專利名稱：一種獸用t4溶菌酶預混劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于飼料添加劑領域，具體涉及制備一種含有來源于T4噬菌體的T4溶菌 酶預混劑。
背景技術：
我國幅員遼闊，人口眾多，近年來經濟發展迅速，人民生活水平逐步提高，對高質 量動物性蛋白產品需求量不斷上升，由此帶動了國內動物保健品行業的快速發展，國內食 品動物保健品市場已是繼美國之后的第二大市場。隨著中國陸續出臺各種食品安全措施，相對應的開發安全高效無毒動物飼料添加 劑類產品已經成為動物保健品行業的發展方向。溶菌酶是一種能有選擇性使對象微生物細 胞壁溶解，而對生物體本身有保護作用的酶類，并且具有廣譜高效殺菌、體內無殘留、環境 無污染的特性，近年來被廣泛研究。將溶菌酶用于動物飼料添加劑中以替代傳統的獸藥抗 生素產品，具有較高的經濟和社會效益。人們最早開始研究溶菌酶是從Nicoile 1907年發表枯草芽孢桿菌溶解因子的報 告開始；兩年以后Laschtschenko指出雞卵白強烈抑菌作用是酶的結果；1922年英國細 菌學家Fleming發現人的唾液、眼淚中存在能溶解細菌細胞壁的酶，因其具有溶菌作用，所 以命名為溶菌酶。后來人們逐漸在人和動物的多種組織、分泌物和植物、微生物也發現了溶 菌酶的存在。隨著對溶菌酶的研究不斷地深入發展，人們對其特性有了進一步的了解。溶菌酶是能溶解微生物細胞壁的一種酶，是一類物質的的總稱。根據其來源 以及作用機制不同可以分為動物源溶菌酶包括C型(chicken-lysozyme type)、G型 (goose-type)、I型(intertebrate-type)；植物源溶菌酶；微生物源溶菌酶包括N-乙酰 己糖胺酶、酰胺酶、內肽酶、β_1，3、1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、殼多糖酶；噬菌體Τ4溶菌 酶。溶菌酶來源不同其作用功效不同。噬菌體溶菌酶則是由各種能夠感染細菌細胞的噬菌體自身所編碼的，通常位于噬 菌體的蛋白衣殼內，在感染宿主細胞的過程中，它們在溶解細菌細胞壁方面起重要作用。Τ4 溶菌酶是由Τ4噬菌體在感染大腸桿菌Ε. coli時所產生的，它是迄今為止人們發現的殺菌 活性最高的一種溶菌酶。目前在飼料添加劑中使用的常用溶菌酶大都是采用化學法從雞蛋清中提取制備 的，但是由于生產規模和高成本限制，使其難以在飼料行業中大規模推廣。中國農業科學院 的劉德虎研究員發明的專利200610137767公開了一種構建表達高殺菌活力Τ4溶菌酶重組 蛋白基因工程酵母菌的方法。本發明所闡述的Τ4溶菌酶采用劉德虎研究員構建的基因工 程菌大規模發酵生產，大幅度降低了產品成本。并且由于其抑菌活性高，使用劑量低，在飼 料添加劑行業中應用前景廣闊。在本發明前，還未見有規模化制備來源于Τ4噬菌體的Τ4 溶菌酶的方法及相應的預混劑產品的報道。
發明內容
