專利名稱：BGIos228基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因，特別是涉 及BGIOS228基因，及其促進植物、特別是單子葉 植物快速分化出苗的用途。
背景技術：
水稻是世界上食用人口最多、歷史最悠久的農作物。全球25億以上的人口主食大 米。近半個世紀來，“綠色革命”的稻作科技進步促進了亞洲乃至世界糧食生產的大幅度增 長，大大提高了亞洲主要產稻國的稻米生產能力，為這些國家的經濟增長和社會穩定、緩和 人口增長對糧食、資源、環境壓力起著重要的作用。但由于稻屬種質資源的有限性和常規育 種方法在時間，空間等多方面的局限性，制約了水稻進一步的遺傳改良。隨著水稻基因組 測序工作的完成，分子生物學和遺傳學研究的進一步發展，水稻作為單子葉模式植物來研 究，其基因的分離、克隆和轉基因技術已日益成熟，許多具有重要農藝性狀的外源基因已被 導入到水禾S基因組中(Gahakwa D et al.，Transgenic rice as a system to study the stability of transgene expression multiple heterologus transgenes show similar behavior in diverse genetic backgrounds. Thero Appl Genet，2000，101 :388_399 ；項友 斌，梁竹青，高明尉等.農桿菌介導的蘇云金桿菌抗蟲基因cryIAb和cryIAc在水稻中的遺 傳轉化及蛋白表達.生物工程學報，1999，15 (4) :494-500;翟文學等.農桿菌介導將白葉 枯病抗性基因Xa21轉入我國的5個水稻品種，中國科學，2000，30 (2) :200_206)，遺傳轉化 成為水稻遺傳改良的一種有效手段。新一代測序技術(如SoleXa、Solid測序儀)的出現，為廉價高效地獲得水稻性狀 相關基因和基因家族提供了前所未有的機會，利用水稻野生與栽培的基因組重測序數據和 技術，能夠比較各栽培種及其野生種基因組結構的異同，運用進化基因組學的理論和方法， 使獲得性狀相關的基因或基因組功能元件成為可能。研究水稻分化出苗基因有助于水稻育種，比如根據氣候，根據水稻分化出苗的時 間來推算適宜水稻種植的時間，可以減免自然災害的不利影響。但目前未見從事水稻分化 出苗相關基因的研究。因此尚需進一步研究并獲得植物分化相關基因，以提高植物分化出 苗效率、縮短分化時間。
發明內容
本發明以水稻愈傷分化出苗過程相關基因為研究對象，利用高通量測序技術，通 過基因的遺傳轉化，挖掘分化出苗快的相關基因，并用實驗驗證了所述基因具有促進植物 快速分化出苗的功能。具體地，本發明包括以下幾方面本發明的一個方面涉及一種具有促進植物快速分化出苗功能的核苷酸序列，所述 核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，即BGIos228基因，所述基因的序列如下ATGTCCGCCGCCGCGGTCACCGCCACGCCGCGCCACGCCCGGCCGTCTCCTCTCAACCCGAACGCCAGGGCCGCGGCGGCGGCGGCCGCCGCGGCGCCGCCGAACGCCGTGTCCACCACCAGGACGCACCTCGCCAACCTCGACCG CCTCCTCGTCCGGCCGCCGCCGCTCCCCCTGCCGCTCCAGAACAAGGGGGCGCCGCCGGCCGATGACCTCGGCGACG GCGGCGGCGCCGCCACCACCGACGACCGGAGCGGCCGCTGCGGGCTGCTCAACGCGCTCAACCTGTCCACGTTCCTG CCCTTCGTCCGCAAGCCGGCCGTCGACGAGATGTCGCCGCGCAGCCTCGCGCACCTGCAGCGCCTCCTCACGCTGTC GCCGCGGCCCTCGCCGAAAGGCTCCATCGCCGGCGAGTGGCGGAGGTATCACAGCGAGGGCGGCTGGGACGGGCTGC TCGACCCGCTCGACCAGAACCTCCGCCGCGAGGTCCTCCGCTACGGCGACTTCGTGCAGGCCGCGTACACGGCGTTC CACTCCATGCCGTCG TCGTCGTCGGCGGCGGCGTCGCAGCACAGCCAGCACCGGACGCTCGTGCTCCCCGACCGGTC GTACCGGCCGACGCGCAGCCTGTTCGCCACGTCGTCGCTGTCCATCCCGGCGTGGGCGCGGCGGCGGTCGGCGCCCG GGTGGCTCACGCAGCGCTCCAGCTTCGTCGGCTACGTCGCCGTCTGCGACAACGAGGGCGAGGTCCAGCGCATGGGC CGCCGGGACATCGCCATCGTCCTGCGCGGCACGGCGACGTGCCCCGAGTGGGCGGAGAACCTCCGCGCCGGCCTCGT GCCGGTCGACGACGACGACGACGACGACGTCGGCTCGCCGCAGAACGCGCCGAAGGTGGCGAAGGGGTTCTTGAGCC TGTACAAGACGGCCGGCGACCACGTCCCCAGCCTCTCCGACGCCATAGTCGACGAGGTGAGGCGCCTCGTCGAGGTC TTCGAGGGGGAGGAGCTGAGCATCACGGTGGTGGGACACAGCCTCGGCGCGTCGCTCGCCGTCCTCGCCGCCGACGA GCTCAGCGCTTGCCTGTCCGCGGACGTGGCTGAACATCGCCGGCGGCCACCGCCGATCGCCGTGGTGTCCTTCGGCG GCCCGAAGACCGGGAACCGCGCGTTCGCCGACCGCCTCCAGAACGGCCGCGGCGTGAACGTGCTCCGCGTGGTGAAC