專利名稱：一種大別山冬青離體快繁的方法
技術領域：
本發明涉及大別山冬青1# (Ilex dabieshanensis K Yao.et M.P.Deng.)組織培養繁殖
方法，屬于木本植物種苗繁殖的技術領域。
背景技術：
大別山冬青(Ilexdabieshanensis K Yao.et M.P.Deng.)屬冬青科(Aquifoliaceae)冬 青屬(Ilex)植物。常綠小喬木，高約5米，全株無毛，樹皮灰白色，平滑；小枝暗紅色， 具棱角，葉革質，卵狀長圓形、卵形或橢圓形，先端急尖呈刺尖狀，基部近圓形，邊緣 稍反卷，具4-8對刺齒，上面深綠色，具光澤，花期3-4月，果期10-11月，核果近圓球 形至橢圓形，成熟時鮮紅色。耐修剪；喜光耐半陰，抗寒耐旱；土壤要求不高，在酸性 及含腐殖質多的土壤中生長茂盛，要求肥沃，濕潤而排水好；喜溫暖濕潤氣候，年平均 溫度16°C為宜，能耐最高溫度為39°C，較耐寒，_8°C也不受凍害，花期遇低溫會影響開 花授粉和花的發育。大別山冬青1#為江蘇省中國科學院自主選育出的優良品種，該樹種適宜于庭園 綠化，觀賞，四季常青，葉色青翠，果實紅艷，耐熱、耐旱，適宜于庭院、草坪孤植， 綠籬建植，高速公路兩旁綠化，是國內外都深受人們喜歡的優良常綠闊葉樹種之一，也 是制作盆景的好材料，是近年開發的新、優園林綠化樹種之一，有廣闊的應用前景。目前該品種種苗數量在國內非常少，相關研究表明大別山冬青1#的種子繁殖和 扦插繁殖還未突破，因此大別山冬青1#資源非常缺乏，且應用也是“有市無貨”。木本植物組織培養研究起步于20世紀50年代初，直到70年代后期才得到較大 的發展。目前，不完全統計有90多屬300多種木本植物經組織培養獲得再生植株。而 關于冬青屬植物組織培養的研究，國內外報道很少。近5年，僅見有報道對冬青(Ilex chinensis Sims)(見溫州農業科技，2007年第4期，冬青的組織培養與快速繁殖技術)、和 美洲冬青[Ilex verticillata(Linn.) A.Gray](見植物生理學通訊，2007年第2期，美洲冬青的 組織培養與快速繁殖)進行組織培養，而關于大別山冬青1#的離體快繁研究尚未見有報 道。綜上所述，采取組織培養繁殖大別山冬青1#是解決大別山冬青1#資源短缺的重 要途徑之一，對大別山冬青1#的開發和推廣利用都具有著非常重要的意義。
發明內容
本發明主要解決的技術問題是公開大別山冬青1#的組織培養繁殖方法。為解決該技術采用如下的技術方案A)外植體消毒；B)芽的分化誘導取消毒后的外植體切割為1.0-1.5cm長的莖段，其中每 個莖段帶一個腋芽，將莖段接種于誘導培養基中進行芽的分化誘導，控制培養溫度在 20-26首先在黑暗中培養20-26h，然后進行正常培養25-35天，所述正常培養為光照時間10-16h/天，光照強度為1600-2000Ix ；C)繼代培養與增殖將步驟B)中所 得大別山冬青1#嫩梢切割后接入繼代培 養基中進行繼代培養25-35天，培養溫度20-26°C，光照時間10_16h/天，光照強度為 1600-2000Ix ；D)根的誘導將步驟C)所得大別山冬青1#試管苗接入生根培養基中進行生根 培養10-15天，培養溫度20-26°C，光照時間10-16h/天，光照強度為1600-2000Ix。外植體可選擇大別山冬青1#的一年生扦插苗當年生枝條上帶腋芽的莖段；步驟 A)中的外植體消毒過程為用清水沖洗干凈，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液搖床 上振蕩消毒15_20min，流水沖洗20_30min后，于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50_60s， 立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每次振蕩3_5min。步驟B)和步驟C)中可采用MS基本培養基添加激素細胞分裂素、植物生 長素和赤霉素等三類激素，其中步驟B)中采用的誘導培養基為MS+6-BA0.5mg/ L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L,步驟 C)中采用的繼代培養基為 MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L ；步驟 D)中可采用的生根培養基為 l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L ；同時步驟B)、C)、D)中采用的培養基中還可添加 瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同時控制培養基pH為5.8-6.0。本發明相對現有技術的有益效果為采用組織培養的方法對大別山冬青1#進行 繁殖，能夠有效的得到大量的大別山冬青1#無菌苗，解決大別山冬青1#資源短缺的問 題；通過對外植體、誘導培養基、繼代培養基及生根培養基的選取，能夠使得萌發率達 IlJ 70-90%,增殖率達到5-8倍，生根率達到95-100%，能夠高效的得到大別山冬青1# 無菌苗。
