專利名稱：一種川貝母培養物快速生產中的有效除菌方法
技術領域：
本發明涉及一種川貝母培養物快速生產中的有效除菌方法。
背景技術：
名貴藥材川貝母是百合科多年生草本植物川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)的干燥鱗莖，為最常用、最有效的止咳化痰藥，常用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞 嗽，咯痰帶血，其有效成分主要為貝母生物堿和留體皂甙類。隨著各種止咳化痰藥物的開發 和大量的需求，川貝母的用量不斷增加，而僅靠采挖野生川貝母已遠遠不能滿足藥材市場 的需求。植物組織培養技術不但可以有效的解決藥用植物對溫度、土質、氣候等條件的依 賴，還能快速、高效的生產藥用植物有效成分。自1956年Routine和Nickel首次通過植物 培養生產有用次級代謝產物以來，藥用植物組織培養的研究工作取得了較大的進展，已有 上百種植物代謝產物通過細胞培養技術獲得，近半數次級代謝產物的含量超過原植物。因 此，運用現代生物技術的組織培養手段獲得川貝母藥材的有效組份是解決當前川貝母藥材 供不應求的重要途徑。經研究發現利用組織培養技術生產川貝母培養物25天生物量可增加約3. 5倍， 生物堿含量是野生川貝母的2倍左右。但是，在川貝母培養物快速無菌培養生產過程中，由 于一些原因會造成培養材料出現染菌的情況。由于培養材料一旦出現染菌后會嚴重抑制其 生長和有效組份的積累，并且最終導致培養材料的死亡，從而會對快速生產造成巨大的經 濟損失。因此如何有效地清除川貝母培養物快速生產中出現的染菌問題具有非常重要的意 義。目前所采用的解決方法一般是將染菌的材料取出后，用酒精和升汞對材料進行二次消 毒處理。由于川貝母培養材料細胞幼嫩，且長期生活在人工培育的優越環境條件下，細胞抵 御外界環境的能力已降低，再次經酒精和升汞消毒處理后，會造成培養材料的大量褐化、死 亡。因此，當前在川貝母培養物快速生產過程中，一旦出現培養材料染菌后一般都是采取終 止培養，丟棄培養物，從而造成了大量的人力、物力和財力的浪費。
發明內容
本發明的目的在于提供一種川貝母培養物快速生產中的有效除菌方法，該方法既 能有效除菌，又不會造成培養材料褐化、死亡。為達到上述目的，本發明采用的解決方法包括下列步驟(1)染菌材料的選取定期觀察川貝母培養材料生長狀況，一旦肉眼觀察到材料 或培養基中有細菌產生時，即將培養材料取出；(2)預處理將取出的培養材料先用無菌水沖洗2 5次，并用無菌濾紙反復吸干 材料表面的水分，再放入頭孢噻肟鈉濃度為200 500mg -L"1的抗生素水中浸泡6 12min， 其間不停振蕩，取出后用無菌濾紙反復吸干材料表面的水分；(3)液體除菌將預處理后的材料接入含有抗生素的MS+6-BA2. Omg · L^+NAA0. 3mg · L-1+蔗糖30g · L-1液體培養基中培養1 2周，搖床轉速100 120r · mirT1，培養 條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C，所述抗生素的種 類及濃度為頭孢噻肟鈉300mg · Γ1 800mg · Γ1或頭孢噻肟鈉150mg · Γ1 300mg · Γ1+ 頭孢曲松鈉 150mg · L-1 300mg · L-1 ；(4)第一次固體除菌取出經液體除菌的材料，用無菌濾紙反復吸干材料表面 的水分，再接入含有與(3)步驟相同種類和濃度的抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1固體培養基中進行第一次除菌培養，培養時間 為25 30天，培養條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001χ，溫度18 22 0C ；(5)第二次固體除菌取出經⑷步驟除菌后的材料，轉接入含有與⑷步驟相 同種類但濃度減半的抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · L-1+蔗糖30g · L-1+瓊脂 6. 5g · L—1固體培養基中進行第二次除菌培養，培養時間為25 30天，培養條件為每天光 照8 12小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C ；(6)除菌檢測取出經(5)步驟除菌后的材料，轉接入無抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1的固體培養基中進行繼代培養， 在培養25 30天后觀察材料除菌情況，并統計除菌率，除菌率=(除菌后無菌材料數/除 菌材料總數)X 100%。本發明是依據抗生素對細菌生長的抑制作用，通過采用特定的步驟而對快速生產 川貝母培養物中的染菌材料進行除菌的，所采用的頭孢噻肟鈉屬于非口服型的第三代頭孢 菌素，其作用機理是通過干擾細菌細胞壁的主要成分肽聚糖的合成來實現抑制細菌生長 的。所采用的具體步驟是將染菌的川貝母培養材料先用無菌水沖洗后放入抗生素水中浸泡 一定時間，并用濾紙吸干水份后接入含有特定種類和濃度的抗生素的液體培養中進行液體 除菌培養一定時間后，取出吸干水份再轉接入含有相同種類和濃度的抗生素的固體培養基 中進行第一次固體除菌培養，最后再轉接入含有相同種類但濃度減半的抗生素的固體培養 基中完成第二次固體除菌培養。本發明能在不傷害培養物的情況下有效地清除川貝母培養 物在快速生產中出現的細菌污染，其最高除菌率達92.7%，大大地降低了川貝母培養物因 染菌而造成的重大經濟損失。
