專利名稱：紫外光照射提高靈芝鈣強化劑中維生素d含量的方法
技術領域：
本發明涉及補鈣食品與醫藥產品，更具體地說是涉及一種紫外光照射提高靈芝鈣 強化劑中維生D含量的方法，具體方法是通過紫外光源照射液態發酵靈芝菌，使細胞內麥 角固醇光轉化為維生素D2。可用于制備預防和治療兒童、婦女缺鈣；老人骨質疏松等各種 病癥的藥品或保健食品中的應用。
背景技術：
中國專利公開了一種名稱為“靈芝生物活性多維強化劑的制備方法”(申請號為 03106293. 8)的專利。利用藥用真菌靈芝菌為生物載體，經液態發酵可將無機鈣轉化成生 物大分子螯合態的活性鈣。產品含多種維生素、菌體免疫蛋白和菌體多糖，具有免疫調節功 能，從根本上提高了鈣的利用率。其缺陷是僅僅考慮了補鈣，沒有考慮促進機體對鈣的吸 收。補鈣產品如果同時補充維生素D，補鈣效果比單純補充鈣要好。已有確切的研究證明充 足的維生素D不僅可以促進機體對鈣的吸收率，而且可以降低心臟病、肥胖病、糖尿病、關 節炎甚至癌癥的發生。雖然食用藥用真菌是天然食物中維生素D的重要來源，但其含量遠 不能滿足人體對維生素D的需求。目前市場上鈣強化劑中的維生素D也是人為添加進去以 輔助鈣吸收，不具有生物同源性和平衡性。麥角固醇是一種植物留醇，該物質是維生素D的 前體，國內目前僅用于維生素D的工業生產。真菌細胞中含有豐富的麥角固醇，新加坡科學 家近年研究發現，用紫外線照射生長中或剛采摘的新鮮蘑菇，能使蘑菇中產生大量維生素 D2(Food Chemistry Volume 95, Issue 4, April 2006, Pages 638-643)。
發明內容
本發明的目的在于提供一種紫外光照射提高靈芝鈣強化劑中維生素D含量的方 法，本發明工藝簡單，操作方便，可廣泛用于兒童佝僂病、婦女缺鈣、老年人骨質疏松癥的預 防和治療。它是在以液態發酵靈芝菌為載體進行鈣強化的同時，用紫外光源對發酵菌液進 行照射，通過控制照射溫度和照射時間，使細胞內的麥角固醇光轉化為維生素D2，補鈣的同 時補充維生素D，以達到促進機體鈣吸收的目的。通過維生素D的促進，機體可以極大的提 高對鈣的吸收率和利用率。為了實現上述任務，本發明采用以下解決方案靈芝生物活性鈣強化劑使無機鈣轉化成大分子螯合態的生物活性鈣，提高了鈣在 機體的利用率，同時憑借靈芝中含有的氨基酸，多糖，留醇，維生素和微量元素發揮藥理活 性，補鈣的同時增強機體免疫力，調節消化系統和呼吸系統功能，抗衰老，抗腫瘤，同時具有 保健功能和藥物治療作用。維生素D是鈣的調節劑，它通過促進鈣結合蛋白的生成來促進小腸和腎對鈣的吸 收和重吸收。除此之外，維生素D還能降低心臟病、免疫缺陷病、糖尿病、關節炎和某些癌癥 的發病率。正常人皮膚中含有7-脫氫膽固醇，受日光中紫外線的照射即轉變為維生素D3, 植物中含有麥角固醇，不能被人體吸收，但經紫外線照射轉變為維生素仏才能被人類吸收。Io007] 本發明通過實驗證實紫外光照射對液態發酵靈芝菌細胞內麥角固醇的轉化能力，一種紫外光照射提高靈芝鈣強化劑中維生素D含量的方法，其步驟是[o008] a、配制如下培養基碳源包含2—8％(重量／體積百分比)的糖類如葡萄糖、蔗糖、糖蜜，或是淀粉類如谷類淀粉、玉米粉、紅薯粉的一種或六種以下任意組成；氮源包括l一4％(重量／體積百分比)的酵母粉、黃豆粉、花生餅粉、玉米漿的一種或四種以下任意組成；碳、氮比為lol一40l；每lOOml培養基中添加礦質元素如下[o009] 蛋白胨o．5—2．og
葡萄糖2．o—lo．og
酵母粉o．卜1．ogIoo]2] KH，P。．o．05一o．5gIoo]3] MgS()．o．02一o．2g
以FeS。。添加鐵o．OOl—o．1g
以ZnS。。添加鋅o．OOl—o．1g
以Na，Se。，添力口硒o．00000l—o．000lg
以CrCl，添加鉻o．00000l—o．000lg
以CaCl，、CaN。，或CaC。，添加鈣 o．ol—1．og[oo19] VB、o．ool—o．olg
添加水溶化后定容至lOOml；
以每瓶lOOml分裝300ml三角瓶，120℃滅菌30分鐘后冷卻至30℃以下；