GCCGGCGACGTGGTGACGCGGGTGCCGGCGCCGGCGATGGCGCGGGAGGGGGAGGGGCACGTGCACGCCGGCGCGGA GCTGAGGCTGGACAGCCGCGACTCGCCGTGCCTCCGCCCGGACGCCGGGCCGGCGTGCTGCCACGACCTGGAGGCGT ACCTCCACCTGCTCGACGGCTTCGCCGGCTCCGGCCGGCCGTTCCGCGCCGACGCGAGCCGCAGCGTGGCGCGGCTG CTGACCTACCAGCGTCCCAACGTGAGGGGCGCCTACGTCGAGCGCGCCAGGGTGCTCGGCTTCGAGCCGGCGACGCC GCGGACCGCCACCGCCAACGGCGCCGGCGGCGGAGCCGAGGGGCATTACGGCTACTTGGCTAGCCCAACATGA(SEQ ID NO 1)本發明還涉及與SEQ ID NO 1所示序列互補的核苷酸序列，或其具有促進植物快 速分化出苗功能的選自如下的變體1)在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修 飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“雜交條件”根據測量雜交時所用條件的“嚴緊性”程度來分類。嚴緊性 程度可以以例如核酸結合復合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據。例如，“最大嚴緊性”典 型地發生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴緊性”發生在Tm以下約5-10°C;“中等 嚴緊性”發生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴緊性”發生在Tm以下約20_25°C。作為替 代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗 滌為依據。例如，6XSSC =極低嚴緊性；3XSSC =低至中等嚴緊性；IXSSC =中等嚴緊性； 0. 5XSSC =高等嚴緊性。從功能上說，可以采用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一 或近嚴緊同一的核酸序列；而采用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同 一性的核酸序列。對于要求高選擇性的應用，典型地期望采用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實驗 室手冊，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊性在內的雜交條件。 為便于說明，用于檢測本發明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊 條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中 雜交過夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領域技術人員應當理解，能容易地操作雜交嚴緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴緊雜交條件包括上述條件，不同之處在 于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發明中，所述在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物分化出苗活性。在本發明中，所述對SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內部進行例如不超過2-45個，或者不超過2-30個，或者不超過3-20個，或者不超 過4-15個，或者不超過5-10個，或者不超過6-8個的分別用逐個連續整數表示的堿基的取 代、缺失、添加修飾。在本發明中，所述對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行如上述一個或多個堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的 促植物分化出苗活性。通過一種多核苷酸進行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ ID NO 1的參考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ ID NO :1的參考核苷酸序列之每100個 核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達5個核苷酸的不同外，該多核苷酸之核 苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相 同的多核苷酸，參考序列中多達5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些 核苷酸插入參考序列中，其中插入的核苷酸可多達參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核 苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達參考序列之總核苷酸的5%。