔等(水稻分裂能力QTL的定位.武漢大學學報(理學版), 2003,49 =533-537)利用重組自交系對水稻的分蘗能力進行了 QTL分析,通過對連續8個時 間段分裂增加數檢測,在第2、第5、第8和第9染色體上發現4個QTL座位在不同時間段對 分蘗能力有貢獻,同時檢測到該群體中影響分蘗能力的上位效應廣泛存在,在多個時間段 其貢獻率甚至大于單獨的QTL座位,并在第1和第2染色體上成簇分布。目前對QTL的分析在相當程度上還是建立在統計分析的基礎上,缺乏十分完善的 分析方法及其應用軟件來分析基因之間的互作,從而難以精細定位單個QTL以及分析其 效應和互作方式,進而進行位點克隆或獲取目標QTL基因(毛傳藻,程式華.水稻農藝性 狀定位精確性及其影響因素的分析(綜述).農業生物技術學報,1999,7 (4) :386-393;阮 成江,何禎祥,欽佩.我國農作物QTL定位研究的現狀和進展.植物學通報,2003,20(1) 10-22)。分蘗數目的QTL也不例外,至目前為止還沒有1個QTL被克隆出來,更未進行基 因功能與表達調控分析。將分蘗數作為質量性狀的研究報道則相對少些。這方面主要是 通過突變體來進行研究的,目前大約有17個與分蘗數相關的突變體被鑒定出來并存入公 共數據庫(http://www. gramene. org/index. html),但對這些突變體(最近的MOCl等幾 個除外)的研究大都局限于形態描述與初步的染色體定位(李學勇,錢前,李家洋.水稻 分裂的分子機理研究.中國科學院(院刊),2003,(4) :274-276)。唐家斌等(水稻寡分 裂突變體的遺傳分析和基因定位.中國科學(C輯),2001,31C3) :208-212)從秈粳交組合 “圭630/02428”的花培后代中獲得1份寡分蘗突變體“G069”,探索控制水稻分裂的分子 機理將有助于生產上遺傳調控分裂并促進植物分枝的分子機理研究,而水稻中與分裂相關 基因的分離與鑒定是控制水稻分蘗的分子機理研究的瓶頸。至目前為止,已經克隆出3個 與水稻分蘗相關的基因,一個就是我國李學勇等(Li X Y,Qian Q,Fu Z M,et al. Control of tillering in rice. Nature,2003,422 :618-621)研究的 MOCl 基因,另兩個則都是日 ^AfF^W OsTBl (Taito Τ, Yuko S, Makoto S, et al. The OsTBl gene negatively regulates lateral branching in rice.The Plant Journal,2003,33 :513_520)禾口 D3■ 因(Shinji I,MasahikoM,Tomotsugu A,et al. Suppression of tiller bud activity in tillering dwarf mutants of rice.Plant and Cell Physiology,2005,46(1) :79_86)。MOCUOsTBl和D3這3個水稻分蘗相關基因本身就說明了控制水稻分蘗的遺傳因 子不是唯一的,可能還存在著其他控制水稻分蘗的基因,它們要么與分蘗芽的形成有關,要 么與分蘗芽的伸長有關,亦或兼而有之。因此,為了更全面地闡明水稻分蘗的分子機理,繼 續挖掘與分離水稻分蘗相關的新基因是迫切需要的。
目前,如何從思路和技術上提出一種嶄新的方法快速獲得與分裂相關的基因已成 為水稻育種的關鍵。隨著水稻分子育種理論與技術的不斷成熟和完善,遺傳轉化體系的建 立和優化,新型測序技術結合基因組學方法鑒定受人工選擇的基因資源,使得利用基因組 重測序技術發掘分蘗相關基因和遺傳轉化成為可能。
發明內容
本發明以水稻分蘗相關基因為研究對象,利用高通量測序技術,通過基因的遺傳 轉化,挖掘分蘗相關基因,并用實驗驗證了所述基因具有促進植物分蘗數目增多的功能。具體地,本發明包括以下幾方面本發明的一個方面涉及一種具有促進植物分蘗數目增多功能的核苷酸序列,所述 核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列,即BGIos386基因,所述基因的序列如下
ATGAGGAGATCTGCATCTCTACTCCGAGTCCTTTTGGTTTTCATAACCATGGTTGGGACTCAATGGTCC AATGTATCCAGTACATACTGCAAGGACATGGCATCAAGCGTATATCGACCCCACAGTGTCACAATAACTGAATTTGG TGCTGTTGGGGATGGTGTGACTCTCAATACCAAAGCATTCCAGAACGCAATCTTCTACCTCAATTCATTTGCAGACA AGGGTGGCGCACAGCTCTTCGTGCCTGCGGGAAGGTGGCTGACAGGGAGTTTTAGTCTTATCAGCCATCTCACTTTG TCACTGGATAAGGATGCAGAAATAATTGGATCTCCGGATTCATCCGATTGGCCAGTCATTGATCCTCTTCCATCCTA TGGGCGAGGTAGAGAGCTCCCTGGAAAAAGACATCAGAGTCTAATTTTTGGAACTAATCTAACAGATGTAATAATTA