專利名稱：冷凍保存細胞的系統和方法
技術領域：
本申請涉及用于冷凍保存細胞(例如哺乳動物的細胞)以及組織樣本/樣品的儲存方法和相關裝置。
背景技術：
細胞和組織經常被冷凍保存以暫時地延長其生物醫學上的生存能力和有效性。冷凍保存的過程部分地包括將細胞放進包含電解液和在冷凍過程期間保護細胞的化學化合物(防凍劑)的水溶液中。該防凍劑通常是小分子量的分子，例如甘油、丙二醇、乙二醇或二甲亞砜(DMSO)。當這些溶液被冷卻到稍低于其凝固點的溫度時，溶液保持處于液體狀態。這種在溶液的相變溫度下其保持液態的情況稱為過冷現象。當水溶液被進一步冷卻到其凝固點之下時，過冷的程度加劇。在不干預時，在通常凝固點之下不大于15°C的點處，溶液中的水分子將自然結晶，并且純水將凝結為冰。在從液態轉變為固態的轉變過程中，溶液從高自由能狀態移到低自由能狀態，從而導致放熱反應。在該相變期間產生的熱量使樣本瞬時變熱，在該過程中樣本溫度升高。同時周圍環境(例如正冷凍保存樣本的裝置)保持在恒溫狀態或繼續冷卻(取決于使用的冷卻方法)。接著，隨著樣本中的熱量消散，在該事件期間在樣本和冷卻裝置之間的熱的不平衡使樣本經歷快速冷卻速率以重新建立熱平衡。在許多情況下這種快速冷卻速率導致細胞內冰的形成，這通常導致細胞死亡。這種細胞內冰的形成通常取決于樣本的質量、樣本容器的傳熱特性、使用的冷卻方案以及細胞的基本低溫生物特性。凍結狀態與生物系統之間的關系已吸引人類很多年了。早在1683年，玻意耳 (Robert Boyle)發現一些魚和青蛙在低于冰點的溫度可以存活短暫的時間段，如果其體內水分的一部保持未被凍結。人工誘導冷凍保存首先在1948年由Polge、Smith和Parkes通過偶然發現甘油對家禽和牛精子以及隨后對于紅血球的防冷凍特性而被發現。在更近的時期，對與冷凍生物系統相關的自然現象和生物醫學應用有興趣的科學家已開始研究控制關系的基本過程。首先，已知的是，下降的溫度導致代謝活動被抑制，并因此導致速率的減小， 在該減小的速率下無營養的生物系統的退化將會發生。但是，冷凍過程并不能如人所設想的開始；其通常導致可以預計到的化學的、熱量的和電特性的極端變化，以改變細胞內的細胞器、細胞膜以及與組織和器官相關的精密的細胞間交互作用系統。當然，已知即使最簡單的生物細胞的極端復雜性，因此值得注意的是由冷凍所得的假死的可逆狀態是完全可能的。由于甘油的防冷凍作用的首先發現以及廣泛使用的滲透防凍劑二甲亞砜(DMSO) 的隨后發現，許多研究者已致力于主要通過經驗的方法的細胞或組織的保存。大多數細胞懸浮液冷凍保存方案已建立了使用克分子濃度的滲透防冷凍添加劑以能實現冰凍存活率。 通過使用這些人工防凍劑，許多靈活性被添加到冷凍保存過程。例如，為了在沒有添加防冷凍劑(CPA)的情況下達到最佳存活率，人類紅血球需要以1000°C/min左右的速率被冷卻。 但是在存在3. 3M(30% )的甘油的情況下，這種細胞類型的存活率在冷卻速率2-31og范圍 (2-31og range)上保持90%左右。如可以預見的，CPA濃度越高，在添加/去除物質期間滲透破壞的可能性越大，并因此在這些過程中需要更多的關注。在任一冷凍保存過程中，所包含的溶液將在其凝固點以下過冷，直到其找到結晶的任意成核點。當通過冷凍-解凍方法冷凍保存時，細胞外介質內的結冰通過處于過冷的低度處的引晶故意地引發。如果結冰不是由引晶引起，那么當溶液被足夠低地冷卻到其平衡凝固點之下時，冰將會自然形成。因為該過程實際上是任意的，所以結冰將在任意地不可預測的溫度下發生；從而，在利用同一冷凍方案的重復的試驗之間的樣本存活率將是高度可變的。而且，導致形成冰時高度過冷溶液的極度快速的結晶會導致對細胞和組織的損壞。 進一步，已顯示，如果細胞外結冰在過冷的高度時引發，那么有損壞性的細胞內結冰的可能性將顯著增加。這種現象是由于冰凍引起的細胞脫水延遲開始，這導致細胞內水分保留增加并因此導致在細胞內結冰的更大的可能性。如上所述，在從液態向固態的轉變期間，溶液從高自由能狀態移到低自由能狀態， 這導致繼續變熱的樣本與繼續冷卻的冷卻裝置之間的熱不平衡。這種不平衡最后導致與特定細胞類型的規定的冷卻速率的嚴重偏差，并導致在該過程中細胞損壞的可能性。為了防止這些可能的損壞情況發生，在冷凍保存過程中的步驟經常包括干預，以在溶液凝固點附近在細胞外溶液中引入冰晶。稱為“引晶”的這一過程通過將樣本冷卻至溶液凝固點附近來進行，然后用在低溫流體(例如液氮)中預冷的金屬裝置(例如鑷子或金屬棒)接觸樣本容器的外面。此引晶步驟在細胞外溶液中產生冰晶，并提供“樣板”，通過樣板，溶液中的過冷水分子有機化并產生更多冰。但是，在此方式中的引晶樣本是費時的， 并在其被暫時從用于此程序的冷卻裝置移出的情況下并因為此引晶方法可以不經意地引起細胞內結冰而使樣本處于風險中。需要避免上述與不平衡狀況相關的問題的冷凍保存系統。還需要無需目前被執行以引發控制的冰晶形成的輔助引晶步驟的這樣的系統。還需要便于上述問題的解決的冷凍保存裝置。所需要的冷凍保存裝置還可提供簡化其用于獲得和存儲要冷凍保存的細胞和組織的方法。