具體實施例方式實施例1(1)染菌材料的選取定期觀察川貝母培養材料生長狀況，一旦肉眼觀察到材料 或培養基中有細菌產生時，即將培養材料取出；(2)預處理將取出的培養材料稍作修整，然后用無菌水沖洗2 5次，并用無菌 濾紙反復吸干材料表面的水分，再放入頭孢噻肟鈉含量為400mg ·廠1的抗生素水中浸泡 lOmin，其間不停振蕩，取出后用無菌濾紙反復吸干材料表面的水分；(3)液體除菌將預處理后的材料接入含頭孢噻肟鈉300mg · Γ1和頭孢曲松鈉 150mg · Γ1 的 MS+6-BA 2. Omg · L_1+NAA 0. 3mg · Γ1+ 蔗糖 30g · Γ1 液體培養基中進行除菌 培養10天，搖床轉速100 120r · mirT1，培養條件為每天光照8 12小時，光照強度為 1000 16001X，溫度 18 22°C ；
(4)第一次固體除菌取出經液體除菌的材料，用無菌濾紙反復吸干材料表面的 水分，再接入含頭孢噻肟鈉300mg Γ1和頭孢曲松鈉150mg 的MS+6-BA 2. Omg 'L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1固體培養基中進行第一次除菌培養，培養時間 為25 30天，培養條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001χ，溫度18 22 0C ；(5)第二次固體除菌取出經⑷步驟除菌后的材料，轉接入含頭孢噻肟鈉 150mg · L-1 禾口頭孢曲松鈉 75mg · L-1 的 MS+6-BA 2. Omg · L_1+NAA 0. 3mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 瓊脂6. 5g · L—1固體培養基中進行第二次除菌培養，培養時間為25 30天，培養條件為每 天光照8 12小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C ；(6)除菌檢測取出經(5)步驟除菌后的材料，轉接入無抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1的固體培養基中進行繼代培養， 培養25天后統計除菌率為92. 7%。 實施例2將實施例1中的液體培養基和第一次固體除菌的培養基中的抗生素改為頭孢噻 肟鈉600mg ·廠1，第二次固體除菌的培養基中的抗生素改為頭孢噻肟鈉300mg · L—1，其它步 驟同實例1，除菌率為89.4%。說明單獨使用恰當濃度的頭孢噻肟鈉，也能實現對川貝母培 養物的有效除菌。實施例3將實例1中的液體培養基和第一次固體除菌的培養基中抗生素改為頭孢噻肟鈉 SOOmg · L—1，第二次固體除菌的培養基中抗生素改為頭孢噻肟鈉400mg · L、其它步驟同實 例1，除菌率為91. 9% ；但培養材料開始出現變黃、褐化現象，且生長明顯受到抑制，這說明 高濃度的抗生素在除菌的同時也對培養材料有一定的毒害作用。
權利要求
1. 一種川貝母培養物快速生產中的有效除菌方法，其特征在于包括下列步驟(1)染菌材料的選取定期觀察川貝母培養材料生長狀況，一旦肉眼觀察到材料或培 養基中有細菌產生時，即將培養材料取出；(2)預處理將取出的培養材料先用無菌水沖洗2 5次，并用無菌濾紙反復吸干材料 表面的水分，再放入頭孢噻肟鈉濃度為200 500mg ·廠1的抗生素水中浸泡6 12min，其 間不停振蕩，取出后用無菌濾紙反復吸干材料表面的水分；(3)液體除菌將預處理后的材料接入含有抗生素的MS+6-BA2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · L-1+蔗糖30g · L-1液體培養基中培養1 2周，搖床轉速100 120r · mirT1，培養 條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C，所述抗生素的種 類及濃度為頭孢噻肟鈉300mg · Γ1 800mg · Γ1或頭孢噻肟鈉150mg · Γ1 300mg · Γ1+ 頭孢曲松鈉 150mg · L-1 300mg · L-1 ；(4)第一次固體除菌取出經液體除菌的材料，用無菌濾紙反復吸干材料表面的水分， 再接入含有與⑶步驟相同種類和濃度的抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+ 蔗糖30g -Γ1+瓊脂6. 5g 固體培養基中進行第一次除菌培養，培養時間為25 30天， 培養條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001χ，溫度18 22°C ；(5)第二次固體除菌取出經(4)步驟除菌后的材料，轉接入含有與(4)步驟相同種類 但濃度減半的抗生素的 MS+6-BA2. Omg · L^+NAAO. 3mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 瓊脂 6. 5g · L-1 固體培養基中進行第二次除菌培養，培養時間為25 30天，培養條件為每天光照8 12 小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C ；(6)除菌檢測取出經(5)步驟除菌后的材料，轉接入無抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1的固體培養基中進行繼代培養， 在培養25 30天后觀察材料除菌情況，并統計除菌率。
全文摘要
本發明公開了一種川貝母培養物快速生產中的有效除菌方法，該方法主要是依據抗生素對細菌生長的抑制作用，通過采用特定的步驟而對快速生產川貝母培養物中的染菌材料進行除菌的，所采用的步驟包括染菌材料的選取→預處理→液體除菌→第一次固體除菌→第二次固體除菌→除菌檢測。本發明能在不傷害培養物的情況下有效地清除在川貝母培養物快速生產中出現的細菌污染，其最高除菌率達92.7％。
文檔編號A01N65/42GK102100177SQ201010551099
公開日2011年6月22日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年11月19日
發明者代勇, 代娟, 徐世軍, 李楊, 王曉蓉, 王躍華, 蔣婷婷, 蕾蕓 申請人:成都大學