專利名稱：蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及細菌的應用， 提供了蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬 菜致病菌中的新應用。
背景技術：
近年來，各種各樣的蔬菜制品占領了各大超市。即食蔬菜就是其中一種，這種蔬菜 制品進行深加工后真空包裝上架，不僅可以延長貯藏期，有利于保存運輸，調劑蔬菜的淡旺 季，做到全年均衡供應，而且還可以改進蔬菜風味，增加花色品種，滿足人們對蔬菜副食品 日益增長的需要。即食蔬菜是由各種新鮮蔬菜加工而成，新鮮蔬菜由于水分含量很大，非常容易引 起微生物的繁殖，導致蔬菜的腐敗變質。大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球 菌是其主要易染致病菌，占所有蔬菜致病菌的80%以上。還有日常生活中人們食用的一些 生食蔬菜如蔥、番茄、黃瓜、生菜等，往往都是清洗之后直接食用，這樣很容易造成細菌性食 物中毒。蔬菜在清洗過程的除菌方法，目前常用的主要是化學除菌、熱殺菌和一些物理方 法。化學方法主要是應用一些化學殺菌劑，如液氯、次氯酸鈉、二氧化氯、臭氧等，這些化學 殺菌劑不僅容易造成殘留而對人體造成危害，加工生產中產生的廢水、廢渣排放到環境中 還容易造成環境污染。物理殺菌方法的高成本、熱殺菌對蔬菜色香味的影響等都制約著即 食蔬菜的發展。蛭弧菌是寄生于其他細菌，并能導致宿主細菌裂解的一類細菌。比一般細菌小， 能通過細菌濾器，有類似噬菌體的作用。單細胞，呈弧形或逗點狀，有時呈螺旋狀，大小 0. 2 0. 6X0. 8 1. 2微米，端生鞭毛，多為一根。革蘭氏染色呈陰性，可以裂解致病菌或 潛在致病性細菌。我們的最新研究表明，有的蛭弧菌菌株可以裂解包括大腸桿菌、沙門氏 菌、金黃色葡萄球菌等一些常見食源性致病菌。蛭弧菌的生活史分兩個階段自由生活，能 運動，不進行增殖的游泳體階段和在特定宿主細菌的周質空間內進行生長繁殖的蛭質體階 段。蛭弧菌進入宿主菌細胞周質空間后，宿主細菌在30分鐘內即停止呼吸作用，死亡；而蛭 弧菌則分泌多種酶，通過降解宿主細胞的大分子成為單體，然后攝入用于其生物大分子的 合成。隨著細胞增殖和水解酶產生，使宿主細胞壁膜被破壞，從而裂解釋放出蛭弧菌。與游 泳體相比，蛭質體具有制備、保存更為方便，環境耐受力強，殺菌作用時間雖略慢但更久等 特點。已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無論是在食品工業還是在(海洋) 水產養殖等領域，蛭弧菌的應用均是安全的。例如在國外，Lenz and Hespell (1978) 研究發現，蛭弧菌及對動物及人的細胞不具侵染性[Lenz R. W. , Hespell R. B. Attempts to growbedellovibrios micurgically-injected into animal eelIs.Archives ofMicrobiology, 1978,119 (3) =245-248] 在國內，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對魚類細 胞的作用，發現它對魚類細菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬，邱軍強。蛭弧菌BDH21 02對魚類細胞及病原菌的作用。微生物學通報，2006，33(1) :7_11]。因此，應用蛭弧菌蛭質體作為清洗劑用于蔬菜在食用前、加工的清洗過程中，既不 會導致細菌出現抗性，也無噬菌體療法中宿主過于專一的缺點，有效的控制和消除生食蔬 菜、即食蔬菜食用前、加工過程中的菌落總數及致病菌。在保證食品安全、營養的同時也有 效降低了耗能。因此蛭弧菌蛭質體作為一種新的殺菌方法具有相當大的優勢。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的弊端，提供蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜清洗 過程、加工設備及加工環境中致病菌的新應用。本發明的目的通過以下技術方案實現蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用。所述蛭弧菌蛭弧菌為(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中國 典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 209172。所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用是將蔬菜在蛭弧菌蛭質體菌 液中浸泡15-45min或者在蔬菜的加工環境中噴灑蛭弧菌蛭質體菌液，噴灑用量為10 100mL/m2。