發明內容
在冷凍保存領域的這些和其他需要可以通過本發明的幾個方面來滿足。在本發明的一個方面中，設置有自動成核裝置，用于在冷凍保存儲存器中包含的液體冷凍前引入到冷凍保存儲存器內。所述裝置包括大小適合于引入到冷凍保存儲存器內的細長中空管和設置在中空管內的形成冰核的合成物。管的兩端被密封，而至少一端是用薄膜密封，該薄膜對于形成冰核的合成物是不能滲透的而對于包含在冷凍保存儲存器內的液體是可滲透的。優選地，兩端包括該薄膜以允許樣本液體流入裝置并通過裝置。在優選的實施例中，形成冰核的合成物是固醇，并且更優選地是膽固醇。膽固醇可以是中空管內部上的涂層，或者可以設置為管內的固體基質。在本發明的另一方面中，提供了冷凍保存儲存器，其可與自動成核裝置一起使用。 在一個實施例中，冷凍保存儲存器包括彈性管狀主體，其具有在開始開放用于將液體樣本引入到主體內的一端和在主體的相反端處限定的封閉端口。該端口適于由注射針刺穿以抽出液體樣本。在液體樣本被引入儲存器內后開口端被熱密封。自動成核裝置與入口偏置地固定到管狀主體的內部，以使其不會被刺穿封閉的端口的注射針接觸到。在另一實施例中，冷凍保存裝置包括用于接收和儲存液體樣本的容器，該容器具有開口到容器內的入口配件和安裝到配件的適配器。適配器具有第一管狀支路和第二管狀支路，第二管狀支路端接到管接合配件中。隔膜封閉第一管狀支路，其中隔膜適于被注射針刺穿。冷凍保存裝置還設置有在一端接合到第二管狀支路上的管接合配件的管，以及處于管的相反端處的封閉件。用于第二支路的封閉件首先是隔膜，該隔膜可以被注射針刺穿以將樣本液體引入儲存器中。容器可以在開始處于大氣壓以下的壓力以增進樣本液體從注射器輸送到儲存器內。一旦樣本液體已被輸送，則第二支路上的管被熱密封并就在管接合配件之上被切斷以形成第二支路的最終封閉件。封閉的裝置然后經歷冰凍和解冰方案。解凍后，可以使用注射器通過適配器的第一支路內的隔膜抽出樣本液體。可以預見，本發明將提供一種簡單的可再生的系統，用于在許多不同的細胞冷凍應用中引入冰以及減少過冷。本發明構思了方法和裝置，用于通過固體基質裝置的建立在冷凍保存細胞和組織期間控制的細胞外冰晶的誘導，在固體基質裝置上冰核將自然地形成。本發明勝過現有系統和方法具有多項優點。現在，引發可控冰核的大多數方法是麻煩的、難以再生，并且雖然當使用技術時指向許多細胞和組織的增大的冷凍-解凍存活率的很大的字體，仍要多次檢查。至今，大多數通常使用的方法范圍是從用冷凍的(通常冷凍至-196°C )的金屬物體或棉拭簡單地接觸管狀瓶或細管的側面到設計用于在樣本的小區域上噴射液氮的精制裝置。但是，即使在最佳條件下執行，以這種方式的機械地引入冰晶會導致不能形成足夠大的冰晶以允許在整個細胞外溶液中完全地繁殖，或由于最接近于金屬物體或液氮噴射在容器上指向的位置的樣本部分中觀察到的極大的冷凍速率，從而導致細胞損壞和損失。在一個結構中，液體樣本裝置包括用于接收和儲存液體樣本的容器，容器由一體的細長主體形成。主體從開口端限定中空內部并在相反端處通過開口到中空內部的入口管配件和通風管配件封閉。在一方面，一體主體還限定延伸到中空內部中并設置在入口管配件和通風管配件之間的壁。容器的開口端由注射針隔膜封閉。裝置還包括安裝到各管配件的適配器主體，適配器主體具有入口管狀支路和通風管狀支路，通風管形支路包括設置在其中的過濾器元件。在另一方面，設置有支撐蓋，其具有可拆卸地接合到容器的下部，以及當支撐蓋接合到容器時在容器的相反端處延伸超出入口管配件和通風管配件的上部。容器在其外表面可以限定至少兩個凹部，同時支撐蓋的下部包括至少兩個可彈性偏轉的細長凸部，各細長凸部具有構造成可移出地接收到凹部中的相應一個內的向內指向的突出部。在一方面，支撐蓋的上部包括包圍入口管配件和通風管配件的圓柱形壁，而且還包括位于入口管配件和通風管配件的相對側的側面的內壁。在另一個實施例中，支撐蓋的下部包括兩個相對的細長支腿，每個支腿包括在其自由端處向外指向的突出部。細長支腿可以比細長凸部更長。使用所述裝置獲得用于分析或用于冷凍保存的液體樣本的方法，被構思為包括以下開始步驟將適配器主體安裝到各管配件上，適配器主體具有對應于入口管配件和通風管配件的入口管形支路和通風管形支路，并將入口管形支路連接到液體源。方法以下面步驟繼續進行通過入口管配件將液體引入到容器內，同時通過通風管配件和通風管形支路將容器內的空氣排出，然后在支撐帽的上部內的一位置處切斷并密封入口管形支路和通風管形支路。在容器完全封閉時，支撐帽被安裝在容器上。該組合體被安裝在離心機內，該離心機被操作以用離心力將浮在表面上的東西與液體分離，浮在表面上的東西直接暴露于注射針隔膜。使用延伸通過隔膜的注射針，將浮在表面上的東西從容器內抽出。然后，剩余的液體可以被冷凍保存，其中支撐帽被安裝或不安裝到容器上。