b、向上述培步驟a養基中接種在在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號為CGMCC N。．5．535的靈芝(Gan。derma luCidum)菌株，在26—30℃條件下150rpm搖瓶培養80—120小時，獲得液體冬蟲夏草菌種；
C、向上述步驟a的培養基中接種2一lo％體積的液體靈芝菌種，在26—30℃條件下150rpm搖瓶培養80—120小時，取出發酵液；
d、選用UV—B紫外燈管，功率14w，波長為280—325nm。將紫外燈管安放在超淨工作臺上方距離樣品15Cm處。室溫為25℃時，將步驟C得到的培養好的靈芝菌液倒在大培養皿中，由于紫外線的穿透力有限，厚度為lCm，進行照射。照射時間為lh，照射完畢將菌絲體冷凍干燥，測得菌體得率為2％(2g凍干粉／lOOml發酵液)。
e、維生素D，的含量用高效液相色譜法測定(Drying TeChn。l。gy，2003，2l，1093—1101．)，色譜條件C18柱(250×4．6mm)；流動相乙腈一甲醇(7525)；流速lml／min；檢測波長282t皿。樣品要先經過皂化處理，取冬靈芝凍干粉lg，加抗壞血酸鈉(17．5g抗壞血酸溶于lOOml lM Na。H)4ml，乙醇50ml(95％)，50％K。H溶液loml在85℃水浴皂化lh后，迅速冷卻至室溫(20一25℃，以下相同)，移入分液漏斗。加入去離子水15ml，乙醇15ml，用戊烷萃取三次(50ml、50ml、20m1)。保留有機層，用K。H一乙醇溶液(3％K。H，5％乙醇，固體試劑是重量／體積百分比，液體試劑是體積／體積百分比)50ml洗三次，再用去離子水洗至中性。將有機層移至圓底燒瓶，用旋轉蒸發器在40℃下濃縮蒸干，迅速加5ml乙醇溶解。過o．45 u m有機濾膜，取濾液20 u l上高效液相進行分析。通過內標法和外標法定性分析維生素D，，通過峰面積進行量化計算樣品中維生素D，含量。
f、結果靈芝菌中維生素D，含量從照射前的30 u g／g(凍干粉)提高到照射后的4561^/^(凍干粉)。上述結果說明靈芝菌絲體經UV-B紫外燈照射1小時后，細胞內維生素D2含量有 顯著提高。機理是紫外線照射使麥角固醇吸收紫外線的輻射通過光化反應先轉化成維生素 D的中間體，最后再轉化成維生素D2。根據上述構思及實驗結果，實現本發明目的采用如下技術方案使用的微生物生產藥用成分的擔子菌綱靈芝屬(Ganoderma Karst.)的各種菌種。它們既不是 約束性的也不是排它性的。具體的菌株可以是在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號為CGMCC NO. 5. 535的靈芝 (Ganoderma lucidum)菌株。上述菌種的有關性質可以參閱中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)的菌種目 錄，本發明不再贅述。任何人可直接向該保藏中心購得菌種。選用的光源不同波長的照射光源對麥角固醇光轉化影響不同。短于280nm的光易于生成速甾 醇，而長于284nm的光容易生成光甾醇。具體選用波長為280 325nm的UV-B紫外光源， 能夠減少副產物的產生，功率14-60W，該類型紫外光源市場上均有銷售。提高靈芝生物活性鈣強化劑中維生素D的步驟是a、配制培養基以碳源、氮源、礦質元素等制備液體培養基，每IOOml培養基中添 加下列成份(重量/體積百分比)培養基中的碳源包含2 10%體積的糖類如葡萄糖、蔗糖、糖蜜，或是淀粉類如谷 類淀粉、玉米粉、紅薯粉的一種或六種以下任意組成；氮源包括1 4%體積的酵母粉、黃豆粉、花生餅粉、玉米漿的一種或五種以下任 意組成；碳、氮比為10 1 40 1 ；
礦質元素為鉀、鎂、磷、鈉、硫等物質
KH2PO40. 05-0. 5g
MgSO40. 02-0. 2g
以FeSO4添加鐵0. 001 0.Ig
以ZnSO4添加鋅0. 001 0.Ig
以Na2SeO3添加硒0.000001 0. OOOlg
以CrCl3添加鉻0. 000001 ^ 0. OOOlg
