一種有效降低轉基因植物通過花粉介導基因漂移的方法

專利名稱：一種有效降低轉基因植物通過花粉介導基因漂移的方法
技術領域：
本發明提供了一種終止轉基因植物通過花粉將外源基因傳遞給其它植物的方法， 從而有效降低了轉基因植物的環境風險，屬于生物技術領域。
背景技術：
近年來，隨著轉基因植物種類和種植面積的迅猛增加，轉基因生物的大規模環境釋放及其可能帶來的環境生物安全問題已經日益成為目前全球最受關注和爭議的領域之一。轉基因植物中的外源基因通過基因漂移(或天然雜交)轉移到環境中的非轉基因品種或其野生近緣種(包括雜草種類)中，并通過遺傳漸滲在野生近緣種的群體中存留或進一步擴散，從而帶來環境生物安全問題。花粉介導的基因漂移廣泛存在于具有雜交親和性的植物種類之間，包括同一物種不同群體和不同物種之間的基因漂移。與其它形式的基因漂移(如種子介導的基因漂移)相比，花粉介導的基因漂移由于可以借助風力和昆蟲進行，因而是最不容易避免的。目前已經發現一些降低花粉中外源基因擴散的方法，常見的如葉綠體轉化、花粉中外源基因的去除等。大多數植物的葉綠體是母性遺傳的，如果外源基因整合到葉綠體基因組上，就不能通過花粉向其它植物擴散，因此可以避免外源基因的擴散。然而葉綠體轉化只在少數植物中利用基因槍法獲得了成功。另外，葉綠體轉化載體包含有葉綠體同源片段，以保證外源基因的定點組合，而大多數植物的葉綠體基因組序列不清楚，因此，無法確定用于載體構建的同源片段和外源基因插入位點，對未知序列葉綠體基因組只能通過保守序列來完成。另外一個關鍵的問題是，大多數植物細胞含有10-100個葉綠體，每個葉綠體又含有高達100 個質體基因組拷貝，而只有少數的質體基因組能夠轉化成功，使外源基因完全整合到葉綠體每個DNA拷貝中需要有效的組織培養方法以及篩選技術，而對于大多數單子葉植物來說目前還沒有建立起來有效的轉化和篩選系統。特異位點重組(如Cre/loxP系統、FLP/FRTs系統和鋅指核酸酶(ZFNs)系統)是將花粉中外源基因剪切掉的方法。在這類體系中，花粉特異啟動子驅動位點特異重組酶將其識別位點旁側的轉基因元件準確切除，而不影響花粉的正常生成和功能，但是這種方法的效率較低。最新發展的loxP/FRTs系統可以被Cre或FLP任何一種重組酶識別，相比Cre/ IoxP和FLP/FRTs，具有更高的效率(Luo，K. et al.，2007)，但是這一技術目前只在煙草中得到了驗證。雄性不育是另外一種廣泛應用于商業化轉基因植物中避免花粉介導轉基因漂移的方法。Mariani等利用Barnases基因創造了煙草和油菜的雄性不育系，雄性不育株系做母本，野生型株系做父本，獲得的雜交種借助Barstar基因恢復育性。然而，其負效應表現在，與對照相比，以花粉為食物的昆蟲如油菜花露尾甲長成成蟲的數量明顯減少。而且，有證據表明，barnase對動物和人類細胞具有毒性，因此需要植物特異表達barnase的部位不是被食用的部分。另外，Barnase在應用方面還存在著很多問題，例如雄性不育性狀具有溫度敏感性，容易受環境影響而不穩定、即使在花粉特異啟動子下，barnase的毒性也有可能會泄露表達在植物體其它部位，從而引起各種重要農藝性狀的變化、barnase在后代分離中存在不穩定性等。因此，這種方法也不是理想的控制轉基因漂移的方法。

發明內容
本發明提供了一種有效阻止轉基因植物通過花粉傳播至其它水稻品種、野生近緣種、野草以及其它植物的方法。此方法的核心技術是利用花粉形成后期特異啟動子PG47驅動花粉致死基因ZM-AA1，將攜帶有轉基因的花粉殺死，而不帶轉基因的花粉仍然能夠正常發揮功能。本發明的優點在于1)帶有轉基因的花粉粒因為攜帶有一個植物來源的糖代謝基因而完全失活，效率高達100%，降低了由花粉介導的基因漂移造成的環境風險；2)花粉致死基因由花粉發育后期特異啟動子驅動，對另外一半不攜帶轉基因的花粉粒的形成和功能完全無影響；3)外源基因可以通過雌配子傳遞。本發明通過以下方案來實現首先構建轉化載體，將花粉致死基因置于花粉發育后期特異性啟動子PG47下游，紅色熒光蛋白所基因置于愈傷組織和種皮特異性啟動子END2下游，兩個基因表達盒緊密連鎖；然后利用野生型水稻品種中花11幼胚或成熟胚誘導的愈傷組織作為轉化外植體，利用農桿菌介導的轉化方法將外源基因導入；受體細胞在共培養后的30天內利用熒光顯微鏡進行三次篩選，將穩定表達紅色熒光的愈傷組織分化成幼苗；對轉化幼苗進一步進行分子生物學鑒定和花粉活性鑒定。本發明依次通過以下步驟來實現
1)載體構建將花粉致死基因連接于花粉發育后期特異性啟動子下游，使表達該融合基因的花粉敗育。將篩選標記基因融合于愈傷組織和種皮特異性啟動子下游，從而可以對轉化個體的愈傷組織和種皮進行篩選。將二者緊密連鎖構建于表達載體的T-DNA區。2)利用農桿菌介導的轉化法轉化水稻，通過篩選標記基因對轉化細胞進行篩選， 進而分化成再生植株。3)分子生物學檢測利用PCR，Southern blot方法對轉基因植株進行篩選及鑒定。4)花粉致死能力的測定采用I2-KI染色法，觀察轉基因植株上的花粉類型并判斷其育性。5)利用X2-檢驗統計轉基因植株自交所結種子種熒光種子(轉基因種子)與非熒光種子(非轉基因種子)的比例是否附合1:1。


圖1顯示了實施例1中植物表達載體PSPT05結構示意圖。圖2顯示了實施例2中經農桿菌轉化后表達紅色熒光蛋白的水稻愈傷組織。圖3顯示了實施例2中經農桿菌轉化后獲得的再生水稻植株。圖4顯示了實施例3中部分植株的PCR鑒定(M: DNA分子量標準；負/陰性對照；+ :正/陽性對照)。圖5顯示了實施例4中部分轉基因植株的Southern blot鑒定(N 陰性對照，M:分子量標準；質粒以轉化質粒作為陽性對照)。 圖6顯示了實施例5中花粉I2-KI染色后的花粉粒。
具體實施例方式