圖1是根據本發明的一個實施例的自動成核裝置的視圖；圖2是結合圖1所示的自動成核裝置的已知的冷凍保存儲存器的視圖；圖3a是根據本發明的另一實施例的用于冷凍保存液體樣本的彈性封閉的系統管狀瓶的視圖，管狀瓶表示為用于輸送樣本的初始狀態；圖北是圖3a所示的管狀瓶的視圖，表示為管狀瓶端部被密封；圖4是根據本發明的另一個實施例的細胞冷凍保存裝置的透視圖；圖5是用于圖4所示的裝置中的適配器的透視圖；圖6是圖4所示的裝置的分解圖；圖7是根據另一實施例的細胞冷凍保存裝置的透視圖；圖8是圖7所示的裝置的頂部的側向剖視圖；圖9是圖7所示的裝置的底部的透視剖視圖；圖10是根據另一實施例的冷凍保存裝置的透視圖；圖11是圖10的冷凍保存裝置的透視圖，根據公開于其中的另一特征的支撐蓋安裝于該裝置上；圖12是圖11所示的裝置和支撐蓋的分解剖視圖；圖13是圖11-12所示的裝置和支撐蓋的頂部的放大透視圖；圖14是根據可選實施例的支撐蓋的透視圖；圖15a和15b是根據兩種用途的圖10的冷凍保存裝置的示意圖；圖16是根據其中一種用途的圖14的冷凍保存裝置和支撐蓋的示意圖。
具體實施例方式為了促進對本發明的原理的理解，現在參照附圖中所示的和隨后的所寫說明中所描述的實施例。可以理解的是并不由此意圖限制本發明的范圍。可以進一步理解的是本發明包括對所描述的實施例的任何改變和修正，并且還包括如對于本發明涉及的領域的技術人員通常會想到的本發明的原理的應用。在本發明的一個實施例中，提供了自動成核裝置10，如圖1所示，其涉及能形成冰核的合成物的使用。根據本發明，形成冰核的合成物20結合于開口中空管12的內表面14。 在優選實施例中，管由塑料制成。足夠量的成核合成物被引入管中以在管中形成固體基質， 同時允許液體流動通過管。在優選實施例中，成核合成物是晶體膽固醇。固醇合成物的使用，特別是膽固醇， 在其它領域是已知的，例如在如美國專利4擬8493中所示的冷卻水系統。在這些其它使用中，粉末狀的合成物放置在容器中，用于暴露于水以有助于冰的形成。如下所述，實驗后能確定的是晶體膽固醇對于準備用于冷凍保存的樣本細胞和液體(例如血液、干細胞溶液和精子)是無毒的。管的端部16由可滲透溶液的薄膜18密封。特別地，薄膜對于冷凍保存液體是可滲透的，而對于要保存的細胞或組織是不可滲透的。保持分離并防止細胞/組織和形成冰核的合成物之間的直接接觸是重要的。在各端部處的薄膜還包括任意膽固醇晶體，其可從管移走并防止晶體污染周圍的液體。薄膜允許冷凍保存液體自由流動進入管12內也是重要的。管和固體基質成核合成物內的空隙最初也可充滿有等滲壓緩沖溶液。該自動成核裝置10的大小設計成能被放置到冷凍保存儲存器內，例如如圖2所示的管狀瓶30或血袋40。裝置在儲存器內可以是不固定的或是被固定到內表面。由于裝置意圖作為用于冰形成的成核位置，因此其不必特別大。在特定實施例中，管12是0. 25英寸長、直徑是0. 0625英寸。冷凍保存儲存器可以充滿特定的樣品或樣本和如在本領域已知的適當的冷凍保存溶液，同時裝置10保持在容器中。然后容器30或40被執行冷凍保存方案。 由于在裝置內冷凍保存液體與形成冰核的合成物20接觸，所以冰從裝置10的管12內在稍微或沒有過冷的情況下自發地形成。接著冰遠離管繼續形成到周圍的溶液內，從而導致在很少或沒有過冷以及最小限度的細胞內冰形成的情況下冷凍細胞懸浮液。在一個特定的實施例中，第一實驗被設計用于確定物理地結合到冷凍保存儲存器的里面的膽固醇將誘發冰核。在該實施例中，起作用的固醇溶液通過將0. 025g的干膽固醇添加到:3ml甲醇中來制備。得到的懸浮液隨后被放置到70°C的干燥槽中并間歇地搖動，直到所有固態固醇已溶解。商業上可得到的管狀瓶被涂覆100μ 1固醇溶液并放置在75°C的干燥槽中以使甲醇蒸發，從而實現膽固醇的再結晶和粘附。管狀瓶然后用1毫升PBS沖洗 2-3次以去除任何散落的晶體。接著，6%甘油溶液(以復制典型的精子庫冷凍保存介質)和10%的DMSO溶液(以復制普通細胞系冷凍系統)在PBS中制備，并通過在固醇涂覆的瓶形管和未涂覆(控制) 瓶形管內以_5°C /min的速率進行冷卻來評估。為了達到統計率，20個包含DMSO瓶形管和 12個包括甘油的瓶形管被評估。用熱電偶以1秒的間隔監測各瓶形管內的溫度，以使凝固點溶液的分解和融化的潛熱的釋放。這個實驗的結果表明在DMSO和甘油中凝固點更高并且在融化發熱(ΔΤ)期間對于由固醇涂覆的瓶形管溫度變化減小。這些結果總結在下表中