參 考序列的這些突變可發生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間 的任意地方，它們或單獨散在于參考序列的核苷酸中，或以一個或多個鄰近的組存在于參 考序列中。在本發明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分數的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389_3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻中所述或者默認參數，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發明的核苷酸序列同一性百分數。執行BLAST分析的軟件可 以通過國立生物技術信息中心為公眾所獲得。在本發明中，所述與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當采用本 文所述方法(例如采用標準參數的BLAST分析)時，與本發明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物分化出苗活性。
在本發明中，所述的BGIos228基因來源于普通野生稻元江(其種子于2010年9 月6日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，即中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號為 CCTCC P201011)。本發明的另一方面涉及一種載體，其特征在于，所述載體含有本發明所述的核苷 酸序列，所述載體可以通過例如將上述核苷酸序列插入克隆載體或表達載體而得到，或者 可以通過人工合成得到。本發明的另一方面涉及一種重組載體，其特征在于所述重組載體含有本發明所述 的核苷酸序列，所述重組載體可以通過將上述核苷酸序列插入克隆載體或表達載體而得 到。適于構建本發明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構建本發明所述的表達載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本發明的一個實施方案中，所述載體為p6+BGIos228載體。本發明的另一方面涉及一種含有本發明所述載體的重組細胞，所述重組細胞可以 通過將含有本發明所述的載體轉化至宿主細胞而得到。適于構建本發明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限于，例如根癌農桿菌細胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。在本發明的一個實施方案中，所述重組細胞為重組農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-p6+BGIos228。本發明的還一方面涉及一種單子葉植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉 化有本發明的核苷酸序列和/或載體和/或感染有本發明的重組細胞。本發明的還一方面涉及一種轉基因植物，其特征在于，所述轉基因植物轉化有本 發明的核苷酸序列和/或載體和/或感染本發明的重組細胞。本發明的還一方面涉及本發明的核苷酸序列和/或載體和/或重組細胞用于促進 植物快速分化出苗的用途，以及用于制備轉基因植物或用于植物育種的用途。本發明的還一方面涉及本發明的愈傷組織用于制備轉基因植物或用于植物育種 的用途。本發明的還一方面涉及一種促進植物快速分化出苗的方法，所述方法包括將本發 明的核苷酸序列和/ 或載體轉化入植物，或用本發明的重組細胞感染植物。所述方法包括用本發明的核苷酸序列轉化單子葉植物的愈傷組織的步驟。在本發 明的一個實施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉化利用了含有本發明核苷酸序列的重 組細胞。在本發明的一個實施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉化過程中利用了前述 的重組農桿菌EHA105-p6+BGIoS228。在本發明的一個具體實施方案中，所述單子葉植物的 愈傷組織為水稻愈傷組織，具體地，所述水稻為日本晴。在本發明中，可采用植物基因轉化技術將目的基因插入到植物基因組中，包括農 桿菌介導轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉化和電穿孔等。本領域周 知，農桿菌介導的基因轉化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉化，但其它轉化技 術也可用于本發明所述單子葉植物的基因轉化。當然，適于本發明的轉化單子葉植物的另 一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發。另外，還可以采用的轉化單子葉植物的方法是原生質體轉化。基因轉化后，采用通用的方法來篩 選和再生整合有表達單元的植株。本發明的還一方面涉及一種產生快速分化出苗的轉基因植物的方法，所述方法包 括以下步驟1)將本發明的核苷酸序列和/或載體轉化入植物愈傷組織，或用本發明的重組細 胞感染植物愈傷組織；2)利用所述愈傷組織再生轉基因植物。 