本發明描述的是一種含有來源于T4噬菌體的T4溶菌酶預混劑及其的制備方法。本發明包括以下兩個方面1.從發酵液中提取T4溶菌酶，發酵液經過板框過濾，過濾液上清經陶瓷膜超 濾，陶瓷膜過濾液經過中空纖維柱層析精濾，然后根據T4溶菌酶產品的分子量，優選 合適孔徑大小的有機納濾膜納濾濃縮，納濾液用陽離子交換樹脂層析精制純化，優選 CM-S印hadex-C25(實驗用)或AmberliteIRC-50 (工業規模，50 100目)陽離子交換 樹脂。離子交換液噴霧干燥制得酶粉，其噴霧干燥母液起始固含量為2-10%，進風溫度為 80-180°C，出風溫度為40-80°C，酶干粉蛋白殺菌活性能達到噴霧前固形物活性的95%。2.噴霧干燥制備的酶粉過60-120目篩，加入過80-120目篩玉米蛋白，脫脂豆粕 粉，麩皮，小麥次粉，同時加入膨潤土，沸石粉和CaCO3,高速混合均勻，制備含量為1-10%的 T4溶菌酶預混劑。本發明的優點是采用的溶菌酶來源于T4噬菌體，生產方式為發酵法規模化生產， 選用優化的提取工藝提取的T4溶菌酶純度高活性強，同時成本低，相對于現有來自于雞卵 清蛋白的溶菌酶產品，具有更大的實際應用價值和經濟效益。
具體實施例方式實施例1T4溶菌酶發酵液，板框過濾除去菌絲體，框過濾液用0. 1微米陶瓷膜超濾，優 選孔徑為50，000道爾頓的中空纖維柱層析精濾，根據T4溶菌酶產品的分子量，優選孔 徑為2500道爾頓的有機納濾膜納濾濃縮，納濾液用陽離子交換樹脂層析精制純化，優選 CM-Sephadex-C25陽離子交換樹脂。離子交換液噴霧干燥制得酶粉，其噴霧干燥母液起始固 含量為4%，進風溫度為90°C，出風溫度為60°C。酶粉過60-120目篩，稱取62. 5g過篩物， 加入過80-120目篩的玉米蛋白350g和麩皮250g，同時加入膨潤土 50g，CaC03 200g，沸石 粉87. 5g，高速混合機混和均勻，制得T4溶菌酶預混劑(5% )。實施例2T4溶菌酶發酵液，板框過濾除去菌絲體，框過濾液用0. 2微米陶瓷膜超濾，優 選孔徑為25，000道爾頓的中空纖維柱層析精濾，根據T4溶菌酶產品的分子量，優選孔 徑為2500道爾頓的有機納濾膜納濾濃縮，納濾液用陽離子交換樹脂層析精制純化，優選 AmberliteIRC-50陽離子交換樹脂。離子交換液噴霧干燥制得酶粉，其噴霧干燥母液起始固 含量為8%，進風溫度為100°C，出風溫度為80°C。酶粉過60-120目篩，稱取118g過篩物， 加入過80-120目篩的玉米蛋白350g和麩皮200g，同時加入膨潤土 100g，CaC03 150g，沸石 粉82g，高速混合機混和均勻，制得T4溶菌酶預混劑(10% )。實施例3T4溶菌酶發酵液，板框過濾除去菌絲體，框過濾液用0. 1微米陶瓷膜超濾，優 選孔徑為25，000道爾頓的中空纖維柱層析精濾，根據T4溶菌酶產品的分子量，優選孔 徑為2500道爾頓的有機納濾膜納濾濃縮，納濾液用陽離子交換樹脂層析精制純化，優選 CM-Sephadex-C25陽離子交換樹脂。離子交換液噴霧干燥制得酶粉，其噴 干燥母液起始固 含量為6%，進風溫度為95°C，出風溫度為70°C。酶粉過60-120目篩，稱取56g過篩物，加入過80-120目篩的脫脂豆粕350g和小麥次粉250g，同時加入膨潤土 80g，CaCO3 200g，沸 石粉64g，高速混合機混和均勻，制得T4溶菌酶預混劑(5% )。實施例4T4溶菌酶發酵液，板框過濾除去菌絲體，框過濾液用0. 2微米陶瓷膜超濾，優 選孔徑為50，000道爾頓的中空纖維柱層析精濾，根據T4溶菌酶產品的分子量，優選孔 徑為2500道爾頓的有機納濾膜納濾濃縮，納濾液用陽離子交換樹脂層析精制純化，優選 AmberliteIRC-50陽離子交換樹脂。