凝固點ΔΤ涂覆固醇的；DMSO-4.56 土 1.72 0C0.37 土 1.29 0C未涂覆的；DMSO-10.61 ±3.52 0C5.63 ± 4.36 °C涂覆固醇的；甘油-2.97 ± 1.14 0C1.54 土 1.47 0C未涂覆的；甘油-9.33 ±4.01 0C7.24 ±3.61 0C在這個實驗中，還可以觀察到晶體的一些脫落或碎裂(以及在DMSO樣本中一定程度的分解)，從而導致溶液污染(或者部分地由于容器和溶液的不可避免的物理操作)。為了解決這一問題，提供了自動成核裝置10的一個實施例，其中0. 25英寸中空管在內部被涂覆有100 μ 1固醇溶液并被干燥48小時。管的一端用可滲透的棉塞密封，而管的另一端利用環氧樹脂附接到瓶形管蓋的里面并被干燥1414小時。支架被設計用于在隔離的環境中保持結合的膽固醇，同時還允許溶液(但不允許細胞)進入以形成接觸。在第二實驗中，人類精子利用這種自動成核裝置10來冷凍保存并被具體地分析以確定根據本發明冷凍保存的樣本與使用標準構造的管狀瓶冷凍的精子相比是否具有更高的解凍后存活力。在這個實驗中，獲得丟棄的人類精子樣本(來自四個捐贈人的20個樣本)，并被放置到潮濕的37°C孵育器(5%的二氧化碳，95%的空氣)中持續30-60直至被液化。一旦被液化，利用等壓PBS (保持37°C)將樣本調整到5ml并利用計算機輔助的精子分析裝置進行評估以測量并記錄總的初始總量和活動性。然后樣本在TEST蛋黃緩沖液中通過步進方式累加程序被平衡到6%甘油。平衡之后，各樣本被分成三個1. 5ml試樣量并被存入到(1)包含裝置10的管狀瓶中；( 將要人工引晶(積極地控制)的標準管狀瓶中；(3) 將不接受引晶(消極的控制)標準管狀瓶中。所有樣本被放置到控制速率的制冷器中并以-5 °C /min的速率從22 °C冷卻到_8°C。3分鐘后在_8°C下，已浸透在液氮中的棉簽被用于在人工引晶的管狀瓶中開始引晶。另外的7分鐘后在_8°C下，樣品以-10°C /min的速率被再冷卻下降_40°C。在_40°C 下，速率被提高到_20°C/min，在-80°C樣本被投入液氮(liQ中。冷凍后，通過放置在試驗臺上解凍樣本(對應于_300°C /min的解凍速率)。一旦僅剩的冰已融化，接著甘油以滴入的方式通過添加PBS在10分鐘的時段內被稀釋；然后樣本被沖洗并在沒有甘油的PBS中被懸浮。最后，在解凍后總量和活動性評估前，將樣本培育 (37°C，潮濕的環境，5%二氧化碳，95%空氣)至少一個小時。第二實驗的結果表明利用本發明的自動成核裝置冷凍的樣本與利用人工引晶 (56. 0士3. 8% )冷凍的那些樣本相比保持明顯(ρ < 0. 05)更高的活動性(66. 1 士4. 7%平均數的標準誤(mean士SEM))。如利用方差技術的分析所確定的，兩個引晶方案明顯高(ρ <0.05)于未引晶的消極控制的樣本1 士3.7%)。
在第三實驗中，確定的是在長時間周期內結合的膽固醇對于培養精子不會產生毒害細胞的作用。在這個實驗中，液化的精子樣本暴露于已涂覆有100 μ 1固醇溶液的培養板。在培育1、2、4和8小時時進行的活動性評估表示在8小時的培養期間與結合的膽固醇直接接觸對于人類精子沒有明顯的毒害作用。因此，在精子冷凍保存過程中，與使用人工引晶或沒有引晶相比，本發明的自動成核裝置10被證明能產生更好的解凍后活動性。這些實驗證明固醇引發的冰核是穩定、可靠的方法，其能減少過冷并因此在具有更好結果的情況下減少在過冷溶液冷凍事件典型的冰晶形成的“閃現”之后的相關的溫度的快速升高。本發明的裝置和方法允許樣本在整個冷凍期間內能未被打亂地保持在冷卻腔室內，因此不需要現有技術的人工引晶技術。能確信的是本發明的裝置和方法特別適合于標準的商業的精子庫存方法。在標準的商業的精子庫存環境中，要處理許多樣本，而時間/人力限定不能總是允許控制速率的制冷或在實驗室中能達到的精心的處理。可以確信的是本發明允許具有勝過現有技術的結果的可重復的樣本冷凍保存。此外，本發明還能實現成功的冷凍以及具有低活動性的樣本的恢復，具有低活動性的樣本通常被排除于捐贈者群體。類似地，本發明的裝置10和方法對于以這樣的方式儲存冷凍保存的造血干細胞和/或造血祖細胞(PCB HPC)的能力具有顯著的影響該方式允許庫存和足夠的時間用于要進行的足夠的傳染病篩選以及HLA分型。冷凍保存為保存來自將受益于基因療法或由于疾病或通過放療或化療由醫生治療引起的處于喪失正常的造血功能風險中的新生患者的PCB源HPC提供了機會。近來，更多的努力致力于提純祖細胞選擇方法。保存這些相對 “純”的祖細胞群(例如表示CD34表面糖蛋白的細胞)的能力可能使移植的細胞懸浮液的總體積最小化。但是，因為通常所獲得的PCB的體積比骨髓樣本小得多，因此能獲得每千克受體重量的HPC的有限數量。這使得對于PCB源HPC的有效和最佳冷凍保存方法與其它源的HPC(例如骨髓、周邊血)的情況相比重要得多。本發明的自動成核裝置與此時以前可利用的裝置相比提供更有效和更優選的用于冷凍保存和恢復這些易損樣本的方式。可以確信的是裝置10結合到正在進行的改善的臍帶血干細胞冷凍保存方法的研究和發展中將導致獨特的方案，以在更少的人力更高的恢復率的情況下保存這種細胞類型。已經開發實驗方案用于驗證在PCB和臍帶血以及用于商業人工授精設備中的牛精子冷凍保存中本發明的裝置和方法的存活力。這些方案在上面參考的臨時申請60/814982中，該描述通過參考合并到此處。