具體實施例方式實施例一1、選取50株茁壯的大別山冬青1#一年生扦插苗。剪取當年生嫩梢部分，去除 葉片，以莖段為外植體，每莖段帶一腋芽，長約2cm。將外植體用清水沖洗干凈，然后 用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液搖床上振蕩消毒15min。流水沖洗20min后，于無菌操作 臺上用75%乙醇消毒50s，立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每 次振蕩3min。將消毒滅菌過的外植體兩端分別切除0.5cm，以去除受傷部分。接入誘導 培養基 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L 中。每瓶接 3 株， 共接入50瓶。在溫度24°C，光照時間IOh/天，光強20001x的條件下，進行培養。2、外植體接入培養基7d后，腋芽開始萌動。至30d時，污染10株，萌發率達 75%,共獲得105株不帶根的初代無菌苗。無菌苗株高約4cm，每株莖上帶有已萌動的 腋芽3至6個。將葉片去除，主干切為帶芽莖段，每段帶一個腋芽，共得420段。接入 繼代增殖培養基MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L中，培養條件同上。培 養15d后，腋芽開始陸續出梢，30d后，增殖率達到8.6倍，即每株繼代苗上平均含有8.6 個腋芽，共得到腋芽3612個。3、將第1次繼代增殖得到的繼代無菌苗切為帶2個或3個腋芽的莖段，得到莖 段1204段。進行第2次繼代，IOd后腋芽開始出梢，30d后得到平均帶有8個腋芽的無菌苗1150株(其余20株污染，34株未萌動)。重復進行第3次繼代，得到莖段3070段， 30d后獲得平均帶有6個腋芽的繼代無菌苗約3000株(其余20株污染，50株未萌動)。4、將經過3次繼代的無菌苗切成帶2個或3個腋芽的小段，接入生根壯苗培養 基l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L，共接入6000株，培養條件同上。培養IOd后， 開始生根，15d后生根率達100%，至此獲得帶根無菌苗6000株。以上培養基中還添加瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同時控制培養基pH為5.8-6.0。實施例二 1、選取30株茁壯的大別山冬青1#一年生扦插苗。剪取地上部分，去除葉片， 以莖段為外植體，每莖段帶一腋芽，長約2cm。將外植體用清水沖洗干凈，然后用洗衣 粉漂洗一次，用84消毒液搖床上振蕩消毒18min。流水沖洗25min后，于無菌操作臺上 用75%乙醇消毒55s，立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每次振 蕩4min。將消毒滅菌過的外植體兩端分別切除0.5cm，以去除受傷部分。接入誘導培養 基 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L 中。每瓶接 3 株，共接 入50瓶。在溫度25°C，光照時間16h/天，光強16001x的條件下，進行培養。2、外植體接入培養基9d后，腋芽開始萌動。至35d時，污染20株，萌發率達 80%,共獲得104株不帶根的初代無菌苗。無菌苗平均株高4.5cm，每株莖上帶有已萌動 的腋芽3至6個。將葉片去除，主干切為帶芽莖段，每段帶一個腋芽，共得到莖段420 段。接入繼代增殖培養基MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L中，培養條件 同上。培養IOd后，腋芽開始陸續出梢，30d后，增殖率達到7.2倍，即每株繼代苗上平 均含有7.2個腋芽，共得腋芽3024個。3、將第1次繼代增殖得到的繼代無菌苗切為帶2個或3個腋芽的莖段，得到莖 段1008段。進行第2次繼代，IOd后腋芽開始出梢，30d后得到平均帶有8個腋芽的無 菌苗968株(其余10株污染，30株未萌動)。重復進行第3次繼代，得到莖段2581段， 30d后獲得平均帶有6個腋芽的繼代無菌苗約2500株(其余11株污染，71株未萌動)。4、將經過3次繼代的無菌苗切成帶2個或3個腋芽的小段，接入生根壯苗培養 基l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L，共接入5000株，培養條件同上。培養IOd后開 始生根，15d后生根率達97%。至此獲得含根無菌苗4850株。以上培養基中還添加瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同時控制培養基pH為5.8-6.0。實施例三1、選取40株茁壯的大別山冬青1#一年生扦插苗。剪取地上部分，去除葉片， 以莖段為外植體，每莖段帶一腋芽，長約2cm。將外植體用清水沖洗干凈，然后用洗衣 粉漂洗一次，用84消毒液搖床上振蕩消毒20min。流水沖洗30min后，于無菌操作臺上 用75%乙醇消毒60s，立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每次振 蕩5min。將消毒滅菌過的外植體兩端分別切除0.5cm，以去除受傷部分。接入誘導培養 基 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L 中。每瓶接 3 株，共接 入50瓶。在溫度26°C，光照時間16h/天，光強16001x的條件下，進行培養。2、外植體接入培養基IOd后，腋芽開始萌動。至35d時，污染10株，萌發率 達87.10%，共獲得122株不帶根的初代無菌苗。無菌苗平均株高4.5cm，每株莖上帶有 已萌動的腋芽3至6個。將葉片去除，主干切為帶芽莖段，每段帶一個腋芽，共得莖段488 段。接入繼代增殖培養基 MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L 中，培養