CTGGCGCTAATGGTACCATTGATGGCCAGGGAGCCATTTGGTGGGATTGGTTCCACAGCAACACACTGAATTATACT AGGCCACATCTTGTTGAGTTGATGTACTCCACCGATGTTGTTATATCCAATTTAACCTTCAAGAACTCACCGTTTTG GAATATCCATCCTGTATACTGCAGCCAAGTGCTTGTCCAGCATGTCACAATCCTAGCGCCCCTGAATTCACCGAACA CTGATGGCATTGATCCAGATTCGTCCACAAATGTCTGCATTGATCATTGTTATGTCAGAAATGGAGATGATGTTATT GTCATAAAAAGTGGGTGGGATGAGTATGGCATTTCCTTTGCTCGTCCTAGCACAAACATCAGTATCAGCAACATCAC AGGAGAGACAAGGGGTGGTGCAGGGATTGCCTTTGGAAGTGAGATGTCAGGTGGCATATCCGAAGTCCGGGCTGAGG GTCTCCGCATCGTCAACTCAATGCACGGGATCAGAATCAAGACCGCTCCAGGGCGTGGAGGGTATGTGAAGAACGTG TACATATCTGATGTGAGCATGGACAATGTTTCGATGGCCATCAGGATCACCGGAAACTTTGGTGAACATCCTGATGA CAAATATGATAGAAATGCTCTCCCAATGATAAGCAATATTACAATCGAAAATGTGGTCGGCGTCAATGTTGGTGTCG CTGGCATCTTGGAAGGAATTGAGGGGGACAACTTCAGCAGCATTTGCCTGTCCAATGTTTCCCTCAGTGTACAGTCT ATGCATCCCTGGAATTGTTCGCTTATCGAAGGTTATTCAAACTCTGTGATCCCAGAGTCATGTGAGCAACTCAGAAC AGATTGTGGACAGACACCAATTTGCTATGATGGTGGAAGTTCTTCAGCAATACATGCACAGGCAGCCAGACATAGAT TGTCGAGTGCCAGCAGATTGCTAAATCCTTTACTGAAGTTGGCGATGCTGTAG(SEQ ID NO 1)本發明還涉及與SEQ ID NO 1所示序列互補的核苷酸序列,或其具有促進植物分 蘗數目增多功能的選自如下的變體1)在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列,2)對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修 飾的核苷酸序列,和3)與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地,“雜交條件”根據測量雜交時所用條件的“嚴緊性”程度來分類。嚴緊性 程度可以以例如核酸結合復合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據。例如,“最大嚴緊性”典 型地發生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C );“高等嚴緊性”發生在Tm以下約5_10°C;“中等嚴緊性”發生在探針Tm以下約10-20°C ;“低嚴緊性”發生在Tm以下約20_25°C。作為替 代,或者進一步地,雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗 滌為依據。例如,6XSSC =極低嚴緊性;3XSSC =低至中等嚴緊性;IXSSC =中等嚴緊性; 0. 5XSSC =高等嚴緊性。從功能上說,可以采用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一 或近嚴緊同一的核酸序列;而采用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同 一性的核酸序列。對于要求高選擇性的應用,典型地期望采用相對嚴緊的條件來形成雜交體,例如, 選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k,J.等(1989)分子克隆,實驗 室手冊,Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊 性在內的雜交條件。為便于說明,用于檢測本發明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊 條件包括用 5XSSC、0. 