下面結合實施例和附圖具體描述本發明的技術方案，但不限于此。本發明實施例中具體涉及兩個基因，和RP。ZM-AAl編碼淀粉酶，在花粉發育后期特異性啟動子的驅動下，它可在成熟花粉后期表達出淀粉酶，從而降解花粉粒中的淀粉，最終使花粉敗育，其核苷酸序列及氨基酸序列分別見SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ； ^基因用作篩選標記基因，來源于礁珊瑚(Discosoma sp.)，它可編碼紅色熒光蛋白，可被激發出紅色熒光，便于轉基因的愈傷組織和種子的篩選，其核苷酸序列及氨基酸序列分別見 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID N0. 4。實施例1 構建表達載體
本發明中轉化所使用表達載體名稱為PSPT05 (附圖1)。該載體是在pPZP基礎上人工構建而來。表達載體上有2個基因表達盒:Z￥-AAJ基因表達盒，該表達盒由來自玉米的花粉發育后期特異性啟動子PG47驅動(其核苷酸序列見SEQ ID N0. 5)，并由來自玉米的終止子IN2-1終止轉錄(其核苷酸序列見SEQ ID N0. 6)，另外轉運肽ZM-BTl融合于ZM-AAl基因與PG47啟動子之間，ZM-BTl的核苷酸序列見SEQ ID N0. 7，報告/篩選標記基因RP基因表達盒，該表達盒由來自玉米的愈傷組織和種子特異性啟動子END2驅動(其核苷酸序列見SEQ ID N0. 8)，并由來自馬鈴薯的終止子PIN II終止轉錄，PIN II的苷酸序列見SEQ ID N0. 9。T-DNA區段內不含抗生素抗性標記基因，也不含除草劑篩選標記基因。實施例2 獲得轉基因水稻植株
將實施例1中轉化載體用電擊法導入農桿菌菌株AGLO中，用于轉化野生型中花11誘導的愈傷組織。利用紅色熒光蛋白對轉化愈傷組織進行篩選，附圖2為表達外源基因的愈傷組織，進一步將其分化再生出表達外源基因的轉化植株(附圖3)。實施例3 轉基因植株的PCR檢測
取實施例2中的轉基因水稻植株葉片，抽取總DNA。以/ 基因序列為模板設計引物，對Ttl代轉基因水稻基因組DNA進行PCR擴增。擴增產物片段為789bp。擴增程序為 940C IOmin ；94°C lmin，60°C lmin, 72°C Imin ；37 循環；72°C IOmin0 正向引物序列為 5，-GGACTTGAACTCCACCAGG-3，；反向引物序列為5，-ATAATGCCAATACGACACC-3，。附圖 4 為部分轉基因植株PCR擴增結果，說明外源基因已整合至水稻受體基因組中。實施例4 轉基因植株的Southern Blot檢測
對Ttl代轉基因水稻基因組DNA進行Southern Blot檢測，以鑒定外源基因在水稻轉化受體中的整合情況。取實施例2中Ttl代轉基因水稻植株葉片，抽取總DNA。以/^基因序列中的M6bp核苷酸片段為探針，選用NEB公司的Ih I限制性內切酶進行消化反應。酶切反應體系為 200ul 基因組 DNA15ug、NE Buffer 20ul、BSA 2ul、損a I 4ul (20U/ul)并用無離子水將體系補足至200 uL· 37°C溫育6小時。附圖5為部分轉基因植株Southern Blot檢測結果。結果表明，外源基因已整合至受體水稻基因組中。實施例5 花粉致死能力的測定
采用I2-KI染色法，觀察轉基因水稻花粉的形態并判斷其育性(附圖6)。共調查了花粉1995粒，正常可育花粉為1015粒(50. 8%)，不育花粉為980粒2%)。對二者是否符合 1:1分離規律進行了 X2-檢驗(自由度為1)。X2值為0.614，遠低于顯著水平0.05時的臨界值3. 814，證明二者比例在P < 0. 05水平符合1:1。因此認為基因殺花粉功能徹底。
序列表
〈110〉北京未名凱拓作物設計中心有限公司
北京凱拓迪恩生物技術研發中心有限責任公司 〈120〉一種有效降低轉基因植物通過花粉介導基因漂移的方法 〈160〉 9
<170> PatentIn version 3. 3 〈210〉 1 〈211〉 1561 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(徹 mays) 〈400〉 1
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca60
ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc120
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<210> 2 <211> 519 <212> PRT
<213> 玉米(Zea mays) <400> 2
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Ser Trp Ser Ser Leu Gln Val Pro Ala Val Ala Phe Pro Trp Lys Pro
202530
Arg Gly Gly Lys Thr Gly Gly Leu Glu Phe Pro Arg Arg Ala Met Phe
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Gln Ala Gln Val Leu Phe Gln Gly Phe Asn Trp Glu Ser Cys Lys Gln
859095
Gln Gly Gly Trp Tyr Asn Arg Leu Lys Ala Gln Val Asp Asp lie Ala
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Lys Ala Gly Val Thr His Val Trp Leu Pro Pro Pro Ser His Ser Val
