專利名稱：一種獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一種單倍體育種技術。
背景技術：
通過單倍體培養，豐富的分離、變異和重組在當代就能顯示，并可以通過染色體加 倍以純合的形式永久穩定下來。與常規育種技術相比較，單倍體育種技術具有以下優勢首 先，可顯著加快純合速度，應用單倍體育種可縮短作物育種周期5-6個世代；其次，加倍單 倍體的隱性基因不受顯性基因遮蓋而能正常表達，可顯著提高基因型的選擇效率和選擇的 準確性，有利于多基因重組和隱性基因的選擇。此外，單倍體培養在遺傳分析、基因工程、分 子生物學及物種進化等領域，都有重要的應用和研究價值。甜辣椒(即Capsicum annuum L.，包括甜椒和辣椒等不同基因型)單倍體的發生 主要通過雄核發育途徑，即可通過花藥培養和游離小孢子培養得到其單倍體。20世紀70 年代，我國在國際上最早開展了甜辣椒花藥培養研究。其后，國內外的多位科研工作者在甜 辣椒花藥培養和游離小孢子培養上投入了大量精力。目前，甜辣椒花藥培養獲得了一定發 展，但真實培養效率不能令人滿意，尚存在基因型反應率低、有效胚狀體發生率低、培養周 期長、內生菌污染嚴重等問題。因此，要獲得一定群體規模的加倍單倍體須耗費大量資源和 工作量，培養時間也大大拉長，不能滿足育種實踐需要。游離小孢子培養不受母體組織影響，且成熟游離培養體系的一次培養產胚量大， 同時游離小孢子還具備分散性單細胞特點，是理想的遺傳轉化受體材料。但甜辣椒游離小 孢子培養難度大，國內外曾有過辣椒基因型材料的成功報道，但關于甜椒基因型材料尚無 成功報道，經本實驗室數次重復，發現報道方法受基因型限制大，甜椒材料基本上無法獲得 理想的胚狀體發生率及再生株獲得率。此外，在普通的甜辣椒單倍體培育實驗中，單倍體植株的加倍也一直是一個難點。 經過自然加倍或人工加倍得到的雙單倍體(Doubled Haploid,DH)植株對于育種、分子生物 學、遺傳學研究等具有重要意義。而甜辣椒小孢子培養或花藥培養得到的再生株中，自然加 倍的DH株所占比例僅為30%左右。其余為單倍體、混倍體、非整倍體等，其中單倍體所占比 例最大，約為55%左右(培養基、培養條件和基因型的不同可導致差異)。現有技術中常用 的田間秋水仙堿加倍法的加倍效果也并不理想。因此，大量的單倍體植株被浪費，限制了甜 辣椒單倍體培育技術的廣泛應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種能夠解決上述問題，可以較為高效地獲得甜辣椒雙單倍 體植株的方法。為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案一種獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其步驟如下(1)選擇長勢良好、無病蟲害的植株作為供體植株，通過鏡檢選取小孢子發育處于單核靠邊期至雙核早期的花蕾，4°C低溫預處理花蕾1-3天；(2)選取合適大小的花蕾——不同基因型的處在上述發育時期的花蕾大小可有不 同，大致上，合適的花蕾處在花瓣與花萼呈平齊狀態至花瓣稍長于花萼的狀態之間，更一般 地，可選擇花瓣不短于花萼的花蕾；將花蕾剝去花萼后，先用75% (ν/ν)的酒精浸泡30s，再用8-10% (ν/ν)的次氯酸 鈉振蕩消毒10-20min，然后用無菌水清洗3次，每次3-5min ；(3)在工作臺上將花藥完好無損地剝離，以每60mm直徑培養皿接種12_18枚花藥 的密度接種于N4-3固液雙層培養基上，所述N4-3固液雙層培養基的配方為固體層NTH培養基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和 瓊脂粉的含量分別是它們相對于所述NTH培養基的重量百分比；液體層NTH培養基+3-6%蔗糖+IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對于NTH培養基的重量百分比；所述固體層經121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌；(4)花藥先在觀_351條件下黑暗培養1-10天，再轉移到25_28°C條件下繼續黑暗培養；(5)培養4-7周時間，即可看到大量胚狀體發生，將子葉型胚狀體轉移到不加激素 的MS基本培養基上，培育壯苗。