在本發明中，所述植物優選是單子葉植物，所述單子葉植物包括但不限于水稻、谷 子、小麥、高粱、玉米，特別優選為水稻，所述水稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、臺 北309、丹江8號、云稻2號、汕優63、汕優608、豐優22，黔優88、II優416、II優107、II優 128、II優718、準兩優527、川農1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖 稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品種均可購自安徽徽商農家福有限公 司)。在本發明的一個實施方案中，所述水稻為日本晴。在本發明中，所述促進植物快速分化出苗是指加快了植物從種子到發芽、出苗的 時間。在本發明的一個實施方案中，發明人從水稻元江中擴增得到基因BGIos228，將該 基因重組入新構建的p6載體中得到含有該基因的重組表達載體，轉化根癌農桿菌，利用重 組農桿菌轉化水稻愈傷組織，通過水稻愈傷組織的GUS染色、轉基因小苗根、葉GUS染色 及轉基因小苗分化出苗的性狀觀察，并與未轉入BGIos228基因的組織或植物相比，證明 BGIos228基因能夠促進植物快速分化出苗。發明的有益效果本發明利用高通量測序技術，通過基因的遺傳轉化，挖掘出分化出苗快的相關基 因BGIos228，所述基因能夠縮短分化時間，促進植物快速分化出苗，同時為其他物種在分化 難和分化慢上提供了研究基礎。關于牛物材料保藏的說明本發明涉及以下生物材料普通野生稻元江種子，其于2010年9月6日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢 大學保藏中心，即中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC P201011。
圖1ρ6載體示意圖。圖2經轉化的水稻愈傷組織的⑶S染色結果。其中，由帶有本發明所述BGIos228 基因的重組根癌農桿菌EHA105-p6+BGIoS228轉化的水稻愈傷組織(右)經⑶S染色后呈 現藍色；陰性對照(左)經⑶S染色后顏色未發生變化。圖3經轉化的轉基因水稻苗的根的⑶S染色結果。其中，經含有p6+BGIos228重 組載體的根癌農桿菌介導轉化的水稻苗的根(圖3右)、經染色后呈現藍色，陰性對照(圖 3左)經⑶S染色后顏色未發生變化。圖4經轉化的轉基因水稻苗的葉的⑶S染色結果。其中，經含有p6+BGIos228重組載體的根癌農桿菌介導轉化的水稻苗的葉(圖4右)經染色后呈現藍色，陰性對照(圖 4左)經⑶S染色后顏色未發生變化。圖5含有p6+BGIos228重組載體愈傷組織的分化出苗結果。其中，陰性對照愈傷 組織的分化出苗時間晚，出苗慢(圖5左)，含有BGIos228基因的愈傷組織，其分化出苗時 間比對照早，出苗快(圖5右)
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規產品。實施例1 :BGIos228基因的PCR擴增和pMD18_T+BGIos228重組載體的構建PCR 擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號DP320-02)提取普通野生稻元江(Oryza. rifupongon Yuanjiang)的基因組DNA (gDNA)， 根據該基因在gDNA中的序列，分別在首尾設計一對PCR特異性擴增引物(上游引物F1，力口 限制性酶切位點BamHI和保護堿基，下游引物R1，加限制性酶切位點Xba I和保護堿基)。 以上述提取的元江的gDNA為模板，高保真Ex Taq(TaKaRa,DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。 如表1所示。表1目的基因擴增的PCR體系_組成體積(μ )_基因組DNA0.2dNTPs (2. 5mM)210 X Ex Buffer (含鎂離子)2. 5引物 Fl (50 μ Μ)1引物 Rl (50 μ Μ)1Ex taq0. 2ddH20補充至總體積25 μ 1_PCR擴增程序為94°C預變性5min，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸90s，進行35個反應循環，最后72°C延伸7min。其中，上游引物Fl :CGCGGATCC AGTGCACTGTCTGTGCGTT(SEQ ID NO 2)；下游引物 Ri :TGCTCTAGA TGTTGGGCTAGCCAAGTAG(SEQ ID NO :3)。帶下劃線部分分別表示 BamHI 和 XbaI酶切位點。PCR擴增產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，得到大小約1600bp左右的條帶，使用 TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號DP209-03)進行純化回收。pMD18-T+BGIos228 重組載體的構建
將上述得到的PCR擴增產物進行T/A克隆(pMD18-T質粒，TaKaRa，D103A)，轉化大 腸桿菌，挑取陽性克隆測序，證明準確。其中，T/A克隆的連接條件如下T/A 連接體系 10 μ 1pMD18-T1 μ 12氺solution I5μ 1PCR擴增產物(回收插入片段)10-20ng，根據其濃度定ddH20補齊至 10 μ 1于16 °C在節能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到 pMD18-T+BGIos228重組載體。