本發明的另一方面提出冷凍保存各種臍帶血源干/祖細胞要求完全不同的程序， 并因此要求不同于在現有已知的程序下存在的儲存容器。為了庫存和儲存源自臍帶血的多種細胞類型，優選地使用包括不同的冷凍/升溫速率的非常不同的冷凍方案。現有技術使用冷凍儲存袋(一些袋具有多個腔室)或管狀瓶。但是這兩個系統具有實質缺陷。多腔室袋不允許不同的冷凍速率或要用在不同腔室中的CPA。管狀瓶本身在冷凍保存溫度下不能被認為是“封閉”系統，除非使用熱密封的外包裝，外包裝的應用會損害敏感樣本。為了克服這一局限，本發明的另一實施例在于形式為彈性密封系統管狀瓶50的冷凍保存儲存器，如圖3a和: 所示，其使樣本在分離單元之間被分離從而在封閉的系統中使用不同的方案被冷凍。管狀瓶50包括在一端具有端口 M的彈性管狀主體52。端口優選地由與彈性主體相同但適合在解凍之后被注射針刺穿以無菌地抽出樣本的材料密封。
如圖3a所示，管狀瓶的相反端56開始時是開放的以允許引入液體樣本。一旦管狀瓶50已被充滿，端56例如通過熱密封條58被封閉，如圖北所示，這樣就獲得了封閉系統管狀瓶50用于單個單元的冷凍和儲存。任選地，但優選地，各管狀瓶包括上述自動成核裝置10。如圖3a所示，裝置10優選固定到主體52的內壁，以使其不會被穿過端口 52的注射針進入。可以預測的是本實施例的管狀瓶50可以用于在分離的冷凍容器中的多個冷凍/ 解凍方案。因此，成排的管狀瓶50可以支撐在固定裝置內，可使用開口端56用于引入多個液體樣本試樣量。當各管狀瓶被充滿時，相應端被密封以提供用于冷凍保存的封閉系統管狀瓶。在本發明的另一實施例中，提供了如圖4-6所示的冷凍保存裝置60，其進一步簡化了獲得樣本并將其備用于冷凍的過程。裝置包括大小用于接收液體樣本的容器62。容器 62在一端包括入口配件64。如圖6所示，自動成核裝置10可以通過入口配件64被引入到容器中。入口配件容納適配器65，如在圖5中詳細示出的。適配器包括下管狀部66，其大小適于緊密地裝配在入口配件64內。下部66可以使用環氧樹脂或熱密封或其他適合方式被密封到入口配件以在容器62和適配器65之間提供氣密和液密密封。適配器包括兩個管形支路67和69。支路67端接在端部68中，端部68構造成接合注射針隔膜72(圖6)。第二支路69端接在有缺口的配件70中。該有缺口的配件70與管道74的端部7 密封地接合。管道74的自由端74b接收其本身的注射針隔膜75。兩個注射針隔膜72和75被構造成在兩個支路67和69的端部處提供氣密和液密密封。而且， 隔膜72、75被構造成能由注射針以已知的方式刺穿并且一旦移走注射針就會自密封。在一個具體實施例中，提供有管道夾80以當管道74接合到適配器65時穩定管道 74。夾80包括構造成在適配器的支路67上滑動的部分80以附接的部分84，附接的部分被構造用于在管道74上滑動，如圖4所示。冷凍保存裝置60的容器62尺寸設置為能被容納在標準的“蛋品包裝紙盒”式分隔器中，該分隔器用于輸送和儲存用于冷凍和最終解凍的細胞樣本。可以預見的是裝載來自共用源的細胞樣本的若干個這種冷凍保存裝置60可以被裝在共用的蛋品包裝紙盒式分隔器中。使用時，裝置60開始被儲存在圖4所示的構造中，即管道74從細胞容器本身向上突出。適配器65的尺寸設置使得其不延伸超出容器的豎直外殼并因此不會與儲存的其它類似裝置60干涉。管道74示出為具有延伸到豎直外殼外面的彎部。如果在蛋品包裝紙盒式容器內的裝置被適當地排列，那么管道74不會與其它細胞容器干涉。但是，根據優選實施例，可以預見管道74可以是彈性的以使其能根據需要被設置以避免與同一蛋品包裝紙盒式分隔器中的其它容器62干涉。管道74還因為另外的原因優選是彈性的。具體地，支路69和固定的管道74用于填充裝置60的容器62。因此，根據本發明，彈性管道74可以被操作以允許新提取的細胞樣本引入到容器內。該引入一方面通過包括提取的液體樣本的注射器針刺穿隔膜75進行。 可選地，可以從彈性管道的端部74b去除隔膜75，以使得樣本能被直接注入管道內而無需刺穿薄膜。在這兩種情況下，由于管道可以根據需要進行操作而容器保持在蛋品包裝紙盒式容器中，所以彈性管道74有利于填充容器62的步驟。
