專利名稱：一種抗菌劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于衛生學領域，涉及一種抗菌劑，具體涉及一種生物-化學復合抗菌劑。
背景技術：
抗菌劑(anti-bacterial means)指能夠在一定時間內，使某些微生物(細菌、真 菌、酵母菌、藻類及病毒等)的生長或繁殖保持在必要水平以下的物質，具有抑菌和殺菌功 能。傳統的抗菌劑采用化學物質作為有效成分，但是這種抗菌劑容易使細菌產生抗性，負面 影響較大。陸續被應用于臨床，并已成為應用最多，最廣泛的廣譜抗菌素了。但在1956年， 有人發現了四環素會使牙齒變色的副作用，隨后還發現了它甚至會使指甲和鞏膜變色。而 在我國直至70年代中期才引起重視。現在已有大量資料證實，長期使用四環素，有可能 影響牙齒的發育和形成，引起牙釉質發育不良(牙齒表面不光滑，出現小凹陷)或牙齒畸 形。據國內的調查報告，四環素引起的乳牙變色發病率為49. 40%，恒牙的發病率則高達 75. 63%。除此，由于四環素的大量使用，目前常見致病菌對四環素類耐藥現象嚴重，僅在病 原菌對本品呈現敏感時，方有指征選用該類藥物。由于溶血性鏈球菌多對本品呈現耐藥，四 環素不宜用于該類菌所致感染的治療，也不宜用于治療溶血性鏈球菌感染和任何類型的葡 萄球菌感染。生物抗菌劑是近年來問世的一種新型抗菌劑，與傳統的抗菌劑不同，其利用生物 作為抗菌活性成分。如一種防治枯萎病的生物抗菌劑，是采用從農作物的根際土壤中篩選 出的功能細菌，能廣譜抑制各種農作物病原真菌，防治枯萎性病害防治效果達75%左右，能 基本控制枯萎性病害的發生。生物抗菌劑具有生物農藥高效、低毒、低殘留、與環境相容性 好的特點。但是，目前的生物抗菌劑的種類非常有限，使用對抗的病原菌僅為一小部分，生 物抗菌劑作為一種較為安全和環保的抗菌劑，善待進一步研究和開發。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供了一種抗菌劑，為一種新型的生 物_化學復合抗菌，可以有效抑制和殺滅有害病菌，同時使用安全可靠。發明通過以下技術方案實現上述目的發明提供了一種抗菌劑，由以下有效成分構成四環素和枯草芽孢桿菌。在該抗菌劑中，四環素和枯草芽孢桿菌的含量比例為0. 18 6. Oyg 2.0 6.0X106cfu。可以使用以下濃度的抗菌劑，直接應用于滅菌處理四環素在抗菌劑中的含 量為0. 18 6. 0μ g/g ；枯草芽孢桿菌在抗菌劑中的含量為2. 0 6. 0X106cfu/g。利用這種抗菌劑，可以應用于抑制和殺滅金黃色葡萄球菌、弧菌、大腸埃希菌、沙 門氏菌、變形菌屬細菌、鐮刀菌等。抗菌劑可以根據需要，添加輔料水、增稠劑或填充劑等，制備成為外用藥膏、外用液體藥劑、口服藥片、口服液、消毒劑、清潔劑或水質改良劑等。本發明所提供的抗菌劑不僅可以用于對抗四環素敏感型的細菌，還可以用于對抗 金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)是人類的一種重 要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，可引起多種嚴重感染，有“嗜肉菌"的別 稱。雖然現有的研究認為四環素不宜用于葡萄球菌感染，但是本發明將低劑量的四環素與 枯草芽孢桿菌復合使用，發現枯草芽孢桿菌的加入可以大大降低四環素的有效閾值，達到 非常明顯的抗菌效果。通過對抗菌劑機理的研究發現，該抗菌劑顯著的抗菌效果來源于枯草芽孢桿菌對 細菌生物膜形成的抑制和抗生物的四環素的協同性殺菌作用。本發明發現，枯草芽孢桿菌 可以降解細菌群體感應信號，及其抑制細菌生物膜形成。試驗表明枯草芽孢桿菌可降解具 群體感應細菌的信號分子，干擾細菌的群體感應系統，從而使細菌無法有效啟動群體感應 相關基因的表達和調控其生理生化特性(如生物膜的形成和致病因子的表達)，因而降低 了致病活性，并提高了宿主免疫系統。該抗菌劑可以用于防治具群體感應細菌引起的動物的體內、外微生物感染，或者 對養殖水體相關細菌的抑制，或者對植物的相關病原菌的防治。