專利名稱：防治連作辣椒疫病的拮抗菌及其微生物有機肥料的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能防治連作辣椒疫病的拮抗菌及其微生物有機肥料，屬于農業集 約化生產技術，專用于克服和消除連作辣椒疫病問題。
背景技術：
辣椒原產于中南美洲熱帶和亞熱帶地區，現在在我國各地普遍栽培，成為我國栽 培面積最大的蔬菜作物之一，更是重要的出口創匯優勢經濟作物。隨著栽培年限的增加，辣 椒種植區土傳病害大規模發生，特別是設施生產的產業化、專一化、規模化等經營模式的出 現，使土傳病害更趨嚴重。辣椒疫病由卵菌病原體辣椒疫霉引起，是辣椒生產上最嚴重的土 傳性病害，從苗期到結果期都有發生。傳統的化學防治方法會對環境及人類造成負面影響， 如果沒有防治該病害的有效方法與途徑，這對中國的辣椒產業和人民的生活將產生很大影 響。我們的研究結果表明，連作作物疫病的關鍵問題不是養分缺乏或不平衡，也不是土壤次 生鹽漬化問題，而是土壤中的微生物區系及其次生物質的致毒問題。另一方面，水稻、小麥、玉米、油菜等作物秸稈就地焚燒、規模化養殖后的畜禽糞便 隨地棄置等不僅嚴重污染了環境，也極大地浪費了能作為有機肥和生物有機肥產品的原 料；大量的養分資源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系統之外，明顯地削弱了 我國農業可持續發展的能力。如何將從土壤中因作物收獲而取走的營養元素最大限度地歸 還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機廢棄物制成商品有機肥料再施入土壤。如 果將這些固體有機廢棄物經過高溫發酵合成高品位的有機堆肥，再用作功能菌的載體，所 制成的微生物有機肥料功能明確，將會有很好的應用前景。
發明內容
1.技術問題本發明的目的在于提供一種能防治連作辣椒疫病的拮抗菌及其微生物有機肥料， 使連作辣椒疫病的防治效率達到80%以上，使大量的設施農業土壤和露地辣椒連作障礙土 壤得到生物修復，確保集約化農業的順利發展。2.技術方案—株能克服或消除連作辣椒疫病的拮抗菌N幾Z-8，該微生物屬革蘭氏染色陽性的 短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，2009年7月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為 CGMCC NO. 3182，主要生物學特性為主要生物學特性為革蘭氏染色陽性(G+)，產芽孢。細 胞為桿狀，好氧或兼性厭氧生長，接觸酶陽性，氧化酶陰性，淀粉水解陰性，V. P.反應陽性， 甲基紅試驗陰性，發酵葡萄糖產酸不產氣，不能發酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，不能利用檸 檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，明膠水解陽性，卵磷脂酶陰性，不分解纖維素。用上述拮抗菌生產的防除連作辣椒疫病的微生物有機肥料，該肥料中含有IXlO8 個/g以上的拮抗菌NJLZ-8，全氮質量比含量為4 5% (90%以上為有機氮)、總氮磷鉀養分為6 10%、有機質含量為30 35%。所述微生物有機肥料的生產方法，包括1)將拮抗菌NJLZ-8接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，發酵生產的條件為 PH生長范圍自然，培養溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉/分鐘，發酵中后期 形成芽孢，使發酵液中含菌或芽孢量> IXlOici個/ml。所用PDA培養液配制方法為，以配 制IL培養基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經過濾后濾 液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值調至7. 2-7. 4，121°C滅菌20min。2)將拮抗菌^LZ-S發酵液分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物進 行固體發酵，每噸固體有機物料中加入拮抗菌液50L，固體發酵過程中每天翻堆1次，使固 體發酵溫度不超過50°C，發酵5天后結束，使拮抗菌NJLZ-8含量達到1 X IO8個/g以上， 獲得豬糞堆肥微生物有機肥和菜粕酶解混合物微生物有機肥，所用腐熟后的豬糞堆肥發芽 指數為98%以上，有機質質量比含量> 35%，有機氮質量比含量為1.2-2%，含水量質量比 25-30%。