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Ser Pro Gln Gly Tyr Met Pro Gly Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser
130135140
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Gly Arg Gly Val Gln Cys Val Ala Asp lie Val lie Asn His Arg Cys
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Asp Gly Trp Arg Leu Asp Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Pro Ala Val Ala
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Arg Met Tyr Val Glu Ser Thr Gly Pro Pro Ser Phe Val Val Ala Glu
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Ala Gly Leu lie Gly Trp Ala Pro Glu Lys Ala Val Thr Phe Val Asp
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Lys Leu Arg lie Leu Val Ala Asp Ala Asp Ala Tyr Val Ala Val Val
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450455460
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Val Trp Glu Lys Ala Ser Leu Arg Val Pro Ala Gly Arg His Leu Gln
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<210> 4 <211> 225 <212> PRT <213>人工合成 <400> 4
Met Ala Ser Ser Glu Asn Val lie Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val 151015
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Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val
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505560
Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp lie Pro 65707580
Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val
859095
Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser
100105110
Leu Gln Asp Gly Cys Phe lie Tyr Lys Val Lys Phe lie Gly Val Asn
115120125
Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu
130135140
Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu 145150155160
Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu165170175
Phe Lys Ser lie Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr
180185190
Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp lie Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr
195200205
Thr lie Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe 210215220
Leu 225
<210> 5 <211> 2771 <212> DNA
<213> 玉米(Zea mays) <400> 5
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ttaaatcaaa ggtggatccc ttggggtacc aaagaccaaa tttaggagtg taaactaaat1620
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gatcacgaca c2771 〈210〉 6 〈211〉 348 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(徹 mays) 〈400〉 6