將經過上述連接后的產物按照如下方法轉化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社)所示氯化 鈣法制備的感受態細胞100μ 1 DH5a (中國科學院昆明動物研究所董楊提供；或者可從例 如上海生工購得)，冰上融化后，加入10 μ 1如上所得的連接產物，即pMD18-T+BGIos228 重組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C預冷的SOC培 養基(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)，37°C 220rpm復蘇45min， 8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，用剩下的150 μ 1上清重懸沉淀后的混合物，輕輕吹 勻，玻璃珠涂布LB(加卡那霉素，Kan)平板(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版， 科學出版社)，37°C倒置培養16-24h。獲得含有pMD18-T+BGIos228克隆載體的重組大腸桿 菌，命名為DH5a-BGIos228。深圳華大基因科技有限公司對pMD18_T+BGIos228克隆載體中 的BGIos228進行測序，測序結果與SEQ ID NO=I的結果一致。測序結果表明，獲得的pMD18_T+BGIos228克隆載體中BGIos228基因序列正確。實施例2 :p6重組載體的構建1)玉米Ubiquitin啟動子片段的PCR擴增和pMD18_T+Ubi重組載體的構建Ubi啟動子PCR擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目 錄號DP320-02)提取玉米品種 B73(Zea mays mays cv. B73)的基因組 DNA (http://www. maizegdb. org/)，根據該啟動子在玉米B73gDNA中的序列，分別在首尾設計一對PCR特異性 擴增引物(上游引物F2 GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT (SEQ ID NO :4)，加限制性酶切位 點Pst I和保護堿基，下游引物R2 :GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC(SEQ ID NO :5)，加限制性酶 切位點Pst I和保護堿基)。以上述提取的玉米B73的gDNA為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。如表2所示。表2 Ubi啟動子擴增的PCR體系_組成體積(μ )_基因組DNA0.2dNTPs (2. 5mM)210 X Ex Buffer (含鎂離子)2. 5引物 F2(50yM)1
引物 R2 (50 μ Μ)1Ex taq0. 2ddH20補齊至 25 μ 1_
PCR擴增程序為94°C預變性5min，然后以94°C變性45s，55退火50s，72°C延伸 90s，進行35個反應循環，最后72°C延伸7min。PCR擴增產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收 試劑盒(目錄號DP209-03)純化回收。pMD18~T+Ubi重組載體的構津將上述得到的PCR擴增產物進行T/A克隆(pMD18-T質粒，TaKaRa，D103A)，轉化大 腸桿菌，挑取陽性克隆由深圳華大基因科技有限公司測序，證明準確。其中，T/A克隆的連接條件如下T/A 連接體系 10 μ 1pMD18-T1 μ 12 X solution I 5μ 1PCR擴增產物10-20ng，根據其濃度定ddH20補齊至 10 μ 1于16 °C在節能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到 pMD18-T+Ubi重組載體。將經過上述連接后的產物按照如下方法轉化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社)所示氯 化鈣法制備的感受態細胞100μ 1 DH5a (中國科學院昆明動物研究所董楊提供；或者可從 例如上海生工購得)，冰上融化后，加入10 μ 1如上所得的連接產物，即pMD18-T+Ubi重 組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C預冷的SOC培養 基(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)，37°C 220rpm復蘇45min， 8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，用剩下的150 μ 1上清重懸沉淀后的混合物，輕輕 吹勻，玻璃珠涂布LB (卡那霉素)平板(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版，科學 出版社)，37°C倒置培養16-24h。獲得含有pMD18-T+Ubi克隆載體的重組大腸桿菌，命名為 DH5a -Ubi02)pCAMBIA-1301+Ubi 重組載體的構建按照TIANGEN普通質粒小提試劑盒(目錄號DP103_03)的操作手冊，從步驟1)構 建的轉化有啟動子Ubi的大腸桿菌DH5d-Ubi中提取帶有玉米Ubi啟動子序列的克隆載體 pMD18-T+Ubi ；純化后用相應的限制性內切酶Pst I (NEB)進行酶切，然后用TIANGEN瓊脂糖 凝膠DNA回收試劑盒(目錄號DP209-03)回收相應的啟動子片段。同時用限制性內切酶Pst I酶切pCAMBIA-1301質粒(中國科學院昆明動物研究 所董楊提供；或者可從例如上海國瑞基因科技有限公司購得)并回收。酶切體系50 μ 1ddH2034. 9 μ 1IOXbuffer 35μ 1Pst I0. 1 μ I(IOU)