其中菜粕的微生物酶解混合物制備方法為，將保藏號為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽 寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發酵液加入到菜粕原料中，調節 含水量55-65%和pH 6. 0-7. 5，進行開放式固體發酵，待發酵溫度上升至50°C時立即開始 翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發酵開始后，堆物的pH會不斷 上升，每次翻堆時用含酸液體調節含水量和PH，使它們分別維持在55-65%和6. 0-7. 0，發 酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物PH調整為5. 0左右，再進行低溫干燥或自然涼 干，即為菜粕的微生物酶解混合物。3)然后將固體發酵的豬糞堆肥微生物有機肥和菜粕酶解混合物微生物有機肥按 體積比60 40的比例充分混合后熟2天，后熟過程中翻堆2次，將后熟物低溫干燥至30% 的含水量，包裝出廠即為能防治連作辣椒疫病的微生物有機肥。所述微生物有機肥料可專用于防治連作辣椒疫病。3.有益效果本發明涉及一種能克服或消除連作辣椒疫病的微生物有機肥料及其生產方法，利 用豬糞堆肥和菜粕微生物酶解氨基酸混合物，再與拮抗菌液混合后制成微生物有機肥料， 其產品與目前市場上的產品相比具有如下優點1)肥料產品中含有抑制辣椒疫病病原卵菌生長的專一性高效菌株(短小芽孢桿 菌^LZ-S)，其抑制效果非常顯著，肥料中該高效菌株的含量達到1 X IO8個/g以上，施入土 壤后能形成優勢群，并在土壤中存活下來。2)肥料產品中含有豐富的可溶性有機碳和有機氮，能給功能菌提供十分優越的生 長環境，極大地提高了拮抗菌在土壤中的定殖和發揮功能的能力。3)本發明產品有機磷和有機氮含量特別高，均達到4%。本產品原料之一為豬糞， 總磷含量很高，而且生物有效性特別高，在該微生物有機肥料產品中無需添加任何含磷化 肥，使用本產品后能使作物順利度過苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物 有效性較差；本產品中有機氮能達到4%以上(大部分為氨基酸和小分子多肽)，確保了肥 料氮素持續穩定的供應，使所種作物生長和抗逆能力大大增強。4)研究結果表明，在連作辣椒的土壤上施用本產品后，能顯著降低辣椒疫病的發 病率，生物防治率達80%以上，并且植株長勢良好(圖2)。連續施用本肥料的土壤，對連作辣椒疫病的生物防治率更高。
四
圖1拮抗菌株NJLZ-8的平板拮抗效果圖2盆栽效果注1.CK (有連作辣椒疫病土壤)2. CK+常規有機肥3. CK+拮抗 菌NJLZ-8菌液4. CK+拮抗菌NJLZ-8經二次發酵的有機肥(本發明肥料產品)
五具體實施例方式(一 )菌株的分離和鑒定采集已經發生辣椒疫病的植株，采用疫霉選擇性培養基從發病辣椒的莖的病健交 界部位分離獲得病原菌，并驗證其致病性。然后以辣椒疫病病原菌為指示菌，從連作辣椒疫 病發病田塊中的健康植株根際土壤中分離拮抗菌。然后通過盆栽試驗復篩高效拮抗菌株， 最終獲得拮抗菌^LZ-S并進行鑒定，菌種于30%甘油中-70°C保存。平板對峙試驗結果發 現拮抗菌NJLZ-8對病原菌的抑制率達到68% (如圖1)。拮抗菌NJLZ-8屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，其主要生物學特性為革 蘭氏染色陽性(G+)，產芽孢。細胞為桿狀，好氧或兼性厭氧生長，接觸酶陽性，氧化酶陰性， 淀粉水解陰性，V. P.反應陽性，甲基紅試驗陰性，發酵葡萄糖產酸不產氣，不能發酵木糖、 L-阿拉伯糖、甘露醇，不能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，明膠水解陽性，卵磷脂酶陰性， 不分解纖維素。( 二 )菌劑生產1)將拮抗菌NJLZ-8接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，發酵生產的條件為 PH生長范圍自然，培養溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉/分鐘，發酵中后期 形成芽孢，使發酵液中含菌或芽孢量> IXlOici個/ml。所用PDA培養液配制方法為，以配 制IL培養基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經過濾后濾 液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值調至7. 