—旦樣本已被引入容器62中，可以預見的是適配器的支路69就被永久地密封。 在優先實施例中，該密封通過恰好在有缺口的配件70上方密封彈性管道來進行。一旦被密封，由于不再需要，管道的剩余部分就可被去除。在一個特定實施例中，已知的箍縮熔接棒可以用于同時使管道變平、熱密封變平的部分并切斷多余的部分。該密封和切割優選地盡可能地靠近有缺口的配件70進行以使彈性管道74沒有剩余部分超出容器62的豎直外殼。理想的是密封和切割步驟不會危害冷凍保存裝置60的無菌完整性或封閉密封方面。當通過隔膜75注射樣本時，支路69在整個過程中保持密封，即使在移除注射針之后。 一旦支路69被密封，包含液體樣本的裝置60就準備用于冷凍和儲存在同一蛋品包裝紙盒式容器中，該蛋品包裝紙盒式容器在填充步驟期間容納該裝置。當希望取回樣本時，裝置60 可以從蛋品包裝紙盒式容器取出用于與保持在蛋品包裝紙盒式容器中的其它裝置分開而單獨地解凍。支路67的注射針隔膜72提供了用于無菌抽取樣本的途徑。因此可以使用針頭和注射器刺穿隔膜并將液體樣本抽取到注射器內。然后可以丟棄空的裝置60。在可選的實施例中，提供有如圖7-9所示的冷凍保存裝置100。裝置包括容器102， 其在用于冷凍保存細胞懸浮液的能力方面與上述的容器62類似，具有或不具有設置于其中的自動成核裝置10。在某些實施例中，容器102具有2-5毫升的儲存容量。容器102具有開口的頂部103和限定開口 105的底部104。頂部103是通過蓋110氣密地密封，如圖8 的剖面視圖所示。頂部限定環形凸緣107，蓋110的下裙緣116安裝在環形凸緣107上。該下裙緣優選地以傳統的方式熱密封到環形凸緣上，以形成能抵抗冷凍保存溫度的液體密封接頭。蓋110支撐入口支路112和通氣支路114，這兩個支路中的每一個都可以是無菌管道的形式。入口支路112可以設置有標準的注射針隔膜，例如上述隔膜75。兩個支路112、 114安裝在相應的配件118、120上，每個配件限定與容器112連通的通道119、121。每個支路氣密地密封在相應的配件上以再形成液體密封的能冷凍保存的接頭。在圖7-9的實施例中，支路114作為通風支路，而不是作為如前面的裝置60中的出口支路。過濾器元件125可以設置在配件120的通道121內。在優選的實施例中，該過濾器零件是3 μ m的無菌微過濾器。微過濾器125是氣體可滲透的，但對于儲存在容器內的液體樣本或細胞懸浮液基本上是不可滲透的。在該實施例中，裝置100設置成通過容器102的底部104去除儲存的懸浮液，而不是如前面的實施例通過蓋去除。因此，如圖9的剖面圖所示，容器內的開口 105由注射針隔膜130密封。出口隔膜130被適當地氣密地密封到容器102，例如通過熱密封。為了保護隔膜，提供了可拆卸的罩132，其圍繞隔膜固定于容器。罩132可以限定更薄或變弱的區域形式的撕裂部133，其能使罩的中心部135被去除。可以提供如圖7所示的垂片135，以便于中心部135的去除。罩可以是箔膜，其在其周圍固定于容器102的底部104。冷凍保存裝置100的使用方式與上述裝置60相似。具體地，細胞懸浮液通過入口支路112被引入容器102內，并且特別地是通過上述注射針隔膜引入。可選地，入口支路可以設置有標準的注射針端口或無針端口。當細胞懸浮液被注入容器內時，其中的空氣通過通風支路114中的過濾器125被排出。在某些實施例中，微過濾器125構造成對于細胞懸浮液基本上不能滲透。因此，一旦容器內的懸浮液的水平到達過濾器125，那么懸浮液不會通過過濾器，從而壓力的升高將終止液體流入容器內。
一旦容器102被充滿，兩個支路將使用例如上述箍縮熔接器進行熱密封，以使容器被完全的、氣密地密封。當然，可以理解的是，當容器102被充滿時注射針隔膜130和罩 132仍保持完整。充滿并密封的裝置100然后可以被冷凍儲存。當希望抽取細胞懸浮液時，裝置和內容物首先被以已知的方式解凍。一旦解凍，罩 132被去除以露出隔膜130。通風支路113被切斷以打開通風通道121。然后可以通過注射器或類似裝置刺穿隔膜130抽取細胞懸浮液。容器的底部104可以形成一系列凸部106，其適合接合抽取裝置或注射器。在一些實施例中，凸部106構造用于對接抽取裝置，而在其它實施例中，凸部可以設置有管螺紋(LUER threads)，用于接合抽取注射器上的管接頭(LUER fitting)ο根據另一實施例，冷凍保存儲存器200包括可以被標上刻度的容器或管狀瓶201， 如圖10所示。儲存器200具有開口的下端302和封閉的上端205。由圖12可見，容器201 是從開口的下端203形成中空內部202的基本上一體的主體。在封閉的上端205處，一體的主體被構造以形成開到中空內部202內的一對管適配器207、208。兩個管適配器開到內部內的開口由壁210分隔開。如前面的實施例一樣，適配器207可以連接到排風口，而適配器208可以被連接到要被冷凍保存在儲存器200內的液體源。壁210防止通過適配器208 進入的液體立即從適配器207被抽出，特別是當如此處所述的向適配器207施加負壓時。容器201的開口端203由注射針隔膜215封閉，注射針隔膜215可被構造成類似于上述注射針隔膜130并起到與其類似的作用。注射針隔膜215由罩217保持，罩217通過常規方式被密封到容器的開口端203，以提供防露密封。儲存器200進一步包括通風管221和入口管223的適配器主體220。管的端部以適合的方式安裝到相應的配件207、208上以提供永久的防露密封的接合。通風管221可以優選地包括容納在管內的過濾器元件225，其類似于上述過濾器125。入口管223可以包括展開端226，用于與管適配器接合，如此處所述的。