所述蛭弧菌蛭質體菌液濃度至少為102pfu/mL，優選IO2 106pfu/mL。所述蛭弧菌蛭質體菌液的制備方法為接種宿主于營養肉湯液體培養基中，在35°C和200rpm搖床培養12h，培養液經 4 "C，5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀加入至DNB液體培養基中，接入蛭弧菌 BDFM05，在溫度25 35°C下，以150 300rpm搖床培養36 48h，得到含蛭弧菌蛭質體和 蛭弧菌游泳體的培養液，培養液在4°C溫度下以6000 8000rpm離心15 20min后，去除 含蛭弧菌游泳體的上清，得到的沉淀即為蛭弧菌蛭質體；將蛭弧菌蛭質體用DNB液體培養 基、水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO11 1012pfu/mL的蛭弧菌蛭質體菌液。將所述蛭弧菌BDFM05進行負染后于電子顯微鏡下進行形態觀察BDFM05呈單細 胞，橢圓形，大小為1. 43X0. 53 μ m，端生鞭毛，鞭毛長度至少2 μ m ；所述蛭弧菌BDFM05以雙 層平板法于28°C培養三天可形成直徑2 3mm的透明圓形噬菌斑。本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果1、本發明所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用于蔬菜清洗過程中 致病菌的消除效果顯著。如圖1-5所示，本發明對食用前、加工過程蔬菜攜帶致病菌有良好的消除作用，菌 落總數及致病菌的消除率均可達99%以上，能消除的細菌大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特 菌、金黃色葡萄球菌，這四種菌占所有污染致病菌的80%以上。2、本發明所述蛭弧菌在消除蔬菜中菌落總數及常見致病菌的應用中安全性好。蛭弧菌蛭質體菌液消除蔬菜攜帶的常見致病菌的方法是生物的方法，蛭弧菌具有 可侵染、裂解宿主細菌的特性，使之適合作為抑止或清除蔬菜表面致病菌的生物凈化因子， 且其在裂解完宿主細菌后，會因饑餓而自動消亡，因此對人和動物無毒副作用。有效地減少 或消除化學藥物殺菌的殘留，確保蔬菜的優質，從根本上避免蔬菜類產品食物中毒事件的發生。提高了消費者食用蔬菜的安全系數，保護了消費者的健康。3、與常規殺菌方法相比，蛭弧菌蛭質體菌液除菌更環保，避免了化學殺菌劑產生 的廢水、廢渣對環境的破壞。4、本發明還可延伸推廣應用于其它蔬菜產品和水果，特別有利于減少或消除化學 藥物如農藥的使用和殘留，確保蔬菜和水果的優質，對提高食用安全性，保障人類健康具有 十分重要的意義；同時為出口貿易保駕護航。
圖1不同濃度蛭弧菌蛭質體菌液做為除菌劑在消除蔬菜表面致病菌的試驗效果 比較圖。圖2蔬菜食用、加工清洗過程施加104pfU/mL蛭弧菌蛭質體時致病菌濃度對數 值-時間圖；圖3蔬菜施用102pfu/ml蛭弧菌蛭質體消除大腸桿菌時的致病菌殘留率-時間 圖；圖4加工設備及環境噴灑蛭弧菌蛭質體時菌落總數殘留率_噴灑量圖。圖5各常規殺菌劑在蔬菜清洗中消除其攜帶致病菌時各致病菌濃度平均值的對 數值-時間圖。圖6蛭弧菌蛭質體在蔬菜清洗中消除其攜帶大腸桿菌(Escherichiacoli)、 沙門氏菌(Salmonella)、單增李斯特菌(Listeriamonocytohenes)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)時的致病菌濃度對數值-時間圖。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明作進一步地詳細說明，但實施方式并不僅限于此。實施例1蛭弧菌蛭質體菌液在生菜清洗時，對其攜帶致病菌的消除。蛭弧菌蛭質體制備分別在2個裝有IOOmL NB (營養肉湯)液體培養基的錐形瓶中接種lOmLxliTcfu/ mL嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號 GIM1. 172，200rpm、28°C搖床培養18小時，培養液分別于4°C、5000rpm離心15min,棄上 清。分別將沉淀加入到2個裝有IOOmL DNB液體培養基(營養肉湯0.8g，酪蛋白酸水解 物0.5g，酵母精提物0. lg，溶于IOOOmL蒸餾水中，pH值為7.4)的錐形瓶中，再分別加入 IOmLx 103pfu/mL 蛭弧菌 BDFM05。恒溫搖床 250rpm、28°C 培養 36h。培養液分別于 4°C 6000rpm 離心20min，去除含蛭弧菌游泳體的上清，保留沉淀(即蛭弧菌蛭質體菌液)，加入5mL DNB 液體培養基(營養肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于IOOOmL蒸餾水 中，PH值為7. 