小蓬竹組織培養過程中外植體的消毒方法

專利名稱：小蓬竹組織培養過程中外植體的消毒方法
技術領域：
本發明屬于竹類組織培養技術，具體地說是涉及一種小蓬竹組織培養過程中外植 體的消毒方法。
背景技術：
^bMYi (Drepanostachyum Luodianense (Yi et R. S. Wang) Keng f. ) Μ^^^Υ 亞科鐮序竹屬竹種，又名“藤竹”，是中國特有種，在《中國物種紅色名錄》中被列為極危種。 目前只在貴州的羅甸、平塘及長順有栽培或有野生分布，常成片生長于海拔600 IOOOm的 石灰巖裸露石山上。它的竹材柔韌可編涼椅和農具，也可作為造紙原料；形態優美，是良好 的園林綠化竹種，并在環境惡劣的喀斯特地區生長良好，能耐干旱和瘠薄，對增強土壤的固 土、保水、保肥能力效果十分顯著，是喀斯特地區的適生性物種，在喀斯特生態系統中對水 源涵養、水土保持、養分平衡等生態功能發揮著重要作用，具有很高的生態效益。竹類的生殖周期長，很少開花結實，難以獲得大規模繁殖的種子。而傳統的移竹、 埋鞭、竹枝扦插等繁殖方法存在消耗種竹多、種苗運輸不便、勞動強度大、繁殖系數低等問 題。采用組織培養的方法效率高，條件可控，生長快，周期短，重復性強，可進行周年試驗或 生產等優點，可以快速繁殖苗，適合竹子的工廠化百苗。迄今為止，國內外竹子組織培養工作取得了很大的進展，但還是存在著許多的問 題，如何通過有效的消毒方法降低外植體的污染率，就是需要首先解決的問題。與其他植物 相比，竹子外植體消毒這一環節較為困難，很難達到理想的滅菌效果。這與竹類植物的特殊 形態結構有關。竹類植物的表皮細胞具有致密的乳突及較厚的角質層，乳突表面蠟質狀的 物質及乳突間嵌附著的塵埃和各種菌類的孢子等，均阻礙了消毒液的滲透，從而影響外植 體的充分滅菌。若選用桿芽、枝芽做外植體，中空堅硬的竹稈也導致外植體切割困難，細菌 和真菌孢子容易從中空部位進入竹稈內部組織，造成后續污染。在外植體消毒時，消毒時間 的控制也是一個重要問題，時間太短不能殺死細菌病毒，時間太長在殺死病菌的同時也會 對植物造成傷害，引起褐變，影響外植體的誘導與增殖。因此，尋找有效的滅菌方法，減少污 染瓶的丟棄，對于降低種苗生產成本和實現工廠化生產具有很重要的意義。目前國內對小蓬竹研究最多的是小蓬竹的群落結構、多樣性、水土保持功能、土壤 種子庫、葉面積指數以及其栽培技術研究應用等領域，而在組織培養方面尤其是外植體消 毒方法的研究還是空白。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種小蓬竹組織培養過程中的一個重要環節， 即外植體的消毒方法，以克服小蓬竹繁殖困難，和組織培養過程中成活率低的問題。植物組織培養通常按以下步驟一、培養基的配制和滅菌本發明實驗所用培養基為通用的MS培養基，培養基配 制后在24h內必須進行滅菌，通常采用的滅菌方法為高壓滅菌法，其原理是通過加熱，在密閉的高壓鍋內隨著水蒸氣壓力的不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之升
尚ο二、外植體的處理及消毒消毒的目標是既要消滅材料上的病菌，又不損傷植物材料。三、外植體的接種無菌操作實驗室中使用的無菌操作設備是超凈工作臺。接種前應進行地面的清潔 衛生工作，用75%乙醇噴霧噴灑接種室，擦拭超凈工作臺臺面，培養皿、酒精燈和其他工具 也要事先放在超凈工作臺上，一起用紫外燈照射20min。操作前要用酒精擦洗手，操作中要 經常用酒精擦洗手。不準講話，亦不準對著操作區呼吸，以免口腔中所帶的微生物污染材 料、培養基和用具。操作中可采用250或500mL的廣口瓶，放入95%的酒精，以便對操作工 具進行消毒。在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒 精燈火焰上灼燒滅菌。