離子交換液噴霧干燥制得酶粉，其噴霧干燥母液起始固 含量為5%，進風溫度為95°C，出風溫度為75°C。酶粉過60-120目篩，稱取89g過篩物，加 入過80-120目篩的脫脂豆粕400g和小麥次粉250g，同時加入膨潤土 50g，CaCO3 150g，沸 石粉61g，高速混合機混和均勻，制得T4溶菌酶預混劑(8% )。實施例5應用實施例針對仔豬的試驗(1)實驗設計180頭30日齡仔豬(體重8. 5kg左右)，采取隨機單因子設計，分成三組，分別為 對照組(不添加溶菌酶)、試驗1組(每公斤飼料添加180mg雞卵清蛋白溶菌酶)、試驗2 組(每公斤飼料添加180mgT4溶菌酶)，每組三個重復，每個重復20頭仔豬。添加的雞卵清 蛋白溶菌酶制劑和T4溶菌酶制劑含量均為50萬U/g，每組3個重復，試驗期6周。組間、重 復組間體重不超過平均體重的5%。觀測各組腹瀉頭次數，并作記錄。出現腹瀉立刻治療。(2)結果與分析表1仔豬腹瀉情況
組別對照組試驗1組試驗2組平均腹瀉率(％)57. 52510由表1可以看出，試驗2組的平均腹瀉率較前兩組分別降低了 83%和60%。從以 上結果可以看出，斷奶仔豬中不添加任何抗生素或其他抗腹瀉的添加劑，腹瀉嚴重，在斷奶 仔豬日糧中添加溶菌酶較空白對照組可以有效控制腹瀉，但在同樣添加量的情況下添加T4 溶菌酶的抗腹瀉效果較雞卵清蛋白溶菌酶更優異。針對肉雞的試驗(1)實驗設計將試驗肉仔雞隨機分為三組，每組4個重復，每個重復200羽。對照組為日常飼糧 組，試驗1組是在日常飼糧組的基礎上添加雞卵清蛋白溶菌酶，試驗2組是在日常飼糧組的 基礎上添加T4溶菌酶。試驗周期為8周，前四周在試驗1組和2組中添加對應溶菌酶量為 60g ；后四周在試驗1組和2組中添加對應溶菌酶量為30g。添加的雞卵清蛋白溶菌酶制劑 和T4溶菌酶制劑含量均為50萬U/g。觀測各組日增重、日采食量、死亡率，并作記錄，組間、 重復組間體重不超過平均體重的5%。(2)結果與分析表2對肉仔雞生長性能的影響(1-4周)
項目平均日增重(g)日采食量(g)料重比死亡率(％ )對照組75. 9695. 711. 261. 83試驗1組76. 3195. 031. 2461. 49試驗2組80. 0195. 111. 1890. 79從表2可以看出1-4周在肉仔雞的飼料中添加溶菌酶可以提高肉仔雞的生產性 能，添加T4溶菌酶平均日增重較前兩者分別提高了 5. 3%和4.8%，料重比分別降低了 5. 6%和4. 6%，死亡率亦降低了 56. 8%和46. 9%，效果優于雞卵清蛋白溶菌酶。表3對肉仔雞生長性能的影響(5-8周) 從表3可以看出5-8周在肉仔雞飼料中添加T4溶菌酶可以達到良好的生產性能， 肉仔雞的料重比及死亡率都有明顯的改善，效果優于雞卵清蛋白溶菌酶。針對水產養殖的試驗(1)試驗設計選取平均體重為80g左右的試驗魚，分為3組，分別為對照組(不添加溶菌酶)、 試驗1組(每公斤飼料添加75mg雞卵清蛋白溶菌酶)、試驗2組(每公斤飼料添加75mgT4 溶菌酶)，添加的雞卵清蛋白溶菌酶制劑和T4溶菌酶制劑含量均為50萬U/g，每組設三個 重復組。組間、重復組間體重不超過平均體重的5%。試驗期30天，在室內水箱中進行，控 制水溫在25-30°C, pH6. 8-7. 2之間。(2)結果與分析表4對試驗魚(鯉魚)生長性能的影響 由表4可知，添加T4溶菌酶組試驗魚的增重率和餌料系數顯著優于對照組和添加雞蛋清蛋白溶菌酶，較對照組和雞蛋清蛋白溶菌酶組餌料系數分別下降了 27. 4%和 9. 7%。