4)重新懸浮蛭弧菌蛭質體，得到蛭弧菌蛭質體。蛭弧菌蛭質體菌液作為清洗劑對蔬菜中致病菌的消除(1)致病菌的制備于4瓶各含IOOmL普通營養肉湯培養基中，分別接種lOmLxliTcfu/mL大腸 桿菌(Escherichia coli，購于廣東省微生物研究所，編號GIM1. 137)、鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium,購于廣東省微生物研究所，編號GIM1. 237)、單增李斯特菌(Listeriamonocytohenes,購于廣東省微生物研究所，編號GIM1. 228)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus,購于廣東省微生物研究所，編號GIM1. 142)，搖床培養，160rpm 28°C培養12-16h，增殖培養液經6000rpm、4°C離心20min，棄上清液，沉淀菌體用5mL無菌 PH7. 2的PBS (磷酸鹽緩沖溶液)懸浮，得到濃度為109CfU/ml的原液，最后制備上述四種菌 的混合液，每種菌的終濃度為105CfU/ml。(2)菌落總數及致病菌消除取新鮮生菜，實驗分對照組和實驗組，每組三個平行， 每個平行取生菜10g，所有 對照組和試驗組的生菜先經75%酒精殺菌，后浸泡到(1)中制備好的500mL混合菌液中 lmin，取出浙干后，實驗組噴灑5ml的濃度分別為102pfu/mL、104pfu/mL、106pfu/mL的蛭弧 菌蛭質體菌液，對照組噴灑等量清水，室溫放置30min，每隔IOmin檢測一次。菌落總數、大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌的檢測方法具體 如下用無菌生理鹽水濕潤的滅菌拭子(棉花簽)在菜葉表面上均勻的涂抹4次后，置含 無菌生理鹽水的無菌離心管中振蕩、混勻，然后取0. ImL涂布，根據國標GB4789. 2-2010菌 落總數用營養瓊脂培養基檢測、根據國標4789. 38-2008大腸桿菌用VRB_MUG(中性紅-膽 鹽培養基)培養基檢測、根據國標4789. 4-2010沙門氏菌用BS(亞硫酸鉍瓊脂)培養基 檢測、根據國標4789. 30-2010單增李斯特菌用李斯特氏菌顯色培養基檢測、根據國標 4789. 10-2010金黃色葡萄球菌用Baird-Parker瓊脂平板檢測。如圖1、2所示，噴灑清水的對照組對菌落總數的清除率很低，只有15%，而添加蛭 弧菌蛭質體后的試驗組中菌落總數和各致病菌濃度均呈下降趨勢。實驗結果表明，應用蛭 弧菌(BDFM05)蛭質體對菌落總數、致病菌進行消除時，蛭弧菌蛭質體濃度越高，對菌落總 數、致病菌的消除作用越好，當蛭弧菌蛭質體濃度達104pfU/mL時，經過30min，致病菌消除 率達 99. 99%。實施例2蛭弧菌蛭質體菌液對西葫蘆表面大腸桿菌的消除作用蛭弧菌蛭質體菌液制備方法同例1。大腸桿菌制備方法同例1。稀釋成105Cfu/mL備用。取新鮮西葫蘆，試驗設對照和實驗組，各設三個平行，每個平行一根。所有對照組 和試驗組的生菜先經75%酒精殺菌，后浸泡到已制備好的500mL混合菌液中lmin，取出浙 干后，實驗組噴灑102pfu/m蛭弧菌蛭質體菌液5mL，對照組噴清水，室溫放置40min，每隔 IOmin取樣檢測一次，具體方法是取經無菌生理鹽水濕潤的滅菌拭子(棉花簽)在西葫蘆 表面上均勻的涂抹4次后，置含無菌生理鹽水的無菌離心管中振蕩、混勻，然后采用平板涂 布方法檢測。具體檢測方法同例1。結果如圖3所示，在使用蛭弧菌蛭質體(BDFM05)的實驗組，在40min的試驗結束 時，致病菌已檢測不到，即完全消除；而施用清水的對照組，大腸桿菌的殘留率仍達85%。實施例3蛭弧菌蛭質體菌液應用于蔬菜加工過程應用設備、加工環境的消毒殺 菌。試驗包括以下具體步驟及其條件步驟一同實施例1的步驟一步驟二 致病菌消毒的應用實驗。對蔬菜加工車間地面和墻體、運輸蔬菜的傳送帶及蔬菜清洗設備的表面，均勻噴灑濃度為102pfU/mL的蛭弧菌蛭質體菌液，噴灑使用量則按試驗組的不同分別為10mL/m2、 30mL/m2、50mL/m2、70mL/m2、或100mL/m2，每天噴灑一次，連續噴灑兩天，對照噴灑清水。具體 檢測方法是用濕的無菌棉簽在加工設備表面或車間地、墻面等擦涂取樣，再用平板培養計 數。檢測方法同例1。結果如圖4所示，在隨后的環境病菌檢測中，噴灑清水的對照組各種致病菌均有 檢出，菌落總數的殘留率依然很高，達到78%，而在噴灑蛭弧菌蛭質體的試驗組中，僅在噴 灑量為10mL/m2組中檢測到3 4cfu/mL的沙門氏菌，其他噴灑量的試驗組沒有檢測到常 見致病菌。本試驗研究的結果表明蛭弧菌在消除蔬菜加工過程中致病菌方面的效果顯著， 可確保蔬菜產品品質及安全。由此可見，蛭弧菌作為殺菌劑可以廣泛地推廣應用于蔬菜的 清洗加工過程中。實施例4