灼燒接種工具，待冷卻后在酒精燈附近打開培養基瓶口，立即將所取 的外植體迅速置入固體培養基中。在接種時，不能用生銹的解剖刀，動作要敏捷，隨切隨接， 減少傷口在空氣中暴露的時間。蓋瓶蓋前應將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上 燒一下，然后蓋上。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。四、植物組織培養培養條件為光照強度1200LX，每日光照12h，溫度25 27°C。從接種完起每天 觀察其生長和污染情況，30天后記錄結果，統計其污染數、成活數，進行分析得出最佳方案。植物組織培養的成功與否取決于外植體的制備、無菌操作和人工培養環境。外植 體的制備是能否建成離體繁殖系要過的第一關。所謂的外植體是指將外界生長的植物的細 胞和組織經過一系列的無菌處理形成的有活性的無菌組織或細胞，根據工作中的不同材料 采制適宜的外植體。消毒是植物組織培養的一個重要環節，在自然條件下作為植物的外植 體材料，不管內部還是外部均帶有很多的細菌和霉菌。因此為了讓外植體能夠在無菌的條 件下生長，消毒成了組織培養一個必不可少的步驟。消毒的目標是既要消滅材料上的病 菌，又不損傷植物材料。因此一方面要考慮藥劑對各類菌類的殺滅效果，從中選出最有效的 殺菌劑；另一方面，還應考慮植物材料對殺菌劑的忍耐力。使用什么藥劑、處理時間，要根據 植物材料種類和取用的部位進行試驗。本發明根據小蓬竹的特點，在實驗的基礎上，提出小蓬竹外植體的消毒方法，選擇 了最有效的殺菌劑，并根據小蓬竹材料對殺菌劑的忍耐性實驗出藥劑濃度和處理時間。本發明外植體的消毒方法，其消毒流程按下列步驟進行(1)將小蓬竹生長健壯 的半木質化枝條作外植體，用洗潔精溶液完全浸泡30min，(2)用自來水浸泡30min ； (3) 用流水沖洗至無泡沫產生為止，用濾紙吸干表面水分；(4)在超凈工作臺上把已沖洗干凈 的外植體浸入70-75%酒精中消毒Imin ； (5)用無菌水浸泡不斷搖動沖洗3 4次；(6)最 后浸入0. 升汞或2%次氯酸鈉溶液滅菌6-12min，其間不斷搖動；(7)然后用無菌水沖洗 后，用無菌濾紙吸干表面水分，即可用于接種。外植體一般使用乙醇濃度70% 75%。這一濃度范圍的乙醇具有較強的穿透力 和殺菌力。利用乙醇處理材料時，一般不超過30s。用乙醇處理外植體，除了有外植體體表 滅菌的作用外，還有浸潤組織材料的作用。許多植物的外植體都需要先通過乙醇的浸潤，然 后再使用其他藥品作進一步滅菌。由于竹類植物表皮細胞具有非常致密的乳突，塵埃及各種菌類的孢子嵌著在乳突間的縫隙內。乳突表面有一層蠟質狀的物質，表皮細胞還具有較 厚的角質層，這些都阻礙了消毒液的滲透。因此在用酒精進行消毒前還要先用洗潔精進行 浸泡，使里面蠟質狀物質溶化。且用乙醇消毒時間延長到Imin才能很好地浸潤組織。本發明使用升汞濃度為0. 1%，并在實驗基礎上提出處理時間。經過升汞處理過的 材料，由于升汞在外植體表面的殘留會導致外植體在培養過程中的壞死，甚至使培養失敗。 所以必須在升汞處理之后，用無菌水沖洗干凈，一般要沖洗5次以上，才可以保證外植體表 面的殘留升汞很少。本發明用2%次氯酸鈉同樣在實驗基礎上提出處理時間，處理后的外植體同樣要 用無菌水沖洗3 4次。實驗證明當步驟(5)酒精濃度為75%時，步驟(6)滅菌處理用0. 升汞處理外 植體lOmin，在MS培養基中，接種成活率最高，低于或高于lOmin，接種成活率都會降低。當步驟(5)酒精濃度為75%時，步驟(6)滅菌處理用2%次氯酸鈉處理外植體 IOmin,在MS培養基中，接種成活率最高，低于或高于lOmin，接種成活率都會降低。本發明的有益效果是解決了小蓬竹繁殖困難，尤其是組織培養過程外植體消毒、 誘導的問題，外植體污染率低，可降到13. 3%，接種后未污染的外植體成活率達到73. 3%, 克服了傳統的母竹移栽、竹鞭移栽等繁殖方法耗費資源、對生態環境破壞大、培植時間長、 效率低、運輸成本高等缺點，且不受季節的限制，為小蓬竹大面積的推廣與利用，充分發揮 其生態效益和經濟效益提供了快速且充足供應的有效途徑。以下通過具體實施方式