用枯草芽孢桿菌制備的藥 物用于防治細菌引起的各種健康問題，包括腸道細菌感染、人和動物的其它細菌感染、防治 植物的病原菌，還可以調節機體腸道微生態，促進消化和機體生長，改善水產養殖環境。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果1.本發明所提供的抗菌劑首次應用了枯草芽孢桿菌抑制細菌群體感應分子的功 能，與四環素配合產生協同作用，大大提高了抗菌劑殺滅細菌的能力。2.本發明所提供的抗菌劑顯著降低了四環素的有效劑量閾值，避免抗菌過程中的 耐藥性問題。3.本發明所提供的抗菌劑在達到有效抗菌效果的同時，對環境負面影響小，毒副 作用小。4.本發明提供的抗菌劑，使用安全，且其生產成本非常低廉，適于推廣使用。5.本發明將有利于研究具群體感應細菌的生物防控，探討防治具群體感應細菌的 新技術。6.本發明有利于從機制方面解決具群體感應細菌由于大量使用抗生素而產生的 耐藥性問題，發展非抗菌素類為主的致病菌生態防控新技術。
具體實施例方式以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案。實施例1枯草芽孢桿菌的篩選、分離和純化2216E平板30度培養2_3天，多次劃線分離和純化，接種斜面，4度保存備用。實施例2枯草芽孢桿菌降解細菌信號分子的初篩實驗初篩實驗使用信號分子為OOHL分子，指示菌為WCF47。96孔板初篩
1)從平板挑取待測菌，在96孔培養板A中用相應液體培養基200 μ 1培養至生長 對數晚期，設立陰性對照(LB+AHL)和陽性對照(Bt+AHL)。2)向96孔培養板B的每個孔中加入100μ 1匪液體培養基，0. 2 μ 1信號分子 AHL (lmg/ml)，用移液槍從96孔培養板A取待測菌100 μ 1到96孔培養板B對應的孔中，混 勻。30°C共培養4hr。3)向96孔培養板C的每個孔中加入130 μ 1匪液體培養基，20 μ 1指示菌WCF47 菌液，1 μ 1 X-Gal。用移液槍從96孔培養板B取共培養物50 μ 1到96孔培養板C對應的 孔中，混勻。4)30°C過夜培養。在16hr左右可以觀察結果。實驗結果信號分子被降解后，指示菌落呈白色，否則呈藍色。根據顏色反應，初步 篩出具有降解信號分子AHL的枯草芽孢桿菌微生物菌株。實施例3枯草芽孢桿菌降解細菌信號分子的復篩實驗瓊脂條復篩將涂有X-gal的MM培養基平板切成條狀，在細條一測加入待測菌與AHLs抽提物 的混合物，在另一測依次加指示菌WCF47，30°C培養18h后觀察實驗結果。LB或ddH20和AHL 的混合物作為陰性對照，以AiiA活性菌B. thuringiensis培養物與AHL的混合物為陽性對 照。實驗結果根據顏色反應，陰性對照呈藍色，陽性對照和枯草芽孢桿菌呈白色，表 明枯草芽孢桿菌具有降解AHLs信號分子的活性。實施例4枯草芽孢桿菌抑制溶藻弧菌和鰻弧菌生物膜形成的實驗在2ml塑料離心管中分別加入975 μ 1過夜培養的溶藻弧菌和鰻弧菌菌液，25 μ 1 40%的甘油，1μ1(105)的枯草芽孢桿菌。以不加枯草芽孢桿菌的處理作為陰性對照。37°C 靜置培養3天。小心傾去離心管中的液體，用滅菌的蒸餾水輕輕沖洗離心管數次，確保沖洗 掉離心管內游離的細菌。等離心管內壁的水珠蒸發后，加入Iml 0.5%的結晶紫溶液，室溫 靜置30分鐘。將結晶紫倒掉，用滅菌的蒸餾水輕輕沖洗離心管數次，確保沒有吸附在生物 膜上的結晶紫被沖掉。待離心管內壁水珠蒸發后，加入Iml 95%乙醇，室溫靜置15分鐘。 最后將離心管內乙醇倒入比色皿內，在分光光度計中以570nm波長測OD值。OD值越低，說 明溶藻弧菌和鰻弧菌形成的生物膜越少。實驗結果表明枯草芽孢桿菌在IO5濃度即可抑制溶藻弧菌和鰻弧菌生物膜的形 成。但不直接抑制溶藻弧菌和鰻弧菌的生長，表明抑制作用可能是通過抑制細菌的群體感 應系統達到的。