權利要求
一種制備T4溶菌酶預混劑的方法，其特征是包括以下步驟A.從發酵液中分離提純T4溶菌酶，發酵液經過板框過濾，膜濃縮，陽離子交換樹脂精制純化，噴霧干燥，制得原始酶粉；其噴霧干燥母液起始固含量為2 10％，優選8％；進風溫度為80 180℃，優選90℃；出風溫度為40 80℃，優選60℃；噴霧干燥溶菌酶粉含量為70％ 90％，并過60 120目篩。B.在上述T4溶菌酶酶粉中加入過80 120目篩的輔料，混合機高速混合均勻，制備成T4溶菌酶預混劑。
2.按權利要求1所述的制備T4溶菌酶預混劑的方法，其特征是所述的輔料包括玉米 蛋白(添加量為200-500g/kg預混劑)，脫脂豆粕粉(添加量為200-500g/kg預混劑)，麩 皮(添加量為200-500g/kg預混劑)，小麥次粉(添加量為200-500g/kg預混劑)，膨潤土 (添加量為10-100g/kg預混劑)，CaC03 (添加量為100-300g/kg預混劑)，沸石粉(添加量 為50-200g/kg預混劑)。
3.根據權利要求1-2中任意一項所述的制備的T4溶菌酶預混劑，其特征是制備含量為 1-10%的T4溶菌酶預混劑。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的制備的T4溶菌酶預混劑，其特征是制備含量優 選為5%的T4溶菌酶預混劑。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的T4溶菌酶預混劑，其特征是其使用的對象為各 種畜禽類及水產養殖類。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的T4溶菌酶預混劑，其特征是其使用的對象優選 為仔豬，肉雞。
7.根據權利要求6所述，T4溶菌酶在飼料中的添加量為50-500mg/kg飼料，其中在仔 豬中添加量優先為180mg/kg飼料，在雞中添加量優選為60mg/kg飼料，在淡水魚類中添加 量優先為75mg/kg飼料。
全文摘要
本發明屬于飼料添加劑領域，具體涉及制備一種含有來源于T4噬菌體的T4溶菌酶的預混劑。本發明以來源于T4噬菌體的T4溶菌酶替代傳統的獸用抗生素，制備含有T4溶菌酶的抗菌促生長類飼料預混劑。所涉及的T4溶菌酶原液經過離心去雜質，膜濃縮，陽離子交換樹脂精制純化，低溫噴霧干燥法制備蛋白酶粉，酶粉過篩，加入輔料，混合機高速混合均勻后制備得到T4溶菌酶預混劑制劑。添加的輔料包括豆粕粉，麩皮，小麥粉，小麥次粉，膨潤土，CaCO3，沸石粉。實驗結果表明，含有T4溶菌酶的預混劑治療仔豬腹瀉病效果明顯優于含有來源于雞卵清蛋白的溶菌酶預混劑；對肉雞和鯉魚的飼喂試驗結果則表明，在增重效果和提高飼料利用率上，含有T4溶菌酶的預混劑稍優于含有來源于雞卵清蛋白溶菌酶的預混劑。
文檔編號A23K1/165GK101912048SQ20101025275
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月13日 優先權日2010年8月13日
發明者余志強, 吳家鑫, 宋敏, 張國棟, 曹芹, 王華麗, 葛辛玫, 蔡健, 鄭應華, 齊鵬 申請人:中牧實業股份有限公司