5%SDS、1.0mM EDTA (pH 8.0)溶液預洗;在 50_65°C下在 5 X SSC 中 雜交過夜;隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領域技術人員應當理解,能容易地操作雜交嚴緊性,如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如,在另一個實施方案中,合適的高度嚴緊雜交條件包括上述條件,不同之處在 于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發明中,所述在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列,其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物分蘗數目增多活 性。在本發明中,所述對SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列,是指分別或同時在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端,和 /或序列內部進行例如不超過2-45個,或者不超過2-30個,或者不超過3-20個,或者不超 過4-15個,或者不超過5-10個,或者不超過6-8個的分別用逐個連續整數表示的堿基的取 代、缺失、添加修飾。在本發明中,所述對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行如上述一個或多個堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的 促植物分蘗數目增多活性。通過一種多核苷酸進行說明,其所具有的核苷酸序列例如與SEQ ID NO 1的參考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ ID NO :1的參考核苷酸序列之每100個 核苷酸中,該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達5個核苷酸的不同外,該多核苷酸之核 苷酸序列與參考序列相同。換句話說,為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相 同的多核苷酸,參考序列中多達5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代;或可將一些 核苷酸插入參考序列中,其中插入的核苷酸可多達參考序列之總核苷酸的5% ;或在一些核 苷酸中,存在刪除、插入和替換的組合,其中所述核苷酸多達參考序列之總核苷酸的5%。參 考序列的這些突變可發生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置,或在這些末端位置之間 的任意地方,它們或單獨散在于參考序列的核苷酸中,或以一個或多個鄰近的組存在于參 考序列中。在本發明中,用于確定序列同一性和序列相似性百分數的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法,它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻中所述或者默認參數,BLAST 和BLAST 2. O可以用于確定本發明的核苷酸序列同一性百分數。執行BLAST分析的軟件可 以通過國立生物技術信息中心為公眾所獲得。在本發明中,所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列,例如當采用本 文所述方法(例如采用標準參數的BLAST分析)時,與本發明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發明中,所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物分蘗數目增多活 性。在本發明中,所述的BGIos386基因來源于普通野生稻元江(其種子于2010年9 月6日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心,即中國典型培養物保藏中心 (CCTCC),保藏編號為 CCTCC P201011)。本發明的另一方面涉及一種載體,其特征在于,所述載體含有本發明所述的核苷 酸序列,所述載體可以通過例如將上述核苷酸序列插入克隆載體或表達載體而得到,或者 可以通過人工合成得到。本發明的另一方面涉及一種重組載體,其特征在于所述重組載體含有本發明所述 的核苷酸序列,所述重組載體可以通過將上述核苷酸序列插入克隆載體或表達載體而得 到。適于構建本發明所述重組載體的克隆載體包括但不限于,例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構建本發明所述的表達載體包括但不限于,例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本發明的一個實施方案中,所述載體為p6+BGIos386載體。本發明的另一方面涉及一種含有本發明所述載體的重組細胞,所述重組細胞可以 通過將含有本發明所述的載體轉化至宿主細胞而得到。適于構建本發明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限于,例如根癌農桿菌細胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。