專利名稱：一種誘導菊花體細胞胚間接發生的方法
技術領域：
本發明屬于植物的組織培養領域，具體涉及一種誘導菊花體細胞胚間接發生的方 法。
背景技術：
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)原產中國，是深受人們喜愛的傳統 十大名花之一，名列全世界花卉消費量的前列，約占花卉銷售總量的23% (陳俊愉，2001 ； Anderson, 2005)。既可作為盆栽花卉(盆菊)、切花花卉(切菊)，也是城市園林綠化的地 被花卉(地被菊)、還是重要的保健飲用花卉(茶用菊)。植物再生方式主要為器官分化方式和體細胞胚發生方式 (somaticembryogenesis)，體細胞胚發生方式與器官分化方式相比，具有數量多、速度快、 結構完整、再生率高等優點(Ammirato，1983 ；Gupta 等，1993 ；Shinoyama 等，2004 ；Mandal 和Datta，2005))。同時體細胞胚的結構完整，一旦形成，一般可直接萌發形成小植株(李浚 明，1992)。植物的體細胞胚胎發生與器官發生是兩個完全不同的生長、發育、分化過程。體細 胞胚胎發生培養的細胞經歷類似合子胚發生的階段，形成非合子胚，再發育成成熟胚，最后 萌發形成植株；而器官發生是由外植體或其形成的愈傷組織分化長出根、莖、葉等器官，再 逐步形成植株的再生方式，在培養物上能看到典型的芽或根的結構(HaCCiuS，1978 ；崔凱 榮和戴若蘭，2000)。體細胞胚除了通過直接或間接方式誘導成苗和作為分子生物學研究的材料以外 (Shinoyama等，2004 ；Mandal和Datta，2005)，胚狀體發育及其植株再生系統也是最理想 的基因轉化受體系統。體細胞胚是由類似合子胚特性的胚性細胞發育而來，這些胚性細胞 具有很強的接受外源DNA的能力，是理想的基因轉化感受態細胞；而且胚性細胞繁殖量大， 同步性好，轉化后的胚性細胞可順利發育成胚狀體及完整的轉基因植株。大量研究表明， 體胚發生多是單細胞起源，轉化獲得的轉基因植株嵌合體少(Shinoyama等，2004 ；Mandal 和Datta，2005)，因此，植物體細胞胚發生可作為理想的遺傳轉化受體體系(洪波等，2006 ； Blanc 等，2006)。體細胞胚發生還可用于植物種質資源庫的建立，利于保存優良的植物種質資源 和瀕危植物資源(Laine和David, 1992 ；Gupta等，1993 ；裴新梧和王亞馥，2000)。利用體 細胞胚還可包裝制作人工種子，進行植物離體快速繁殖、快速育苗和現代化的栽培、管理 (Piccioni 和 Standardi, 1995 ；Castillo 等，1998 ；Ara 等，1999 ；Saxena 和 Dhawan，1999 ； 肖穎和王剛，2006)。利用體細胞胚也可進行植物體細胞無性系變異篩選，能分離優良的體 細胞無性系變異變異，再通過體細胞胚發生形成完整的植株，得到植物新種質(品種)，從 而克服傳統育種中的一些缺陷，縮短育種周期，進行非常規育種(裴新梧和王亞馥，2000)。在菊花的組織培養中，常見的再生方式是器官分化方式。但這種方式一方面需要 大量的母株獲取外植體；另方面再生速度慢，導致無性系的繁殖率降低；同時易產生變異，
3穩定性較差。因此對于大規模的菊花生產以及菊花的細胞工程和基因工程而言，利用器官 分化途徑的再生方式已遠遠不能滿足需要。因此建立菊花間接體細胞胚發生的技術體系具 有十分重要的意義。菊花體細胞胚發生的最早報道是1991年May等利用菊花品種‘Iridon’葉片，在 附加2，4-D 1. Omg/L+6-BA 0. 2mg/L+9% 18%蔗糖的改良MS基本培養基上，獲得了直接 體細胞胚發生植株；并發現菊花體細胞胚的產生起源于單細胞；同時也發現菊花體細胞胚 發生有較強基因型依賴性，在23個品種中有12個產生了體細胞胚，但只有5個品種獲得了 再生植株，且體細胞胚發生形成的再生植株的再生頻率最大的只有9%。Pavingerova等 (1994)以葉片(品種為‘WhiteSnowdon，)外植體通過液體和固體培養獲得了體細胞胚，但 體細胞胚發生形成的再生植株的再生頻率最大的只有47%，同時體細胞胚發生也有較強的 基因型依賴性；Tanaka等(2000)從菊花的管狀花中誘導出了胚性愈傷，但體細胞胚發生頻 率最高只有56% ；Mandal和Datta等(2005)也發現了菊花體細胞胚發生的基因型依賴和 誘導頻率較低的問題。綜上所述，菊花體細胞胚誘導中存在的問題主要問題有較強基因型 依賴性，胚性愈傷組織分化率較低、體細胞胚發生形成的再生植株的再生頻率較低，再生植 株的穩定性較差等。
發明內容