實施例5枯草芽孢桿菌抑制銅綠假單胞菌生物膜的實驗在2ml塑料離心管中加入975 μ 1過夜培養的綠膿桿菌菌液，25 μ 1 40%的甘油， μ IO6的枯草芽孢桿菌。以不加枯草芽孢桿菌的處理作為陰性對照。37°C靜置培養3 天。小心傾去離心管中的液體，用滅菌的蒸餾水輕輕沖洗離心管數次，確保沖洗掉離心管 內游離的細菌。等離心管內壁的水珠蒸發后，加入ImlO. 5%的結晶紫溶液，室溫靜置30分鐘。將結晶紫倒掉，用滅菌的蒸餾水輕輕沖洗離心管數次，確保沒有吸附在生物膜上的結晶 紫被沖掉。待離心管內壁水珠蒸發后，加入Iml 95%乙醇，室溫靜置15分鐘。最后將離心 管內乙醇倒入比色皿內，在分光光度計中以570nm波長測OD值。OD值越低，說明銅綠假單 胞菌形成的生物膜越少。實驗結果表明枯草芽孢桿菌在IO6濃度即可抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，但 不直接抑制銅綠假單胞菌的生長，表明枯草芽孢桿菌可能干擾了細菌的群體感應系統而抑 制生物膜的形成。實施例6抗菌劑的制備將枯草芽孢桿菌菌液和四環素加水混合成為抗菌劑，枯草芽孢桿 菌在抗菌劑中的含量為4. OX 106CfU/ml，四環素的質量分數為0. 36μ g/ml。抗菌試驗設置實驗組(抗菌劑)、對照組1 (四環素)，將實驗組和對照組分別加入等體積金 黃色葡萄球菌菌液中，在37°C培養16小時。實驗結果表明對照組1四環素對金黃葡萄球菌的最低致死量是4 μ g/ml,當菌液 中加入枯草芽孢桿菌培養上清液時(實驗組)，四環素的最低致死量降低到0. 18 μ g/ml以 下。實驗結果顯示，枯草芽孢桿菌和抗生素有聯合作用，枯草芽孢桿菌和四環素等抗 生素同時作用于耐抗生素的金黃葡萄球菌的殺菌效果明顯優越于單獨使用四環素等抗生 素的效果。表明在枯草芽孢桿菌的存在下致病菌因失去生物膜的保護而對抗生素的耐受能 力大大降低。實施例7枯草芽孢桿菌降解群體感應受體蛋白TraR的實驗TraR蛋白是根農桿菌群體感應系統信號分子的受體蛋白，與綠膿桿菌的LasR蛋 白同屬LuxR蛋白家族，它們活性位點區域的同源性高達70%，因此，對TraR蛋白起作用的 抑制劑往往也會對LasR蛋白有抑制作用。LuxR蛋白在群體感應抑制劑如鹵化呋喃酮的作 用下，變得極不穩定，會在短時間(約30分鐘)內被細菌自身的蛋白酶迅速水解掉，導致 LuxR蛋白的濃度下降。因此，通過檢測LuxR蛋白與抑制劑作用后的濃度是否下降，可知抑 制劑是否有抑制活性，以及抑制活性的高低。用PCR的方法獲得TraR蛋白的基因trar。將該基因片斷用雙酶切的方法插入表 達載體PET-17b中構建pETtrar質粒，再將該質粒用鈣轉方法轉化到大腸桿菌BL21中，最 后獲得高效表達TraR蛋白的工程菌。該工程菌用IPTG誘導4個小時后，離心收集菌體，再 用無菌水重懸細菌，加入枯草芽孢桿菌培養的粗提抗菌液，37°C培養35分鐘。最后用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測菌體TraR蛋白濃度。實驗結果表明，枯草芽孢桿菌在35分鐘內即可明顯降低群體感應受體蛋白TraR 的濃度。TraR濃度降低后，將無法有效啟動群體感應相關基因的表達(如生物膜的形成和 致病因子的表達)，因而降低了致病活性。該實驗從分子水平證明了枯草芽孢桿菌是一個有 效潛在的群體感應抑制劑。實施例8抗菌劑的制備將枯草芽孢桿菌菌液和四環素加水混合成為抗菌劑，枯草芽孢桿菌在抗菌劑中的含量為4. OX 106CfU/ml，四環素的質量分數為0. 72μ g/ml。抗菌試驗設置實驗組(抗菌劑)和對照組(四環素)，將實驗組和對照組分別加入等體積大 腸埃希菌菌液中，在37°C培養14小時。實驗結果表明對照組四環素對大腸埃希菌的最低抑菌濃度6 μ g/ml，當菌液中 加入枯草芽孢桿菌培養上清液時(實驗組)，四環素的最低抑菌濃度0. 36 μ g/ml以下。實驗結果顯示，枯草芽孢桿菌和抗生素有聯合作用，枯草芽孢桿菌和四環素等抗 生素同時作用于耐抗生素的大腸埃希菌的殺菌效果明顯優越于單獨使用四環素等抗生素 的效果。