來進一步說明本發明的有益效果。
具體實施例方式以下結合較佳實施例，對依據本發明提出的小蓬竹組織培養無菌體系的消毒方 法，的具體實施方式
、特征及其功效，詳細說明如后。(一)試驗材料供試的材料采自從羅甸移栽于貴州大學苗圃、成活了的且生長健 壯的小蓬竹植株，外植體選用當年生枝芽飽滿的半木質化枝條。( 二)試驗方法1、培養基的滅菌選用通常使用的MS培養基，培養基配制后在24h內必須進行滅菌，通常采用的滅 菌方法為高壓滅菌法，其原理是通過加熱，在密閉的高壓鍋內隨著水蒸氣壓力的不斷上升， 使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之升高。首先將需要滅菌的物品放入滅菌設備中， 關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0. 05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零 后，再關閉放氣閥。隨著壓力不斷上升，水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。壓 力表上升達0. 1 0. 15Mpa時，鍋內溫度可達121°C。在此蒸汽溫度下，各種細菌及其高度 耐熱的枝孢被殺死。高壓滅菌后不變質的物品如無菌水、栽培介質、接種用具均可酌情延長 滅菌時間或提高壓力，以達到良好的殺菌效果。但培養基一定要嚴格遵守保壓時間，既要保 壓徹底，又要防止培養基中的成分變質或效力降低，不能隨意延長時間。一般高壓滅菌維持 20 30min即可。2、外植體的處理及消毒小蓬竹外植體采用生長健壯的半木質化枝條，用洗潔精溶液完全浸泡30min，然后用自來水浸泡30min，流水沖洗至無泡沫產生，用濾紙吸干表面水分。在超凈工作臺上 把已沖洗干凈的外植體浸入75%酒精中消毒lmin，用無菌水沖洗3 4(期間不斷搖動) 次后采用兩種消毒液之一 0. 升汞或2%次氯酸鈉溶液處理外植體。每種消毒液采用不 同消毒時間進行處理①0. 升汞滅菌6分鐘；②0. 升汞滅菌8分鐘；③0. 升汞滅菌10分鐘； ④0. 升汞滅菌12分鐘；⑤2%次氯酸鈉滅菌6分鐘；⑥2%次氯酸鈉滅菌8分鐘；⑦2% 次氯酸鈉滅菌10分鐘；⑧2%次氯酸鈉滅菌12分鐘(期間不斷搖動)。然后用無菌水沖洗 5次(每次4分鐘，期間不斷搖動)，用無菌濾紙吸干表面水分。將消毒好的外植體剪取長 約1.5cm帶芽的節枝，將外植體接種到培養基上，每種消毒處理接種10個，重復3次，成活 率取平均值。3、外植體的接種無菌操作實驗室中使用的無菌操作設備是超凈工作臺。接種前應進行地面的清潔 衛生工作，用75%乙醇噴霧噴灑接種室，擦拭超凈工作臺臺面，培養皿、酒精燈和其他工具 也要事先放在超凈工作臺上，一起用紫外燈照射20min。操作前要用酒精擦洗手，操作中要 經常用酒精擦洗手。不準講話，亦不準對著操作區呼吸，以免口腔中所帶的微生物污染材 料、培養基和用具。操作中可采用250或500mL的廣口瓶，放入95%的酒精，以便對操作工 具進行消毒。在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒 精燈火焰上灼燒滅菌。灼燒接種工具，待冷卻后在酒精燈附近打開培養基瓶口，立即將所取 的外植體迅速置入固體培養基中。在接種時，不能用生銹的解剖刀，動作要敏捷，隨切隨接， 減少傷口在空氣中暴露的時間。