在本發明的一個實施方案中,所述重組細胞為重組農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105_p6+BGIos386o本發明的還一方面涉及一種單子葉植物愈傷組織,其特征在于,所述愈傷組織轉 化有本發明的核苷酸序列和/或載體和/或感染有本發明的重組細胞。本發明的還一方面涉及一種轉基因植物,其特征在于,所述轉基因植物轉化有本 發明的核苷酸序列和/或載體和/或感染本發明的重組細胞。本發明的還一方面涉及本發明的核苷酸序列和/或載體和/或重組細胞用于促進 植物分蘗數目增多的用途,以及用于制備轉基因植物或用于植物育種的用途。本發明的還一方面涉及本發明的愈傷組織用于制備轉基因植物或用于植物育種 的用途。本發明的還一方面涉及一種促進植物分蘗數目增多的方法,所述方法包括將本發
7明的核苷酸序列和/或載體轉化入植物,或用本發明的重組細胞感染植物。所述方法包括用本發明的核苷酸序列轉化單子葉植物的愈傷組織的步驟。在本發 明的一個實施方案中,所述單子葉植物愈傷組織的轉化利用了含有本發明核苷酸序列的重 組細胞。在本發明的一個實施方案中,所述單子葉植物愈傷組織的轉化過程中利用了前述 的重組農桿菌EHA105-p6+BGIoS386。在本發明的一個具體實施方案中,所述單子葉植物的 愈傷組織為水稻愈傷組織,具體地,所述水稻為日本晴。在本發明中,可采用植物基因轉化技術將目的基因插入到植物基因組中,包括農 桿菌介導轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉化和電穿孔等。本領域周 知,農桿菌介導的基因轉化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉化,但其它轉化技 術也可用于本發明所述單子葉植物的基因轉化。當然,適于本發明的轉化單子葉植物的另 一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發。另外, 還可以采用的轉化單子葉植物的方法是原生質體轉化。基因轉化后,采用通用的方法來篩 選和再生整合有表達單元的植株。本發明的還一方面涉及一種產生分蘗數目增多的轉基因植物的方法,所述方法包 括以下步驟1)將本發明的核苷酸序列和/或載體轉化入植物愈傷組織,或用本發明的重組細 胞感染植物愈傷組織;2)利用所述愈傷組織再生轉基因植物。在本發明中,所述植物優選是單子葉植物,所述單子葉植物包括但不限于水稻、谷 子、小麥、高粱、玉米,特別優選為水稻,所述水稻包括但不限于,中花9、中花10、中花11、臺 北309、丹江8號、云稻2號、汕優63、汕優608、豐優22,黔優88、II優416、II優107、II優 128、II優718、準兩優527、川農1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖 稻203、皖稻205、皖稻207,以及津原101 (上述水稻品種均可購自安徽徽商農家福有限公 司)。在本發明的一個實施方案中,所述水稻為日本晴。在本發明中,所述促進植物分蘗數目增多是指促進植物在地面以下或近地面處發 生更多的分枝。在本發明的一個實施方案中,發明人從水稻元江中擴增得到基因BGIos386,將該 基因重組入新構建的p6載體中得到含有該基因的重組表達載體,轉化根癌農桿菌,利用重 組農桿菌轉化水稻愈傷組織,通過水稻愈傷組織的GUS染色、轉基因小苗根、葉GUS染色及 轉基因小苗分蘗的性狀觀察,并與未轉入BGIos386基因的組織或植物相比,證明BGIos386 基因能夠促進植物分蘗數目增多。發明的有益效果本發明利用高通量測序技術,通過基因的遺傳轉化,挖掘出促分蘗數目增多的相 關基因BGIos386,所述基因能夠促進植物分蘗數目增多,增加莖蘗數,證明了 BGIos386基 因是與控制水稻分蘗性狀相關的功能基因,這將有助于提高水稻產量,對于水稻的生產具 有重要的指導意義,也為揭示控制水稻分蘗乃至高等植物分枝的分子機理提供了研究基 石出。關于牛物材料保藏的說明
本發明涉及以下生物材料普通野生稻元江種子,其于2010年9月6日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢 大學保藏中心,即中國典型培養物保藏中心(CCTCC),保藏編號為CCTCC P201011。
圖1ρ6載體示意圖。圖2經轉化的水稻愈傷組織的⑶S染色結果。其中,由帶有本發明所述BGIos386 基因的重組根癌農桿菌EHA105-p6+BGIoS386轉化的水稻愈傷組織(右)經⑶S染色后呈 現藍色;陰性對照(左)經⑶S染色后顏色未發生變化。圖3經轉化的轉基因水稻苗的根的⑶S染色結果。其中,經含有p6+BGIos386重 組載體的根癌農桿菌介導轉化的水稻苗的根(圖3右)、經染色后呈現藍色,陰性對照(圖 3左)經⑶S染色后顏色未發生變化。圖4經轉化的轉基因水稻苗的葉的⑶S染色結果。其中,經含有p6+BGIos386重 組載體的根癌農桿菌介導轉化的水稻苗的葉(圖4右)經染色后呈現藍色,陰性對照(圖 4左)經⑶S染色后顏色未發生變化。圖5含有p6+BGIos386重組載體轉基因小苗的分蘗結果。其中,陰性對照轉基因小 苗分蘗數目少(圖5左),含有BGIos386基因的轉基因小苗分蘗數目比對照多(圖5右)