如這樣進一步描述的，儲存器200類似于儲存器100。但是，容器201被修改以容納支撐蓋對0，如圖11-13所示。支撐蓋240包括下部242和上部M4，上部和下部都大致為圓柱形構造并且大小適合滑配合到容器201上。下部242包括具有向內指向的突出部 247的至少兩個凸部M6。突出部247大小制成并設置成鎖定在形成于容器201上相應的凹部250內(圖10)。突出部M7向內指向以使得當蓋240在容器上滑動時必須通過偏轉凸部246來向外移動突出部。突出部包括傾斜的上表面247a，當希望去除蓋時，傾斜的上表面使突出部能被平滑地從凹部250拉出。突出部247被設置在凸部246的中部，以使得凸部的下部在突出部的下面延伸用于手動接合以從凹部中釋放突出部。下部
提供了杠桿作用以有利于釋放突出部，同時還防止突出部由于意外接觸導致的移出。蓋MO的上部244被構造以保護從容器頂部延伸的管221和223。因此，上部244 包括環形壁252，其具有設置成位于管側面的側面的內壁254，如圖13所示。因此，在管與儲存器200的適配器207和208結合時，壁防止管彎曲，這避免了破壞不透水的密封以及污染內容物。修改的蓋260如圖14所示。該蓋具體地構造成在離心機或其它器具中支撐冷凍保存儲存器200。在一些示例中，希望用離心機分離儲存器200的內容物，例如從浮在表面上的東西分離細胞粒。容器201可能不易安裝到離心機內，所以修改的蓋沈0為容器提供了額外的支撐。具體地，蓋260包括下部262和上部沈4。上部264可以類似于蓋240的上部244被構造包括內壁沈5以保護管道。此外，類似于蓋M0，蓋沈0的下部262包括至少兩個凸部沈6，凸部266具有構造成接合容器201內的凹部250的突出部沈8。但是，下部262包括支腿270，支腿270延伸超出凸部沈6的端部。而且這些支腿270端接于向外突出的突出部272。因此支腿270從凹部250沿容器201的長度的主要部分延伸。向外的突出部272被構造以接合器具(例如上述離心機)的凹部或安裝部件。更長的支腿270不僅為容器提供了支撐，支腿并且具體地是突出部272還提供一種機構，用于可釋放地接合器具，從而在器具內充分地支撐冷凍保存儲存器200。在圖1 和15b中描述了儲存器200的使用。在兩種使用中，容器被連接到液體源，例如血袋觀0。血袋包括管觀2，管282連接到適配器主體220的入口支路223。在一個實施例中，適配器284可以被接合在入口支路的展開端2 和血袋管282之間。在圖1 所示的一種方案中，血通過重力自輸入到容器201中，空氣通過通風支路221溢出。在另一種方案中，如圖1 所示，整個系統是封閉的，注射器290連接到通風支路221。注射器被拉開以向容器201施加負壓，從而將血從袋280抽到容器內。一旦要冷凍保存的血液或其它液體已被抽到容器內，管道就被切斷并密封，如圖 16所示。密封的管的端部295被切斷以當蓋被接合到容器201上時存在于蓋沈0的上部 264的端部下面。因此，如圖16所示，管的端部被完全地包圍并保護。可利用蓋260的突出部272將儲存器200安裝在離心機或其它儲存裝置中。能進一步理解的是，蓋260作為支架以支撐具有向上朝向的注射針隔膜215的儲存器。當容器的內容物用離心機分離時，浮在表面上的東西將自然地向上移動，在該位置其能通過穿過隔膜的注射針被容易地接近并抽出。一旦浮在表面上的東西被去除，就可以從容器201去除蓋沈0，然后內容物就可以被冷凍保存。可以進一步理解的是，圖15a_15b所述的過程可以在沒有隨后的冷凍保存的情況下使用。例如，根據美國血庫學會(AABB)標準的血液庫存的當前血液檢測要求規定了已被檢測的血液單元的破壞，由于當前沒有辦法有效地將血液試樣量移入檢測容器內而沒有污染整個單元的可能性。該要求導致由所有血庫處理的大約百分之一的血液單元的破壞，這在成本和血液缺乏方面是效果顯著的。檢測容器必須允許用于細胞粒化的離心作用，同時保持封閉的系統以避免污染。儲存器200符合AABB標準，以使血庫或醫師能直接從血液單元抽取血液樣本而不會危及血液單元的剩余部分。一旦血液樣本被從血袋280抽入容器201中，血袋管282可以被密封并從適配器284脫離，由此保護血袋觀0中的血液單元。然后容器201內的血液樣本可以被安裝在蓋260內，以被輸送到實驗室并用離心機分離。注射針隔膜215允許無菌地抽取浮在表面上的東西用于進一步分析，例如確定細胞數，或者檢測血液樣本中血紅蛋白或微生物的存在。可以預見，在一些實施例中，冷凍保存儲存器60、100和200的容器62、102和201