蓋瓶蓋前應將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上 燒一下，然后蓋上。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。4、培養條件人工培養環境主要與光照、溫度、滲透壓、酸堿度、通氣狀況等因子有著密切的關 系。人工培養環境是模擬植物的自然生長環境，即光照、溫濕度和土壤。組織培養通常在散 射光線下進行。將處理好的外植體材料接種到預備好的培養基上培養。培養條件為光照 強度1200Lx，每日光照12h，溫度25 27V。從接種完起每天觀察其生長和污染情況，30 天后記錄結果，統計其污染數、成活數，進行分析得出最佳方案。(三)觀察試驗現象及結果分析，實驗結果如表1(外植體消毒處理方法及培養結 果)，由表1可以看出不同的消毒劑和消毒時間對外植體的污染率和成活率產生不同的影 響。升汞處理隨著時間的延長，污染率呈現降低趨勢，處理12min時，污染率最低，成活率則 隨時間的延長呈現升高的趨勢，處理IOmin時，成活率最高，繼續延長時間則成活率下降； 次氯酸鈉處理也隨著時間的延長，污染率下降，12min時污染率最低，成活率隨時間的延長 升高，處理IOmin時，成活率最高。兩種消毒劑間比較，相同處理時間內，升汞處理污染率比 次氯酸鈉處理低，且升汞處理成活率較次氯酸鈉處理成活率高，升汞的消毒效果總體好于 次氯酸鈉。綜合考慮如上試驗結果可知，小蓬竹外植體適宜的消毒方法為上述8種處理中 的0. 升汞處理IOmin和0. 升汞處理12min，而0. 升汞處理IOmin不僅污染率較 低，而且成活率最高，因此，小蓬竹外植體最優消毒方法為0. 升汞處理lOmin。表1外植體消毒處理方法及培養結果
權利要求
一種小蓬竹組織培養過程中外植體的消毒方法，其特征是消毒流程按下列步驟進行，(1)將小蓬竹生長健壯的半木質化枝條作外植體，用1％洗潔精溶液完全浸泡30min，(2)用自來水浸泡30min；(3)用流水沖洗至無泡沫產生為止，用濾紙吸干表面水分；(4)在超凈工作臺上把已沖洗干凈的外植體浸入70 75％酒精中消毒1min；(5)用無菌水浸泡不斷搖動沖洗3～4次；(6)最后侵入0.1％升汞或2％次氯酸鈉溶液滅菌6 12min，其間不斷搖動；(7)然后用無菌水沖洗后，用無菌濾紙吸干表面水分，即可用于接種。
2.如權利要求1所述的消毒方法，其特征是步驟(5)酒精濃度為75%時，步驟(6)滅 菌處理用0. 升汞處理外植體IOmin。
3.如權利要求1所述的消毒方法，其特征是步驟(5)酒精濃度為75%時，步驟(6)滅 菌處理用2%次氯酸鈉處理外植體IOmin。
全文摘要
一種小蓬竹組織培養過程中外植體的消毒方法，(1)將小蓬竹生長健壯的半木質化枝條作外植體，用1％洗潔精溶液完全浸泡30min，(2)用自來水浸泡30min；(3)用流水沖洗至無泡沫產生為止，用濾紙吸干表面水分；(4)在超凈工作臺上把已沖洗干凈的外植體浸入70-75％酒精中消毒1min；(5)用無菌水浸泡不斷搖動沖洗3～4次；(6)最后浸入0.1％升汞或2％次氯酸鈉溶液滅菌6-12min，其間不斷搖動；(7)然后用無菌水沖洗后，用無菌濾紙吸干表面水分，即可用于接種。本發明填補了小蓬竹組織培養快速繁殖的空白，為小蓬竹的園林栽種、大面積綠化、喀斯特石漠化的恢復，奠定了迅速且充足供應的基礎，為小蓬竹的工廠化大規模生產提供了可行的方案。
文檔編號A01H4/00GK101933459SQ20101026879
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月1日 優先權日2010年9月1日
發明者何緒, 劉濟明, 孫運剛, 廖小鋒, 張東凱, 徐國瑞, 徐雪嬌, 李敏進 申請人:貴州大學