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述,但是本領域技術人員將會 理解,下列實施例僅用于說明本發明,而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者,按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者,均為 可以通過市購獲得的常規產品。實施例1 :BGIos386基因的PCR擴增和pMD18_T+BGIos386重組載體的構建PCR 擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒,目錄 號DP320-(^)提取普通野生稻元江(Oryza. rifupongon Yuanjiang)的基因組DNA (gDNA), 根據該基因在gDNA中的序列,分別在首尾設計一對PCR特異性擴增引物(上游引物F1,加 限制性酶切位點BamHI和保護堿基,下游引物R1,加限制性酶切位點)(ba I和保護堿基)。 以上述提取的元江的gDNA為模板,高保真Ex Taq(TaKaRa,DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。 如表1所示。表1目的基因擴增的PCR體系_組成體積(μ 1)基因組DNA0.2dNTPs (2. 5mM)210 X Ex Buffer (含鎂離子)2. 5引物 Fl (50 μ Μ)1引物 Rl (50 μ Μ)1
Ex taqddH20_
0. 2
補充至總體積25 μ 1PCR擴增程序為94°C預變性5min,然后以94°C變性45s,55°C退火50s,72°C延伸 90s,進行35個反應循環,最后72°C延伸7min。其中,上游引物Fl CGCGGATCCATGAGGAGATCTGCATCTCT (SEQ ID NO :2);下游引物 Rl TGCTCTAGACAGCATCGCCAACTTCAGT (SEQ ID NO :3)。帶下劃線部分分別表示BamHI 和 XbaI 酶切位點。PCR擴增產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離,得到大小為1430bp左右的條帶,使用 TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號DP209-03)進行純化回收。pMD18-T+BGIos386 重組載體的構津將上述得到的PCR擴增產物進行T/A克隆(pMD18-T質粒,TaKaRa,D103A),轉化大 腸桿菌,挑取陽性克隆測序,證明準確。其中,T/A克隆的連接條件如下T/A 連接體系10 μ 1pMD18-T1 μ 12 X solution I5μ 1PCR擴增產物(回收插入片段)10-20ng,根據其濃度定ddH20補齊至 10 μ 1于16 °C在節能型智能恒溫槽(寧波新芝,SDC-6)中連接他以上,得到 PMD18-T+BGIos386重組載體。將經過上述連接后的產物按照如下方法轉化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實驗指南》(第三版,科學出版社)所示氯化 鈣法制備的感受態細胞100μ 1 DH5a (中國科學院昆明動物研究所董楊提供;或者可從例 如上海生工購得),冰上融化后,加入10 μ 1如上所得的連接產物,即pMD18-T+BGIos386 重組載體,輕輕攪勻,冰浴30min,42°C熱激60s,冰浴5min,加入600 μ 1 4°C預冷的SOC培 養基(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》,第三版,科學出版社),37°C 220rpm復蘇45min, 8000rpm離心30s,去上清,留取150 μ 1,用剩下的150 μ 1上清重懸沉淀后的混合物,輕輕吹 勻,玻璃珠涂布LB(加卡那霉素,Kan)平板(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》,第三版, 科學出版社),37°C倒置培養16-24h。獲得含有pMD18-T+BGIos386克隆載體的重組大腸桿 菌,命名為DH5a-BGIos386。深圳華大基因科技有限公司對pMD18_T+BGIos386克隆載體中 的BGIos386進行測序,測序結果與SEQ ID NO=I的結果一致。測序結果表明,獲得的pMD18_T+BGIos386克隆載體中BGIos386基因序列正確。