本發明的目的在于提供一種誘導菊花體細胞胚間接發生的方法，包括如下步驟(1)獲得菊花無菌苗將表面滅菌的菊花帶腋芽莖段接種到以MS為基本培養基， 添加了 6-芐氨基嘌呤6-BA1. Omg/L、萘乙酸NAAO. lmg/L、質量分數為0. 75%的瓊脂、質量分 數為3%的蔗糖，pH6.0的培養基上，誘導叢生芽。其中所述的表面滅菌方法為將露體栽培 的菊花帶腋芽莖段先在70%酒精浸泡30s后，用無菌水沖洗至少一次，再用0. 升汞消毒 1 2次，每次升汞消毒后無菌水沖洗至少一次。(2)誘導胚性愈傷組織從步驟1)中獲得的叢生芽中切取節間或者葉片，接種到 以MS為基本培養基，添加了激動素KT 1.0 2.011^/1、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-0 2. Omg/L、 萘乙酸NAA 0.5 1. 0mg/L，質量分數為0. 75%的瓊脂、質量分數為3%的蔗糖，pH 6. 0的 胚性愈傷組織誘導培養基上誘導胚性愈傷組織。優選的胚性愈傷組織誘導培養基為以MS 為基本培養基，添加了激動素KT 2.011^/1、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-0 2. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5mg/L，質量分數為0. 75%的瓊脂、質量分數為3%的蔗糖，pH 6. 0的培養基。(3)誘導胚性愈傷組織的分化通過步驟2)獲得的黃綠色致密顆粒狀胚性愈傷 組織后轉入以MS為基本培養基，添加了激動素KT 1. 0 2. 0mg/L,2,4- 二氯苯氧乙酸2， 4-D 1. 0mg/L、萘乙酸ΝΑΑ0. 5 1. 0mg/L，質量分數為0. 75%的瓊脂、質量分數為3%的蔗 糖，pH6. 0的胚性愈傷組織分化培養基一中培養15d，再轉接入以MS為基本培養基，添加了 激動素KT 1. 0 2. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5 1. 0mg/L、質量分數為0. 75%的瓊脂、質量分 數為3%的蔗糖，pH 6. 0的胚性愈傷組織分化培養基二上培養20d，誘導菊花間接體細胞胚 分化和由之再生成小植株。優選的胚性愈傷組織分化培養基一為以MS為基本培養基，添 加了激動素KT2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5mg/L，質量分數 為0.75%的瓊脂、質量分數為3%的蔗糖，pH 6.0的培養基。優選的胚性愈傷組織分化培 養基二為以MS為基本培養基，添加了激動素KT2. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5mg/L，質量分數為0. 75%的瓊脂、質量分數為3%的蔗糖，pH 6. 0的培養基。(4)移栽間接體細胞胚再生植株將步驟3)獲得的再生植株接種到添加了 0. Img/ L的萘乙酸NAA、質量分數為0.75%的瓊脂、質量分數為3%的蔗糖，pH 6.0的1/2MS基本培 養基上，進行生根培養，待不定根長至1. Ocm 2. Ocm時，進行試管苗的煉苗和移栽。所述 移栽包括取出試管苗，用清水洗凈試管苗的根系后，移栽入由消毒泥炭與珍珠巖混合1 1 的基質中培養，即得到菊花通過間接體細胞胚發生途徑形成的再生植株。本發明還提供一種誘導菊花體細胞胚間接發生的方法在菊花良種繁育和基因工 程培育新品種中的應用。本發明菊花間接體細胞胚發生的方法體系穩定，操作較易，胚性愈傷組織誘導率 胚性愈傷組織誘導率達83.0%以上，胚性愈傷組織分化率和形成的再生植株的再生頻率達 90%以上，平均每外植體分化的芽數達17個以上，增殖系數達10倍以上。同時通過在7個 地被菊品種、2個切花菊品種、3個茶用菊品種的試驗驗證，本發明菊花間接體細胞胚發生 的方法較有效地克服了基因型依賴的弊端。1節間外植體誘導的體細胞胚數最高的為24 個，1個葉盤外植體誘導的體細胞胚數最高的為13個。同時菊花間接體細胞胚發生過程中 可清晰地觀察到球形胚、魚雷形胚、心形胚、子葉胚階段。獲得的再生苗生根容易，健壯抗 逆，抗病蟲能力強，成本比常規低50%以上，且開花整齊，花質量提高1 2個等級，栽培管 理較容易。另外，經過間接體細胞胚發生途徑獲得的再生植株的穩定性為99%以上，與菊花 扦插繁殖的幼苗相比，在株高、冠幅、葉片長度上顯著優于菊花扦插繁殖苗，而在花期、開花 直徑上則無差異，說明經過間接體細胞胚發生途徑獲得的再生植株的穩定性強。通過間接 體細胞胚發生途徑獲得的再生植株，與傳統的菊花生產中采用分株、扦插等無性繁殖方法 相比，具有抗病蟲性強、生長勢旺、提純復壯等優點；與菊花的器官發生途徑形成的植株相 比，繁殖速度快，降低了成本，且穩定性好。