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tttgggtccc aagctacttt agactgtgtt cggcgttccc cctaaatttc tccccctata300
tctcactcac ttgtcacatc agcgttctct ttcccctata tctccacg348 〈210〉 7 〈211〉 225 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(徹 mays) 〈400〉 7
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca60ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc120
gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg180
gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcg225 〈210〉 8 〈211〉 944 〈212〉 DNA
〈213〉玉米(徹 mays) 〈400〉 8
gatccagctt cgcttagttt ttagtttttg gcagaaaaaa tgatcaatgt ttcacaaacc60
aaatattttt ataacttttg atgaaagaag atcaccacgg tcatatctag gggtggtaac120
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aataaatacg aataaagtct gattctaatc tgattcgatc cttaaatttt ataatgcaaa240
atttagagct cattaccacc tctagtcata tgtctagtct gaggtatatc caaaaagccc300
tttctctaaa ttccacaccc aactcagatg tttgcaaata aatactccga ctccaaaatg360
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cacactcaaa actaattaat aaaatacgtg gttgttgaac gtgcgcacat gtctccctta480
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catgcaactc tagtattgac acttgtatag catataatgc caatacgaca cctgccttac720
atgaaacatt atttttgaca cttgtatacc atgcaacatt accattgaca tttgtccata780
cacattatat caaatatatt gagcgcatgt cacaaactcg atacaaagct ggatgaccct840
ccctcaccac atctataaaa acccgagcgc tactgtaaat cactcacaac acaacacata900
tcttttagta acctttcaat aggcgtcccc caagaactag taac944 〈210〉 9 〈211〉 318 〈212〉 DNA
〈213〉馬鈴薯{Solanum tuberosum) 〈400〉 9
agacttgtcc atcttctgga ttggccaact taattaatgt atgaaataaa aggatgcaca60
catagtgaca tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac120
tagttatctg aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac180
gtgtctttat aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat240
aaatattaat catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg300
tgttttgcga atgcggcc318
權利要求
1.一種防止外源基因從轉基因植物漂移到其它植物和環境中的方法，此方法包括a)一段編碼玉米α-淀粉酶基因的核苷酸序列，所述序列連接于花粉特異性啟動子；b)將(a)中的核苷酸序列轉化水稻；c)將轉化細胞再生成植株。
2.權利要求書1中，花粉特異性啟動子為PG47啟動子。
3.權利要求書1中獲得的轉基因植株包含由花粉特異啟動子驅動的玉米α-淀粉酶基因，并與熒光篩選標記基因FP緊密連接。
全文摘要
本發明提供了一種有效地降低轉基因植物通過花粉傳播導致環境風險的方法。本方法中，兩個緊密連鎖的基因表達盒轉入中花11野生型材料，這兩個基因表達盒是，1)花粉致死基因，ZM-AA1,由花粉發育后期特異性啟動子PG47驅動；2)熒光篩選標記基因FP,由愈傷組織/種皮特異性啟動子END2驅動。攜帶單拷貝轉基因的單株在自交結實過程中，沒有攜帶轉基因的花粉粒能與雌配子正常受精而結實，而攜帶轉基因的花粉粒在花粉發育后期敗育，不能與雌配子受精，從而降低了轉基因在環境中漂移的風險。
文檔編號A01H4/00GK102477443SQ20101056355
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月29日 優先權日2010年11月29日
發明者萬向元, 周君莉, 王海洋, 鄧興旺 申請人:北京凱拓迪恩生物技術研發中心有限責任公司, 北京未名凱拓作物設計中心有限公司