可以設置有初始真空。該真空有助于在填充儲存器容器步驟中液體樣本的抽取。由于通向各支路67/69、112/114和221/223被密封(通過相應的隔膜72、75或通過熱密封)，因此真空可以被保持很長一段時間。蓋可以被設置在各支路上以確定氣密密封。在一個特定實施例中，容器62、100和201內初始真空可以是處于IOOmmHg(絕對)和160mmHg(絕對)之間的大氣壓之下的壓力。冷凍保存儲存器60、100和200可以由在標準冷凍條件(即低到_196°C的溫度) 下在血液庫存和長期保存領域中使用的標準材料制成。當前的O.S.H.A.推薦是使適合的塑料部件能達到符合特定血液承載的病原體標準或其它要求。因此，上述各實施例中的容器、配件和管道都可以由適合的塑料制成，例如聚苯乙烯或聚丙烯。為了安裝到標準的蛋品包裝紙盒式容器中，儲存器(在密封彈性管道之后)應符合IOmm直徑和90mm高之內。彈性管道74也必須能抵抗冷凍保存溫度，而不會損害當密封適配器65的支路69時加熱密封并切斷管道的能力。在一個特定實施例中，彈性管道由TYGON 或類似材料制成。雖然已在附圖和前面的描述中詳細地圖示和描述了本發明，但要考慮的是其在特征上是示意性的而不是限制的。可以理解的是僅提出了優選的實施例，希望能保護落入本發明的主旨的所有改變、修改和進一步的應用。
權利要求
1.用于接收從單獨容器獲得的液體樣本的裝置，包括用于接收液體樣本的容器，所述容器由一體的細長主體形成，所述主體從開口端限定中空內部，并在相反端處由開口到所述中空內部的入口管配件和通風管配件封閉，所述一體的主體還限定延伸到所述中空內部中并設置在所述入口管配件和所述通風管配件之間的壁；和封閉所述開口端的注射針隔膜。
2.權利要求1的裝置，還包括安裝到所述管配件的適配器主體，所述適配器主體具有入口管形支路和通風管形支路，所述通風管形支路包括設置于其中的過濾器元件。
3.權利要求2的裝置，其中所述入口管形支路包括適于接收適配器的展開端，以將所述支路連接到與液體容器相關聯的單獨管。
4.權利要求1的裝置，其中所述容器由適于儲存血液樣本的塑料制成。
5.權利要求1的裝置，其中所述容器由適于在冷凍保存溫度下儲存液體樣本的塑料制成。
6.用于儲存從單獨容器獲得的液體樣本的裝置，包括用于接收液體樣本的容器，所述主體具有從開口端開始的中空內部，并在相反端處由開口到所述中空內部的入口管配件和通風管配件封閉；封閉所述開口端的注射針隔膜；和支撐蓋，其具有可拆卸地接合到所述容器的下部，和當支撐蓋接合到容器時在所述容器的相反端處延伸超出所述入口管配件和所述通風管配件的上部。
7.權利要求6的裝置，其中所述容器在其外表面處限定至少兩個凹部；以及所述支撐蓋的所述下部包括至少兩個彈性可偏轉的細長凸部，每個細長凸部都具有向內指向的突出部，向內指向的突出部構造成可移出地接收在所述凹部中相應的一個內。
8.權利要求7的裝置，其中所述突出部位于沿所述凸部的長度方向的中部處。
9.權利要求6的裝置，其中所述上部包括圍繞所述入口管配件和所述通風管配件的圓柱形壁，還包括位于所述入口管配件和所述通風管配件的相反側的側面的內壁。
10.權利要求6的裝置，其中所述支撐蓋的所述下部包括兩個相對的細長支腿，所述支腿的每一個都包括位于其自由端處的向外指向的突出部。
11.權利要求10的裝置，其中，所述細長支腿比所述細長凸部更長。
12.權利要求6的裝置，其中，所述容器由適于儲存血液樣本的塑料制成。
13.權利要求6的裝置，其中所述容器由適于在冷凍保存溫度下儲存液體樣本的塑料制成。
14.使用權利要求6的裝置的方法，包括將所述入口管配件連接到液體源；通過所述入口管配件將液體弓I入所述容器內，同時通過所述通風管配件排出所述容器內的空氣；密封所述入口管配件和所述通風管配件；將所述支撐蓋安裝到所述容器上；將承載所述容器的所述支撐蓋放置到離心機內；用離心機從液體分離浮在表面上的東西，浮在表面上的東西直接暴露于所述注射針隔膜；以及使用注射針延伸通過所述隔膜，從容器內抽取浮在表面上的東西。
15.權利要求14的方法，其中液體通過重力自輸入被引入容器內。
16.權利要求14的方法，還包括 將注射器連接到所述通風管配件；以及使用注射器以在所述容器內產生負壓，從而將液體從液體源抽入容器內。
17.權利要求14的方法，還包括將適配器主體安裝到所述管配件上的開始步驟，所述適配器主體具有對應于所述入口管配件和所述通風管配件的入口管形支路和通風管形支路； 連接步驟，包括將入口管形支路連接到液體源；以及密封步驟，包括在處于支撐蓋的上部內的位置處切斷和密封入口管形支路和通風管形支路。
18.權利要求14的方法，其中所述液體是血液，所述液體源是血液單元袋。
全文摘要
公開了冷凍保存細胞的系統和方法。液體樣本儲存器包括形成在容器的一端處的入口管配件和通風管配件，相對開口端由注射針隔膜封閉。支撐蓋可拆卸地接合到容器以支撐容器并保護連接到配件的入口管形支路和通風管形支路的終端。支撐蓋包括一對相對的支腿，其具有向外指向的突出部用于安裝在離心機內，同時支撐冷凍保存容器。
文檔編號A01N1/00GK102160546SQ20101052094
公開日2011年8月24日 申請日期2010年10月22日 優先權日2010年2月24日
發明者E·J·伍茲 申請人:瓦埃爾科有限責任公司