因此，在現代化的菊花生產中，該方法及由該方 法獲得的再生植株提高了菊花生產的科技含量，降低了生產成本，保持了優良品種的遺傳 穩定性，因此，具有較強的競爭力，對實現菊花的規范化種植，為菊花的現代化生產得到高 產、優質、穩定的菊花產品起到關鍵性的作用，具有較好的市場應用前景，將取得較好的經 濟效益和社會效益。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1將露地栽培的菊花品種‘玉人面’、‘鋪地金’、‘紫研’(均可市售)的帶腋芽莖段在 自來水下沖洗干凈后，先用70%酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，再用0. 升汞消毒3min， 用無菌水沖洗6次，升汞消毒重復2次。將消毒好的帶腋芽莖段接種到誘導分化培養基 (MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0. lmg/L, pH 6. 0)上，4周后這三個品種每外植體可增殖4 6個 無菌叢生芽，其間和其后用同樣培養基繼代。實施例2按照實施例1的方法進行培養，切取培養20d左右的幼苗3 5mm的節間為外植體或從上述幼苗上切取嫩葉，并去除葉緣，切成約0. 5cm2的葉片為外植體。培養條件為日 光燈光源，每天連續光照12h，光照強度為2000 30001x，培養溫度(25士 1) °C。將上述節 間接種在胚性愈傷組織誘導培養基上；將上述葉盤以近軸面接種在胚性愈傷組織誘導培養 基上。胚性愈傷組織誘導培養基為MS+蔗糖3% +瓊脂0. 75% +KT 2. Omg/L+2,4-D2. Omg/ L+NAAO. 5mg/L(pH 6. 0)上，誘導15d，這三個品種的胚性愈傷組織誘導率為92. 8 95. 3%0 培養條件同前。實施例3同實施例2，其中不同之處在于使用的胚性愈傷組織誘導培養基為MS+蔗糖3% + 瓊脂 0. 75% +KTl. Omg/L+2,4-D 2. Omg/L+NAAl. 0mg/L(pH 6. 0)，這三個品種的胚性愈傷組 織的誘導率為80. 4 83.5%。培養條件同前。實施例4將實施例2或3獲得的黃綠色致密顆粒狀胚性愈傷組織后轉入胚性愈傷組織分化 培養基一 (MS+ 蔗糖 3% + 瓊脂 0. 75% +KT2. Omg/L+2,4-D 1. 0mg/L+NAA0. 5mg/L, pH 6. 0) 中，誘導15d后，再轉入分化培養基二(MS+蔗糖3% +瓊脂0. 75% +KT2. 0mg/L+NAA0. 5mg/ L，pH 6.0)中培養20d，胚性愈傷組織分化率為92.7%，體細胞胚發生形成的再生植株的再 生頻率為91. 5%，平均每外植體分化的芽數為18. 8個。節間或葉片外植體經過50天培養 后，通過間接體細胞胚途徑獲得的三個品種的再生植株的增殖系數達17倍。培養條件同
、r -刖。實施例5同實施例4，不同之處在于所使用的胚性愈傷組織分化培養基一為MS+蔗糖3% + 瓊脂 0. 75% +KTl. Omg/L+2,4-D 1. 0mg/L+NAAl. 0mg/L, pH 6. 0 ；胚性愈傷組織組織分化培 養基二為MS+蔗糖3% +瓊脂0. 75% +KTl. Omg/L+NAAl. 0mg/L, pH 6. 0，獲得的胚性愈傷 組織分化率為91%，體細胞胚發生形成的再生植株的頻率為90. 5，平均每外植體的芽數為 17. 4個，節間或葉片外植體經過50天培養后，通過間接體細胞胚途徑獲得的這三個品種的 再生植株的增殖系數達15倍。培養條件同前。實施例6當培養50d后獲得的通過間接體細胞胚途徑獲得的再生植株達1 2cm長時移至 生根培養基上進行生根培養，生根培養基是1/2MS+蔗糖3% +瓊脂0. 75% +ΝΑΑ0. lmg/L(pH 6.0)。培養條件同前。大約1周后下部形成根，2周后生根率達100%，且生根數量多，根 系粗壯。3周后當再生苗長至6 8cm，具有4 5片葉，5 6條根，且生長健壯，莖粗、葉 大、色綠時，即可將試管苗進行適當煉苗，即將培養瓶拿出培養室，去掉封口膜，置于常溫下 煉苗3d。再從培養瓶中取出再生苗，用清水洗凈粘附在根系上的瓊脂，即可移栽入由消毒泥 炭與珍珠巖混合(1 1)的基質。基質先用水淋透，每天用噴霧器噴霧3 5次保證基質 潮濕和較高空氣濕度。2周左右移栽成活，移栽成活率為95%以上。
權利要求