蛭弧菌蛭質體菌液與常規蔬菜殺菌劑殺菌效果比較常規蔬菜殺菌劑有氯系殺菌劑(次氯酸鈉、漂白粉、漂粉精等)、電解酸性離子水、 二氧化氯、臭氧、過氧化物與氯氧化物混合。本例以新鮮小白菜為例，蛭弧菌蛭質體采用BDFM05蛭質體，取白菜葉15g，用75% 酒精殺菌后，先將新鮮蔬菜浸泡到制備好的500mL致病菌混合液中lmin，取出浙干，再浸泡 到500mL各種殺菌劑及蛭弧菌蛭質體菌液中，40min。初始每隔Imin檢測一次，IOmin后，每 隔IOmin檢測一次。具體檢測方法同例1。蛭弧菌蛭質體菌液制備同例1，濃度為102pfu/mL。致病菌混合液制備方法同例1。 濃度分別為105cfu/mL。常規殺菌劑殺菌圖中致病菌取各致病菌數平均值。結果如圖5及圖6所示。從圖5中可以看出常規殺菌劑起效快，一般2min內可 基本上殺滅病原菌。從圖6中可以看出單株蛭弧菌蛭質體30min內可殺滅99%的致病菌， 40min時致病菌已檢測不到。蛭弧菌蛭質體通過菌裂解消除致病菌需要一個過程，所以起效 慢，但是20min內可殺滅65%以上的病原菌。蛭弧菌蛭質體通過裂解消除致病菌屬于生物 防治，使用安全不會對環境造成污染，也不會對蔬菜品質造成影響。
權利要求
1.蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用。
2.根據權利要求1所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特征在于 所述蛭弧菌蛭弧菌為(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中國典型培養 物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 209172。
3.根據權利要求1所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特征在于 所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用是將蔬菜在蛭弧菌蛭質體菌液中浸泡 15-45min。
4.根據權利要求1所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特征在于 所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用是在蔬菜的加工環境中噴灑蛭弧菌蛭 質體菌液，噴灑用量為10 100mL/m2。
5.根據權利要求3或4所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特征在 于所述蛭弧菌蛭質體菌液濃度至少為102pfu/mL。
6.根據權利要求5所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特征在于 所述蛭弧菌蛭質體菌液濃度為IO2 106pfu/mL。
7.根據權利要求1所述蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用，其特征在于 所述蛭弧菌蛭質體菌液的制備方法為接種宿主于營養肉湯液體培養基中，在35°C和200rpm搖床培養12h，培養液經4°C， 5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀加入至DNB液體培養基中，接入蛭弧菌BDFM05， 在溫度25 35°C下，以150 300rpm搖床培養36 48h，得到含蛭弧菌蛭質體和蛭弧菌 游泳體的培養液，培養液在4°C溫度下以6000 8000rpm離心15 20min后，去除含蛭弧 菌游泳體的上清，得到的沉淀即為蛭弧菌蛭質體；將蛭弧菌蛭質體用DNB液體培養基、水、 生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO11 1012pfu/ mL的蛭弧菌蛭質體菌液。
全文摘要
本發明涉及細菌的應用，特別涉及蛭弧菌蛭質體菌液在消除蔬菜致病菌中的應用。所用蛭弧菌蛭質體濃度至少達到102pfu/mL。應用中致病菌清除率均在99％以上。本發明適合推廣應用于所有蔬菜和水果。不僅可提高消費者食用即食蔬菜的安全系數，保護消費者的健康，也為蔬菜的綠色加工生產提供保障。
文檔編號A01P1/00GK102038002SQ20101026845
公開日2011年5月4日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者李娜, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學