如上所述的獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其中，所述NTH培養基的配方為硝酸銨825mg/L，硝酸鉀950mg/L，二水氯化鈣166mg/L，七水硫酸鎂185mg/ L,磷酸二氫鉀680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸錳25mg/L，七水硫酸鋅10mg/L，二水 鉬酸鈉:0. 25mg/L,無水硫酸銅0. 025mg/L,六水氯化鈷0. 03mg/L,肌醇:100mg/L，煙酸 5mg/L，鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,鹽酸硫胺素0. 5mg/L,甘氨酸:2mg/L,葉酸:5mg/L，生物素 0. 5mg/L。一種用于培育甜辣椒雙單倍體植株的培養基，為固液雙層培養基，其配方為固體層NTH培養基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和 瓊脂粉的含量分別是它們相對于所述NTH培養基的重量百分比；液體層NTH培養基+3-6%蔗糖+IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對于NTH培養基的重量百分比；所述固體層經121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌。如上所述的用于培育甜辣椒雙單倍體植株的培養基，其中，所述NTH培養基的配 方為硝酸銨825mg/L，硝酸鉀950mg/L，二水氯化鈣166mg/L，七水硫酸鎂185mg/ L,磷酸二氫鉀680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸錳25mg/L，七水硫酸鋅10mg/L，二水 鉬酸鈉:0. 25mg/L,無水硫酸銅0. 025mg/L,六水氯化鈷0. 03mg/L,肌醇:100mg/L，煙酸 5mg/L，鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,鹽酸硫胺素0. 5mg/L,甘氨酸:2mg/L,葉酸:5mg/L，生物素 0. 5mg/L。本發明的有益效果為應用本發明的培育方法，甜辣椒胚狀體的發生突破了基因型的限制，特別是甜椒 基因型的培養效率得到了大幅度提高。同時，甜椒和辣椒的再生株中DH株比率均得到了明顯提高。本發明培育方法及培養基中的組分戊炔草胺是一種生產上常用的選擇性除草劑， 其作為一種抗微管物質，可有效抑制紡錘絲的形成，使植物染色體復制而不分開，從而使染 色體加倍。與秋水仙堿相比，戊炔草胺的染色體加倍效果相當，應用濃度低，并具有無毒的 特性。
圖1為采用本發明培育方法的胚狀體發生情況示意照片。圖2為采用本發明培育方法的胚狀體成苗情況示意照片。
具體實施例方式實施例1本發明的甜辣椒雙單倍體培育方法的具體步驟如下(1)選擇長勢良好、無病蟲害植株作為供體植株，嚴格按鏡檢結果選取小孢子發育 處于單核靠邊期至雙核早期的花蕾，4°C低溫預處理花蕾1-3天；(2)取合適大小的花蕾，剝去花萼后，用75% (ν/ν)的酒精浸泡30s，再用8_10% (ν/ν)的次氯酸鈉振蕩消毒10-20min，最后用無菌水清洗3次，每次3-5min ；(3)在工作臺上將花藥完好無損的剝離，以每60mm直徑培養皿12_18枚花藥的密 度接種于N4-3固液雙層培養基上，N4-3培養基的配方為固體層NTH培養基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和 瓊脂粉的含量分別是它們相對于所述NTH培養基的重量百分比；液體層NTH培養基+3-6%蔗糖+IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對于NTH培養基的重量百分比；所述固體層經121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌；(4)花藥先在觀_351條件下黑暗培養1-10天，再轉移到25_28°C條件下繼續黑暗培養；(5)培養4-7周時間，即可看到大量胚狀體發生，將子葉型胚狀體轉移到不加激素 的MS基本培養基上，培育壯苗；待再生株長至3-4片真葉，切取葉片，通過流式細胞儀或保 衛細胞葉綠體計數法鑒定植株倍性。二倍體植株的準確鑒定以田間植株的坐果與結籽情況為準，小孢子途徑得到的DH 株以后代不發生性狀分離為判斷標準。其中，所述NTH培養基的配方如下所示
權利要求