表明在枯草芽孢桿菌的存在下致病菌因失去生物膜的保護而對抗生素的耐受能力 大大降低。實施例9抗菌劑的制備將枯草芽孢桿菌菌液和四環素加水混合成為抗菌劑，枯草芽孢桿 菌在抗菌劑中的含量為4. OX IO6CfVml，四環素的質量分數為0. 64 μ g/ml。抗菌試驗設置實驗組(抗菌劑)和對照組(四環素)，將實驗組和對照組分別加入等體積副 溶血弧菌菌液中，在28°C培養18小時。實驗結果表明對照組四環素對副溶血弧菌的最低抑菌濃度5 μ g/ml，當菌液中 加入枯草芽孢桿菌培養上清液時(實驗組)，四環素的最低抑菌濃度0. 32 μ g/ml以下。實驗結果顯示，枯草芽孢桿菌和抗生素有聯合作用，枯草芽孢桿菌和四環素等抗 生素同時作用于耐抗生素的副溶血弧菌的殺菌效果明顯優越于單獨使用四環素等抗生素 的效果。表明在枯草芽孢桿菌的存在下致病菌因失去生物膜的保護而對抗生素的耐受能力 大大降低。實施例10抗菌劑的制備將枯草芽孢桿菌菌液和四環素加水混合成為抗菌劑，枯草芽孢桿 菌在抗菌劑中的含量為4. OX 106CfU/ml，四環素的質量分數為0. 8 μ g/ml。抗菌試驗將抗菌劑加入等量金黃色葡萄球菌菌液中，在37°C培養16小時。抗菌 劑的抑菌率達100%。實施例11抗菌劑的制備將枯草芽孢桿菌菌液和四環素加水混合成為抗菌劑，枯草芽孢桿 菌在抗菌劑中的含量為8. OX 106CfU/ml，四環素的質量分數為9 μ g/ml。抗菌試驗將抗菌劑加入等量金黃色葡萄球菌菌液中，在37°C培養16小時。抗菌 劑的抑菌率達100%。實施例12抗菌劑的制備將枯草芽孢桿菌菌液和四環素加水混合成為抗菌劑，枯草芽孢桿 菌在抗菌劑中的含量為12X 106CfU/ml，四環素的質量分數為4 μ g/ml。抗菌試驗將抗菌劑加入等量金黃色葡萄球菌菌液中，在37°C培養16小時抗菌劑 的抑菌率達100%。
權利要求
一種抗菌劑，其特征在于由以下有效成分構成四環素和枯草芽孢桿菌。
2.如權利要求1所述的抗菌劑，其特征在于所述的四環素和枯草芽孢桿菌的含量比例 為 0.18 6. Oyg 2. 0 6. OX IO6Cfu。
3.如權利要求1所述的抗菌劑，其特征在于所述的四環素在抗菌劑中的含量為0.18 6. 0 μ g/g ；枯草芽孢桿菌在抗菌劑中的含量為2. 0 6. OX 106cfu/g。
4.如權利要求1所屬的抗菌劑，其特征在于抗菌劑應用于抑制和殺滅金黃色葡萄球 菌、弧菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、變形菌屬細菌、鐮刀菌等。
5.如權利要求1所述的抗菌劑，其特征在于所述的抗菌劑為外用藥膏、外用液體藥劑、 口服藥片、口服液、消毒劑、清潔劑或水質改良劑。
6.如權利要求1所述的抗菌劑，其特征在于所屬的抗菌劑還含有輔料，輔料是水、增稠 劑或填充劑。
全文摘要
本發明屬于衛生學領域，涉及一種抗菌劑，由以下有效成分構成四環素和枯草芽孢桿菌。抗菌劑中四環素和枯草芽孢桿菌的含量比例為0.18～6.0μg∶2.0～6.0×106cfu，可以應用于抑制和殺滅金黃色葡萄球菌、弧菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、變形菌屬細菌、鐮刀菌等。本發明所提供的抗菌劑首次應用了枯草芽孢桿菌抑制細菌群體感應分子的功能，與四環素配合產生協同作用，大大提高了抗菌劑殺滅細菌的能力；該抗菌劑顯著降低了四環素的有效劑量閾值，避免抗菌過程中的耐藥性問題；在達到有效抗菌效果的同時，對環境負面影響小，毒副作用小。
文檔編號A01P1/00GK101926830SQ20101025040
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月10日 優先權日2010年8月10日
發明者丁賢, 周世寧, 殷波, 江世貴 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所