一種誘導菊花體細胞胚間接發生的方法，其特征在于，包括如下步驟1)、獲得菊花無菌苗將表面滅菌的菊花帶腋芽莖段接種到以MS為基本培養基，添加了6 芐氨基嘌呤6 BA1.0mg/L、萘乙酸NAA0.1mg/L、質量分數為0.75％的瓊脂、質量分數為3％的蔗糖，pH6.0的培養基上，誘導叢生芽；2)從外植體誘導胚性愈傷組織從步驟1)獲得的無菌苗中切取外植體，接種到以MS為基本培養基，添加了激動素KT 1.0～2.0mg/L、2，4 二氯苯氧乙酸2，4 D 2.0mg/L、萘乙酸NAA 0.5～1.0mg/L，質量分數為0.75％的瓊脂、質量分數為3％的蔗糖，pH 6.0的胚性愈傷組織誘導培養基上，誘導胚性愈傷組織；3)誘導胚性愈傷組織的分化通過步驟2)獲得的黃綠色致密顆粒狀胚性愈傷組織后轉入以MS為基本培養基，添加了激動素KT1.0～2.0mg/L、2，4 二氯苯氧乙酸2，4 D 1.0mg/L、萘乙酸NAA 0.5～1.0mg/L，質量分數為0.75％的瓊脂、質量分數為3％的蔗糖，pH 6.0的胚性愈傷組織分化培養基一上，再轉接入以MS為基本培養基，添加了激動素KT 1.0～2.0mg/L、萘乙酸NAA 0.5～1.0mg/L、質量分數為0.75％的瓊脂、質量分數為3％的蔗糖，pH 6.0的胚性愈傷組織分化培養基二上誘導菊花間接體細胞胚分化和由之再生成小植株；4)獲得體細胞胚再生植株將步驟3)獲得的再生植株接種到添加了0.1mg/L的萘乙酸NAA、質量分數為0.75％的瓊脂、質量分數為3％的蔗糖，pH 6.0的1/2MS基本培養基上，進行生根培養，不定根長至1.0cm～2.0cm進行煉苗和移栽。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚性愈傷組織誘導培養基為MS為 基本培養基，添加了激動素KT 2.011^/1、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-0 2. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5mg/L，質量分數為0. 75%的瓊脂、質量分數為3%的蔗糖，pH 6. 0。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚性愈傷組織分化培養基一為以MS 為基本培養基，添加了激動素KT 2.011^/1、2，4-二氯苯氧乙酸2，4-0 1. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5mg/L，質量分數為0. 75%的瓊脂、質量分數為3%的蔗糖，pH 6. 0。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚性愈傷組織分化培養基二為以MS 為基本培養基，添加了激動素KT 2. 0mg/L、萘乙酸NAA 0. 5mg/L、質量分數為0. 75 %的瓊 脂、質量分數為3%的蔗糖，pH 6.0。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中外植體在胚性愈傷組織誘 導培養基上培養的時間為15d。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中胚性愈傷組織在胚性愈 傷組織分化培養基一上培養的時間為15d，轉接到胚性愈傷組織分化培養基二上繼續培養 20d。
7.根據權利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述外植體為節間或葉盤。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中帶腋芽莖段的表面滅菌包 括先在70%酒精浸泡30s后，用無菌水沖洗至少一次，再用0. 升汞消毒1 2次，每次 升汞消毒后無菌水沖洗至少一次。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述移栽包括取出試管苗，用清水洗凈試 管苗的根系后，移栽入由消毒泥炭與珍珠巖混合1 1的基質中培養。
10.如權利要求1所述方法在菊花良種繁育和基因工程培育新品種中的應用。
全文摘要
本發明公開一種誘導菊花體細胞胚間接發生的方法，包括先從外植體中誘導出胚性愈傷組織，再將獲得的胚性愈傷組織連續轉接到兩個不同的培養基中誘導體細胞胚的間接分化，得到菊花穩定的再生植株，從而實現菊花的再生和快速繁殖，并以之為栽培材料，進行菊花的規范化、規模化生產。
文檔編號A01H4/00GK101983555SQ20101026721
公開日2011年3月9日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者張啟翔, 蔣細旺 申請人:北京林業大學;江漢大學