1.一種獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其特征在于，步驟如下(1)選取小孢子發育處于單核靠邊期至雙核早期的甜辣椒供體植株的花蕾，4°c低溫預 處理花蕾1-3天；(2)取花瓣不短于花萼的花蕾，剝去花萼后，先用75%(ν/ν)的酒精浸泡30s，再用 8-10% (ν/ν)的次氯酸鈉振蕩消毒10-20min，然后用無菌水清洗3次，每次3-5min;(3)將花藥完整地剝離，以每60mm直徑培養皿接種12-18枚花藥的密度接種于N4-3固 液雙層培養基上，其中，所述N4-3固液雙層培養基的配方為固體層NTH培養基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和瓊脂 粉的含量分別是它們相對于所述NTH培養基的重量百分比；液體層=NTH 培養基 +3-6 % 蔗糖 +IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+ 戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對于NTH培養基的重量百分比； 所述固體層經121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌；(4)花藥先在條件下黑暗培養1-10天，再轉移到2548°C條件下繼續黑暗培養；(5)培養4-7周時間，待胚狀體發生時，將子葉型胚狀體轉移到不加激素的MS基本培養基上，培育壯苗。
2.如權利要求1所述的獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其特征在于，所述NTH培養基 的配方為硝酸銨825mg/L，硝酸鉀950mg/L，二水氯化鈣166mg/L，七水硫酸鎂185mg/L，磷酸 二氫鉀680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸錳25mg/L，七水硫酸鋅10mg/L，二水鉬酸鈉 0. 25mg/L，無水硫酸銅0. 025mg/L，六水氯化鈷0. 03mg/L，肌醇100mg/L，煙酸5mg/L，鹽 酸吡哆醇0. 5mg/L，鹽酸硫胺素0. 5mg/L，甘氨酸Jmg/L，葉酸5mg/L，生物素0. 5mg/L。
3.一種用于培育甜辣椒雙單倍體植株的培養基，其特征在于，為固液雙層培養基，其配 方為固體層NTH培養基+3-6%蔗糖+0. 5%活性炭+0. 8%瓊脂粉，其中蔗糖、活性炭和瓊脂 粉的含量分別是它們相對于所述NTH培養基的重量百分比；液體層=NTH 培養基 +3-6 % 蔗糖 +IAA 0. 5-1. 5mg/L+6_BA 0. 1-0. 6mg/L+ 戊炔草胺 0. 1-0. 5mg/L，其中蔗糖含量是它相對于NTH培養基的重量百分比； 所述固體層經121°C高壓滅菌；所述液體層抽濾滅菌。
4.如權利要求3所述的用于培育甜辣椒雙單倍體植株的培養基，其特征在于，所述NTH 培養基的配方為硝酸銨825mg/L，硝酸鉀950mg/L，二水氯化鈣166mg/L，七水硫酸鎂185mg/L，磷酸 二氫鉀680mg/L，硼酸6. 20mg/L,四水硫酸錳25mg/L，七水硫酸鋅10mg/L，二水鉬酸鈉 0. 25mg/L，無水硫酸銅0. 025mg/L，六水氯化鈷0. 03mg/L，肌醇100mg/L，煙酸5mg/L，鹽 酸吡哆醇0. 5mg/L，鹽酸硫胺素0. 5mg/L，甘氨酸Jmg/L，葉酸5mg/L，生物素0. 5mg/L。
全文摘要
本發明提供一種獲得甜辣椒雙單倍體植株的方法，其步驟如下(1)選取小孢子發育處于單核靠邊期至雙核早期的供體植株的花蕾，4℃預處理1-3天；(2)剝去花萼后，先用酒精浸泡，再用次氯酸鈉振蕩消毒，然后用無菌水清洗；(3)將花藥剝離，以每60mm直徑培養皿12-18枚花藥的密度接種于N4-3固液雙層培養基上；(4)花藥先在28-35℃條件下黑暗培養1-10天，再轉移到25-28℃條件下繼續黑暗培養；(5)培養4-7周時間，待大量胚狀體發生時，將子葉型胚狀體轉移到不加激素的MS基本培養基上，培育壯苗。經過本發明培育方法，胚狀體發生率突破了基因型的限制，甜辣椒的培養效率得到了大幅度提高，同時DH株比率也得到了提高。
文檔編號A01H4/00GK102047843SQ201010508370
公開日2011年5月11日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年10月15日
發明者張宇, 張曉芬, 耿三省, 陳斌 申請人:北京市農林科學院