條件同上。培養13d后，腋芽開始陸續出梢，30d后增殖率達到5.3倍，即每株繼代苗平均含有5.3個腋芽，共得腋芽2585個。3、將第1次繼代增殖得到的繼代無菌苗切為帶2個或3個腋芽的莖段，得到莖 段861段。進行第2次繼代，5d后腋芽開始出梢，30d后得到平均帶有8個腋芽的無菌 苗800株(其余61株未萌動)。重復進行第3次繼代，得到莖段2133段，30d后獲得平 均帶有6個腋芽的繼代無菌苗約2100株(其余33株未萌動)。4、將經過3次繼代的無菌苗切成帶3個腋芽的小段，接入生根壯苗培養基 l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L,共接入4200株，培養條件同上。培養IOd后開始 生根，15d后生根率達95%。至此獲得含根無菌苗3990株。以上培養基中還添加瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同時控制培養基pH為5.8-6.0。
權利要求
1.大別山冬青1#組織培養繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟A)外植體消毒；B)芽的分化誘導取消毒后的外植體切割為1.0-1.5cm長的莖段，其中每個莖段帶 一個腋芽，將莖段接種于誘導培養基中進行芽的分化誘導，控制培養溫度在20-26°C， 首先在黑暗中培養20-26h，然后進行正常培養25-35天，所述正常培養為光照時間 10-16h/ 天，光照強度為 1600-2000Ix ；C)繼代培養與增殖將步驟B)中所得大別山冬青1#嫩梢切割后接入繼代培養 基中進行繼代培養25-35天，培養溫度20-26°C，光照時間10_16h/天，光照強度為 1600-2000Ix ；D)根的誘導將步驟C)所得大別山冬青1#試管苗接入生根培養基中進行生根培養 10-15天，培養溫度20-26°C，光照時間10-16h/天，光照強度為1600-2000Ix。
2.根據權利要求1所述的大別山冬青1#組織培養繁殖方法，其特征在于，步驟A)中 的外植體選取大別山冬青1#的一年生扦插苗。
3.根據權利要求1或2所述的大別山冬青1#組織培養繁殖方法，其特征在于，步驟 A)中的外植體消毒過程為用清水沖洗干凈，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液搖床 上振蕩消毒15_20min，流水沖洗20_30min后，于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50_60s， 立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每次振蕩3_5min。
4.根據權利要求1所述的大別山冬青1#組織培養繁殖方法，其特征在于，步驟B)中 采用的誘導培養基為MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L。
5.根據權利要求1所述的大別山冬青1#組織培養繁殖方法，其特征在于，步驟C)中 采用的繼代培養基為MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.3mg/L。
6.根據權利要求1所述的大別山冬青1#組織培養繁殖方法，其特征在于，步驟D)中 采用的生根培養基為l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L。
7.根據權利要求4至6中任何一項所述的大別山冬青1#組織培養繁殖方法，其特征 在于，所述的培養基中還含有瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，培養基pH為5.8-6.0。
全文摘要
本發明提供了大別山冬青(Ilex dabieshanensis K Yao.et M.P.Deng.)組織培養繁殖方法，包括以下步驟首先進行外植體消毒，消毒后接種于誘導培養基中進行芽的分化誘導，控制培養溫度在20-26℃，先在黑暗中培養20-26h，然后在光照時間10-16h/天、光照強度為1600-2000Ix下進行正常培養25-35天，接著將所得大別山冬青嫩梢切割后接入繼代培養基中進行繼代培養25-35天，最后將大別山冬青無菌苗接入生根培養基中進行生根培養10-15天，培養溫度20-26℃，光照時間10-16h/天，光照強度為1600-2000Ix。通過該方法能夠有效的解決大別山冬青快速推廣的問題。
文檔編號A01H4/00GK102017896SQ201010543619
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月15日 優先權日2010年11月15日
發明者李乃偉, 李云龍, 郭忠仁, 陸小清 申請人:江蘇省·中國科學院植物研究所