2-7. 4，121°C滅菌20min。2)將拮抗菌^LZ-S發酵液分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物分 別進行固體發酵，每噸固體有機物料中加入拮抗菌液50L，固體發酵過程中每天翻堆1次， 使固體發酵溫度不超過50°C，發酵5天后結束，使拮抗菌含量達到1 X IO8個/g以上，獲得 固體發酵的豬糞堆肥微生物有機肥和菜粕酶解混合物微生物有機肥。所用腐熟后的豬糞堆 肥發芽指數為98%以上，有機質質量比含量> 35%，有機氮質量比含量為1.2-2%，含水量 質量比25-30% ο其中菜粕的微生物酶解混合物制備方法為(公知公用，見發明專利 ZL200610086126.0，一種農用氨基酸的生物制取方法及其肥料產品)，將保藏號為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發酵液加入 到菜粕原料中，調節含水量55-65%和pH 6. 0-7. 5，進行開放式固體發酵，待發酵溫度上升 至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發酵開 始后，堆物的PH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調節含水量和PH，使它們分別維持在 55-65%和6. 0-7. 0，發酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物pH調整為5. 0左右，再進 行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕的微生物酶解混合物(含氨基酸的混合材料)。
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3)然后將豬糞堆肥微生物有機肥和菜粕酶解混合物微生物有機肥按體積比 60 40的比例充分混合后熟2天，后熟過程中翻堆2次，將后熟物低溫干燥至30%的含水 量，包裝出廠即為能防治連作辣椒疫病的微生物有機肥產品。上述防除連作辣椒疫病微生物有機肥料，該肥料產品中含有IXlO8個/g以上的 拮抗菌NJLZ-8、全氮質量比含量為4 5% (90%以上為有機氮)、總氮磷鉀養分質量比為 6 10%、有機質質量比含量為30 35%。(三)盆栽試驗盆栽試驗中，辣椒品種為蘇椒五號，采用健康水稻土育苗至6 8片真葉時，移栽 至小塑料盆中。連作辣椒疫病嚴重的土壤采自安徽阜南縣。每盆裝連作辣椒疫病嚴重的土 壤3kg，拮抗菌NJLZ-8菌液處理以108cfu/g 土均勻拌入連作辣椒疫病土壤中，本發明肥料 產品以2%的使用量(w/w)均勻拌入病土中。每個處理3組重復，每組重復6株辣椒。培養 時保持各處理土壤中濕度、溫度一致。移栽35d后，統計發病情況，測定各項指標。結果表明，連作土壤的發病率為88%，并且存活植株長勢矮小，生長緩慢；連作土 壤中接種拮抗菌NJLZ-8菌液處理的發病率為25 %，防治率達72 %，連作土壤中施用本發明 肥料產品處理的發病率為16%，防治率達82% (表1)，并且植株長勢良好(圖2)。說明本 產品能有效的抑制辣椒疫病的發生，提高辣椒疫病的防治的防治效果。連作土壤中對照處理的辣椒產量僅為4g · pot—1，而連作土壤中施用本發明肥料產 品處理的產量為為43. 92g TOtl增產達9. 95倍。連作土壤的辣椒地上部鮮重為19. 60g/ 株，干重為4. IOg/株，而連作土壤中施用本發明肥料產品處理的辣椒鮮重為43. 92g/株，干 重為12. 91g/株(表2)，生物量差異顯著；連作土壤中施用本發明肥料產品處理較對照處 理，葉片凈光合速率、蒸騰速率顯著增加(表3)，有利于植物光合產物的積累和儲藏，從而 提高辣椒產量和生物量。這些結果表明，本產品除了能有效的降低辣椒疫病的發生外，還能 降低或消除病原菌對辣椒生長產生的抑制作用，顯著的促進辣椒的生長。表1盆栽試驗辣椒疫病發病率及防治效果
權利要求
一種能防治連作辣椒疫病的拮抗菌NJLZ 8，屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，于2009年7月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.3182；LZ 8的主要生物學特性為革蘭氏染色陽性G+，產芽孢。細胞為桿狀，好氧或兼性厭氧生長，接觸酶陽性，氧化酶陰性，淀粉水解陰性，V.P.反應陽性，甲基紅試驗陰性，發酵葡萄糖產酸不產氣，不能發酵木糖、L 阿拉伯糖、甘露醇，不能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，明膠水解陽性，卵磷脂酶陰性，不分解纖維素。