實施例2 :p6重組載體的構建1)玉米WDiquitin啟動子片段的PCR擴增和pMD18_T+Ubi重組載體的構建Ubi啟動子PCR擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒,目 錄號DP320-02)提取玉米品種 B73(ka mays mays cv. B73)的基因組 DNA (http://www. maizegdb. org/),根據該啟動子在玉米B73gDNA中的序列,分別在首尾設計一對PCR特異性 擴增引物(上游引物F2 GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT (SEQ ID NO :4),加限制性酶切位點I3St I和保護堿基,下游引物R2 :GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC(SEQ ID NO :5),加限制性酶 切位點I3St I和保護堿基)。以上述提取的玉米B73的gDNA為模板,高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。如表2所示。
表2 W^i啟動子擴增的PCR體系_組成基因組DNA dNTPs(2. 5mM)IOXEx Buffer (含鎂離子)引物 F2(50yM)引物 R2 (50 μ Μ)Ex taq(MH2O
權利要求
1.一種具有促進植物分蘗數目增多功能的核苷酸序列,所述核苷酸序列含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列,或其具有促進植物分蘗數目增多功能 的選自如下的變體1)在高等嚴緊條件下與SEQID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列,2)對SEQID NO :1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的 核苷酸序列,和3)與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
2.一種載體,其特征在于,所述載體含有權利要求1所述的核苷酸序列,例如所述載體 為 p6+BGIos386 載體。
3.一種含有權利要求2所述載體的重組細胞,例如所述重組細胞為重組農桿菌 EHA105-p6+BGIos386o
4.一種單子葉植物愈傷組織,其特征在于,所述愈傷組織轉化有權利要求1的核苷酸 序列和/或權利要求2的載體和/或感染有權利要求3的重組細胞;具體地,所述單子葉植 物為水稻、谷子、小麥、高粱、玉米;更具體地,所述單子葉植物為水稻,例如為日本晴。
5.一種轉基因植物,其特征在于,所述轉基因植物轉化有權利要求1的核苷酸序列和 /或權利要求2的載體和/或感染有權利要求3的重組細胞;具體地,所述植物為單子葉植 物,特別是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米;更具體地,所述單子葉植物為水稻,例如為日本晴。
6.權利要求1的核苷酸序列和/或權利要求2的載體和/或權利要求3的重組細胞用 于促進植物分蘗數目增多的用途;所述植物優選是單子葉植物,更優選是水稻、谷子、小麥、 高粱、玉米,特別優選是水稻,例如為日本晴。
7.權利要求1的核苷酸序列和/或權利要求2的載體和/或權利要求3的重組細胞用 于制備轉基因植物或用于植物育種的用途;所述植物優選是單子葉植物,更優選是水稻、谷 子、小麥、高粱、玉米,特別優選是水稻,例如為日本晴。
8.權利要求4的愈傷組織用于制備轉基因植物或用于植物育種的用途;所述植物優選 是單子葉植物,更優選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米,特別優選是水稻,例如為日本晴。
9.一種促進植物分蘗數目增多的方法,所述方法包括將權利要求1的核苷酸序列和/ 或權利要求2的載體轉化入植物,或用權利要求3的重組細胞感染植物;所述植物優選是單 子葉植物,更優選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米,特別優選是水稻,例如為日本晴。
10.一種產生分蘗數目增多的轉基因植物的方法,所述方法包括以下步驟1)將權利要求1的核苷酸序列和/或權利要求2的載體轉化入植物愈傷組織,或用權 利要求3的重組細胞感染植物愈傷組織;2)利用所述愈傷組織再生轉基因植物;所述植物優選是單子葉植物,更優選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米,特別優選是水稻, 例如為日本晴。
全文摘要
本發明涉及BGIos386基因及其用途。本發明的BGIos386基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列,或其具有促進植物分蘗數目增多功能的變體。本發明還涉及轉化有BGIos386基因或其變體的轉基因植物。本發明還涉及所述BGIos386基因或其變體用于促進植物分蘗數目增多的用途以及促進植物分蘗數目增多的方法。
文檔編號A01H4/00GK102127536SQ20101056580
公開日2011年7月20日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者倪雪梅, 孫紅正, 張耕耘, 李寧 申請人:深圳華大基因科技有限公司