克隆載體pMD18-T+Ubi 或 pCAMBIA-1301 質粒 10 μ 1 ( < IOOOng)將回收的啟動子片段Ubi與回收的載體片段根據T4連接酶(TaKaRa，D2011A)操 作說明，按照如下條件進行連接連接體系10 μ 110ΧΤ4 buffer1 μ 1回收的 pCAMBIA-1301 質粒1 μ 1 (20ng)回收的 啟動子Ubi插入片段10-20ng，根據其濃度定ddH20補齊至 9. 5μ1Τ4 ligase (TaKaRa, D2011A) 0. 5 μ 1于16°C節能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上。將100 μ 1氯化鈣法制得的感受態細胞DH5 α從超低溫冰箱取出，冰上融化后，力口 入10 μ 1上面的連接產物，輕輕攪勻，冰浴3011^11，421熱激608，冰浴51^11，加入60(^1 4°C預冷的S0C，37°C下220rpm復蘇45min，8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，輕輕吹 勻，玻璃珠涂布LB(Kan)，37 °C倒置培養16_24h。得到重組載體pCAMB IA-1301+Ub i。分別以步驟1)中的F2和R2為引物對所得重組載體pCAMBIA-1301+Ubi進行PCR 檢測，以確證所得重組載體pCAMBIA-1301+Ubi中含有所需啟動子Ubi0 3) NOS終止子的PCR擴增和pMD18_T+N0S重組載體的構建根據pCAMBIA-1301質粒中NOS終止子的序列，分別在首尾設計一對PCR特異性擴 增引物(上游引物 F3 GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA (SEQ ID NO 6),加限制性酶切位 點 Sac I 和保護堿基，下游引物 R3 GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT (SEQ ID NO 7)，加限 制性酶切位點EcoR I和保護堿基)。以上述提取的pCAMBIA-1301質粒為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。如表3所示。表3 NOS終止子的PCR擴增體系_組成體積(μ )_基因組DNA0.2dNTPs (2. 5mM)2IOXEx Buffer (含鎂離子) 2.5引物 F3(50yM)1引物 R3 (50 μ Μ)1Extaq0.2ddH20補齊至 25 μ 1_將上述得到的PCR擴增產物進行Τ/Α克隆(pMD18-T質粒，TaKaRa，D103A)，轉化大 腸桿菌，獲得含有PMD18-T+N0S克隆載體的重組大腸桿菌，命名為DH5 α -NOS0挑取陽性克 隆由深圳華大基因科技有限公司測序，證明準確。4) pCAMB IA-1301+Ubi+NOS 即 p6 重組載體的構建按照TIANGEN普通質粒小提試劑盒(目錄號DP103_03)的操作手冊，提取步驟3構建的克隆載體PMD18-T+N0S ；純化后用相應的限制性內切酶Sac I (NEB)和EcoR I (NEB) 進行酶切，然后用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號DP209-03)回收相應的NOS 終止子片段。同時用限制性內切酶Sac I和EcoR I酶切pCAMBIA-1301+Ubi質粒并回收。酶切體系50 μ 1
ddH2034. 9 μ 1IOXbuffer 15μ 1Sac I0. 1 μ I(IOU)EcoR I0. 1 μ 1 (IOU)載體 pMD18_T+N0S 或 pCAMBIA-1301+Ubi 質粒 10 μ 1 ( < IOOOng)將回收的終止子片段NOS與回收的載體片段用T4連接酶進行連接，轉化感受態細 胞DH5 α得到重組載體pCAMBIA-1301+Ubi+NOS，即p6 (參見圖1)。實施例3 :p6+BGIos228重組載體的構建提取pMD18_T+BGIos228質粒，并用限制性內切酶BamHI/Xbal酶切后回收 BGIos228基因片段，同時提取p6質粒，并用相應的限制性內切酶BamHI/Xbal酶切后回收大 片段，將回收產物進行連接，隨后轉化感受態細胞DH5 α得到重組載體p6+BGIos228。篩選 陽性克隆進行PCR檢測后測序確定。實施例4 重組根癌農桿菌EHA105-p6+BGIos228細胞的制備將如實施例3所述方法構建的p6+BGIos228重組載體質粒，轉化按照《分子克隆實 驗指南》(第三版，科學出版社)中所述氯化鈣方法制備的根癌農桿菌EHA105的感受態細 胞，具體方法如下將根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感受態細胞EHA105 (根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105 已在申請號為 200910238992. O、發明名稱為“一種 啟動子BgIosP587、其制備方法及用途”的發明申請中保藏，并于2010年9月22日公開， 保藏編號為CCTCC M 209315)于超低溫冰箱中取出，至于冰上解凍。融化后，加入5μ1的 p6+BGIos228重組載體，輕輕混勻，冰浴lOmin，放入液氮中冷凍5min，37°C解凍5min，加 入800 μ 1常溫的LB液體培養基，28°C 160rpm復蘇3h，8000rpm離心30s，吸去上清，留下 200 μ 1吹勻，涂布于加有kan-rif (卡那霉素-利福平)雙抗的YM培養基平板上(50mg/l Kan, 10mg/l Rif，具體配方參見表4)。28°C倒置培養2_3天。以Fl和Rl為引物進行PCR檢測和通過BamHI/Xba I酶切篩選轉化子。