2.用權利要求1所述拮抗菌生產的防治連作辣椒疫病的微生物有機肥料。
3.根據權利要求2所述的微生物有機肥料，其特征在于該肥料中含有IXIO8個/g以 上的拮抗菌NJLZ-8、全氮質量比含量為4 5%、全氮中質量比90%以上為有機氮、總氮磷 鉀養分質量比為6 10%、有機質質量比含量為30 35%。。
4.權利要求2或3所述微生物有機肥料的生產方法，包括1)將權利要求1所述的拮抗菌NJLZ-8接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，發酵生 產的條件為培養溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉/分鐘，發酵中后期形成 芽孢，使發酵液中含菌或芽孢量> 1 X IO10個/ml ；2)將拮抗菌^LZ-S發酵液分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物進行固 體發酵，每噸固體有機物料中加入NJLZ-8發酵液50L，固體發酵過程中每天翻堆1次，使固 體發酵溫度不超過50°C，一般發酵5天后結束，使拮抗菌NJLZ-8含量達到1 X IO8個/g以 上，獲得豬糞堆肥微生物有機肥和菜粕酶解混合物微生物有機肥；其中菜粕的微生物酶解 混合物制備方法為，將保藏號為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發酵液加入到菜粕原料中，調節含水量55-65%和pH 6. 0-7. 5，進 行開放式固體發酵，待發酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維 持在35-50°C共5天，固體發酵開始后，堆物的pH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調節 含水量和pH，使它們分別維持在55-65%和6. 0-7. 0，發酵終止時再用含酸液體進行噴灑， 直至堆物PH調整為5. 0，再進行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕的微生物酶解混合物；3)然后將固體發酵的豬糞堆肥微生物有機肥和菜粕酶解混合物微生物有機肥按體積 比60 40的比例充分混合后熟2天，后熟過程中翻堆2次，將后熟物低溫干燥至30%的含 水量，包裝出廠即為能防除連作辣椒疫病的微生物有機肥。
5.根據權利要求4中所述微生物有機肥料的生產方法，其中步驟1)所用PDA培養液 配制方法為用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經過濾后濾液中加 20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值調至7. 2-7. 4，121°C滅菌20min。
6.根據權利要求4或5所述微生物有機肥料的生產方法，其中步驟2)所用腐熟后的豬 糞堆肥發芽指數為98%以上，有機肥質量比含量> 35%，有機氮質量比含量為1.2-2%，含 水量質量比25-30%。
7.權利要求2或3所述微生物有機肥料在防治連作辣椒疫病中的應用。
全文摘要
本發明涉及能克服或消除辣椒疫病的拮抗菌及其生產的微生物有機肥料，屬于農業集約化生產技術。本發明分離到了對辣椒連作疫病病原卵菌有顯著拮抗作用的拮抗菌(短小芽孢桿菌NJLZ-8)，該拮抗菌與有機肥混合制成微生物有機肥料，肥料中含有1×108個/g以上的拮抗微生物數量、全氮含量為4～5％(90％以上為有機氮)，總氮磷鉀養分為6～10％、有機質含量為30～35％。試驗表明，這種微生物有機肥料施入土壤后能夠使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成優勢群，在辣椒疫病嚴重的土壤中對辣椒疫病的生物防治率達80％以上。在還沒有形成連作障礙的土壤上長期施用本微生物有機肥料能在很大程度上防止辣椒疫病的發生。
文檔編號C05F11/08GK101948780SQ20101026849
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月1日 優先權日2010年9月1日
發明者冉煒, 徐陽春, 楊興明, 梅新蘭, 沈其榮 申請人:南京農業大學