PCR擴增 并酶切出約1600bp左右條帶的為含有重組載體p6+BGIos228的重組根癌農桿菌。本發明中，按照如上述方法得到的帶有重組載體p6+BGIos228的重組農桿菌，命 名為重組根癌農桿菌EHA105-p6+BGIoS228 ；同時設立帶有空載體p6的重組根癌農桿菌，即 EHA105-p6作為本發明的陰性對照，用于后續實驗。實施例5 水稻愈傷組織的誘導和轉化按照如下步驟誘導水稻愈傷組織，并分別用重組根癌農桿菌EHA105-p6+BGIoS228 轉化所述愈傷組織。1)將水稻日本晴種子(已在申請號為200910238992. 0、發明名稱為“一種啟動子 BgIosP587、其制備方法及用途”的發明申請中保藏，并于2010年9月22日公開，保藏編號為 CCTCC P200910)去殼，70%乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1. 5%的次氯酸鈉消毒30min，期間劇烈搖動，消毒后用滅菌水清洗5次；將消毒后的種子置于N6D培養基(具體配方參見 表4)上，用封口膜封口 ；29. 5°C光照培養3-4周；2)選取活躍生長的愈傷組織(黃白色，干燥，直徑l_3mm)，在新N6D培養基上 29. 5°C光照培養3天；3)分別挑取如實施例4所構建的重組根癌農桿菌單菌落(重組根癌農桿菌 EHA105-p6+BGIos228)，于添加抗生素(50mg/l Kan，1 Omg/IRif)的YM培養基(具體配方參 見表5、表6)上劃線培養3天，培養溫度28V ；分別刮取上述重組根癌農桿菌置于添加了 30 μ 1 IOOmM的AS (Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM培養基(具體配方參見表 7)中，溫和重懸所述重組根癌農桿菌細胞EHA105-p6+BGIos228 ；4)將繼代培養的愈傷組織置于滅菌培養皿中；將如步驟4制備的重組根癌農桿菌 懸液倒入培養皿中，將愈傷組織浸入其中15min ；5)倒掉重組根癌農桿菌懸液，將愈傷組織用滅菌吸水紙吸掉多余的液體；于 N6-AS培養基(配方參見表8)上放一張滅菌濾紙，加Iml如上述含AS的AAM培養基，將愈 傷組織轉移至濾紙上；密封培養皿，28°C暗培養48-60h ；6)將受感染的愈傷組織置于50ml滅菌管中，用滅菌水搖動清洗，直至上清 液變 澄清；將愈傷組織浸泡于含500mg/l羧芐青霉素(Carb)的無菌水中以殺死重組根癌農桿 菌；用滅菌吸水紙除去愈傷組織上多余的水分，然后將其轉移至含lmg/1潮霉素B (HmB)和 50mg/l Carb的N6-AS培養基上；用封口膜密封培養皿，29. 5°C光照培養3_4周。實施例6 水稻愈傷組織中的⑶S的表達為檢測經過實施例5所述轉化的水稻愈傷組織中目的基因⑶S的表達情況，按照 Chen S Y 等在 Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (6) :742_751 所述的方 法，對用重組根癌農桿菌EHA105-p6+BGIoS228轉化的水稻愈傷組織進行染色。GUS 染色液的配方(Iml) :610μ1 0. 2Μ Na2HPO4 溶液(ρΗ = 7. 0) ；390 μ 1 0. 2Μ NaH2PO4 溶液和 10 μ 1 0. IM X-gluc。將用重組根癌農桿菌EHA105-p6+BGIoS228轉化的水稻愈傷組織浸泡在⑶S染色 液中，37°C保溫至出現藍色，拍照記錄，結果如圖2所示，含有p6+BGIos228重組載體的根癌 農桿菌介導轉化的水稻愈傷組織(圖2右)經染色后呈現藍色，陰性對照(圖2左)經⑶S 染色后顏色未發生變化。結果顯示，本發明p6+BGIos228已轉入水稻愈傷組織。實施例7 轉基因水稻苗中⑶S的表達將實施例5中得到的愈傷組織轉移至含50mg/l潮霉素B (HmB)的MS-R分化培養 基(具體配方見表9)分化苗；用封口膜密封培養皿，29. 5°C光照培養3-4周；待幼苗長至 3-4cm時轉移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培養基(具體配方參見表10)進行 生根篩選。轉基因水稻苗的GUS染色過程同實施例6中愈傷組織的染色過程。結果如圖3、 圖4所示，經含有p6+BGIos228重組載體的根癌農桿菌介導轉化的水稻苗的根(圖3右)、 葉(圖4右)經染色后呈現藍色，陰性對照(圖3左、圖4左)經⑶S染色后顏色未發生變 化。結果顯示，本發明p6+BGIos228轉入水稻苗中。實施例8 轉基因小苗的性狀觀察將實施例5制備的經轉化的水稻愈傷組織和對照愈傷組織轉移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培養基分化苗；用封口膜密封培養皿，29. 5°C光照培養20天；性 狀觀察了 36株，其中31株轉化了 BGIos228基因的愈傷組織出苗快(圖5右)，沒有轉入 BGIos228基因的陰性對照愈傷組織出苗慢(圖5左)。本發明實施例中所使用的相關培養基配方說明如下以下有關培養基中所稱的“常規滅菌”是指如下條件的滅菌121°C下蒸氣滅菌 20mino表4 N6D培養基
L 2
L 5
O^
L 1
N6macro 母液(20X)50 ml25 ml100 mlFe2EDTA 貯存液(IOOX )10 ml5 ml20 mlN6Iiiicro 母液(1 000X)1 ml0. 5 ml2 mlN6維生素貯存液(1000X)1 ml0. 5 ml2 ml肌醇(500X)2 ml1 ml4 ml2, 4-D 貯存液(1 mg/ml )2 ml1 ml4 ml脯氨酸(Proline)2. 88 g1.44 g5. 76 g水解酪蛋白(CH)0. 30 g0. 15 g0. 6 g篇糖(sucrose )30 g15 g60 g植物凝膠(Phytagel )3 g1.5 g6 g用IN氫氧化鉀調節pH值到5. 8，封口后按常規方法滅菌。N6 macro母液(20X)硝酸鉀56. 60g,磷酸二氫鉀8. OOg,硫酸銨9. 26g，硫酸鎂 3. 70g，氯化鈣3. 32g，蒸餾水定容至1L，4°C保存備用。N6 micro 母液(1000X)碘化鉀 0. 80g，硼酸 1. 60g，硫酸錳 3. 33g，硫酸鋅 1. 50g， 蒸餾水定容至1L，4°C保存備用。鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)將3. 73g 乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20)和 2. 78g FeSO4. 7H20分別溶解，混合并用。用蒸餾水定容至1000ml，70°C溫浴2h，冷卻后4°C 保存不超過1個月。N6維生素貯存液(1000X)維生素B1 0. 10g，維生素B6 0. 05g，煙酸0. 05g，甘氨酸 0. 20g，加蒸餾水定容至100ml，過濾除菌，4°C保存不超過1周。表5YM 液體培養基(含有 50mg/L Kan, 10mg/L Rif)
1 L0. 5 LYM Broth 干粉21 g10. 5 g常規滅菌，冷卻至室溫后加入卡那霉素(Kan) ( 50rag/ral)1 ml0. 5 ml利福平(Rif) ( 50rag/ml )0. 2 ml0. 1 ml表 6YM 固體培養基(含有 50mg/L Kan，10mg/L Rif)
權利要求
1.一種具有促進植物快速分化出苗功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列，或其具有促進植物快速分化出苗功能 的選自如下的變體1)在高等嚴緊條件下與SEQID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQID NO :1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的 核苷酸序列，和3)與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
2.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求1所述的核苷酸序列，例如所述載體 為 p6+BGIos2^ 載體。
3.一種含有權利要求2所述載體的重組細胞，例如所述重組細胞為重組農桿菌 EHA105-p6+BGIos228o
4.一種單子葉植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉化有權利要求1的核苷酸 序列和/或權利要求2的載體和/或感染有權利要求3的重組細胞；具體地，所述單子葉植 物為水稻、谷子、小麥、高粱、玉米；更具體地，所述單子葉植物為水稻，例如為日本晴。
5.一種轉基因植物，其特征在于，所述轉基因植物轉化有權利要求1的核苷酸序列和 /或權利要求2的載體和/或感染有權利要求3的重組細胞；具體地，所述植物為單子葉植 物，特別是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米；更具體地，所述單子葉植物為水稻，例如為日本晴。
6.權利要求1的核苷酸序列和/或權利要求2的載體和/或權利要求3的重組細胞用 于促進植物快速分化出苗的用途；所述植物優選是單子葉植物，更優選是水稻、谷子、小麥、 高粱、玉米，特別優選是水稻，例如為日本晴。
7.權利要求1的核苷酸序列和/或權利要求2的載體和/或權利要求3的重組細胞用 于制備轉基因植物或用于植物育種的用途；所述植物優選是單子葉植物，更優選是水稻、谷 子、小麥、高粱、玉米，特別優選是水稻，例如為日本晴。
8.權利要求4的愈傷組織用于制備轉基因植物或用于植物育種的用途；所述植物優選 是單子葉植物，更優選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優選是水稻，例如為日本晴。
9.一種促進植物快速分化出苗的方法，所述方法包括將權利要求1的核苷酸序列和/ 或權利要求2的載體轉化入植物，或用權利要求3的重組細胞感染植物；所述植物優選是單 子葉植物，更優選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優選是水稻，例如為日本晴。
10.一種產生快速分化出苗的轉基因植物的方法，所述方法包括以下步驟1)將權利要求1的核苷酸序列和/或權利要求2的載體轉化入植物愈傷組織，或用權 利要求3的重組細胞感染植物愈傷組織；2)利用所述愈傷組織再生轉基因植物；所述植物優選是單子葉植物，更優選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優選是水稻， 例如為日本晴。
全文摘要
本發明涉及BGIos228基因及其用途。本發明的BGIos228基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有促進植物快速分化出苗功能的變體。本發明還涉及轉化有BGIos228基因或其變體的轉基因植物。本發明還涉及所述BGIos228基因或其變體用于促進植物快速分化出苗的用途以及促進植物快速分化出苗的方法。
文檔編號A01H4/00GK102127534SQ20101056574
公開日2011年7月20日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者張豐豐, 張耕耘, 束禮平, 蔡雪梅 申請人:深圳華大基因科技有限公司