以 CaCl2、Ca (NO3) 2 或 CaCO3 添加鈣0. 01 1. OgVB10. 001-0. Olg添加水溶化后定容至IOOml ；將配制好的培養基滅菌，120°C滅菌30分鐘后冷卻至30°C以下；b、向上述步驟a的培養基中接種在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號 為 CGMCC NO. 5. 535 的靈芝(Ganoderma lucidum)菌株，在 26 30°C條件下 100_150rpm 搖 瓶培養80-120小時，獲得液體冬蟲夏草菌種；
5
C、向上述步驟a的培養基中加入2 10%體積的液體靈芝菌種，在20°C 30°C下 100-150rpm通氣攪拌培養60 120小時，取出發酵液；d、選用UV-B紫外光源，功率14-60W，波長為280 325nm。將靈芝菌發酵液倒在 大培養皿中，由于紫外線的穿透力有限，菌液厚度為0. 2 2cm，將紫外光源安放在距離培 養皿的正上方10 30cm處，在15-30°C的室溫下，對步驟c得到的發酵液進行照射，照射時 間確定在20min 60min。照射完畢將發酵液經濃縮、干燥，破壁粉碎成粉末狀產品。上述方法得到的靈芝生物活性鈣強化劑，維生素D含量為10 50mg/100g，達到強 化前的十倍以上。產品可以以飲料、口服液、咀嚼片、糖果、膠囊或其它劑型用于制備治療和預防兒 童佝僂病，兒童缺鈣；婦女缺鈣；老人免疫力衰退、骨質疏松等各種病癥的藥品或保健食品
中的應用。
每IOOg強化劑產品中含有其他組分(重量份)
菌體蛋白質15. 0 45. 0
總糖(包括菌體多糖) 2. 0 10. 0
碳水化合物20. 0 40. 0
總脂2. 0 10. 0
礦物質15. 0 25. 0
水分4. 0 10. 0
鈣2. 0 20. 0
鐵0. 1 1. 0
鋅0. 1 1. 0
硒0. 0005 0. 005
鉻0. 0005 0. 005
維生素A0. 001 0. 04
維生素Bl0. 02 0. 1
維生素B20. 02 0. 1
維生素B50. 2 0. 8
維生素B60. 01 0. 2
維生素B120. 0005 0. 001
維生素C0. 5 5. 0
維生素E0. 00001 0. 0001
葉酸0. 0001 0. 005
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果
生產工藝簡與 ，利用靈芝菌含有豐富維生素D前體的特性，采用廉價的紫外光源，使其在細胞內轉化為維生素D2，配以生物大分子螯合態的鈣，有利于提高產品的生物利用度，實現了真正意義上的生物活性鈣和維生素D。再加上靈芝特有的免疫調節藥理活性，使產品具備了多]重功效，可廣泛用于制備治療和預防兒童佝僂病，兒童缺鈣；婦女缺鈣；老人免疫力衰退、骨質疏松等各種病癥的藥品或保健食品中的應用。鈣的吸收率達到62. 5-76. 8%，利用率達到 41. 7-53. 5%0
具體實施例方式實施例1 采用的菌種CGMCCNO. 5. 535 的靈芝(Ganoderma lucidum)菌株a、配制液體培養基每IOOml培養基中添加下列成份(重量/體積百分比)添加水溶化后定容至IOOml ；120°C滅菌30分鐘后冷卻至30°C ；b、向上述步驟a的培養基中接種在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號 為 CGMCC NO. 5. 535 的靈芝(Ganoderma lucidum)菌株，在 26°C條件下 120rpm搖瓶培養 100 小時，獲得液體靈芝菌種；C、向上述步驟a的培養基中加入3%體積的液體靈芝菌種；在26°C條件下通氣攪 拌培養80小時，獲得靈芝發酵液；d、將步驟c得到的靈芝發酵液倒入大培養皿，厚度為0.5cm，在15°C的室溫下， 用功率14W的UV-B紫外光源(波長為280 325nm)照射，照射距離為15cm，照射時間為 20min。照射完畢將發酵液經濃縮、干燥，破壁粉碎成粉末狀產品，產品中維生素D含量達到 14mg/100g。產品中維生素D含量達到30mg/100g。測定產品中其他物質含量，每IOOg鈣強化劑中含有下列組分(重量份組成)表1. 一般分析成分士 25%蛋白質15總糖(包括菌體多糖)6總脂4碳水化合物30礦物質20水分6表2.礦物質蔗糖玉米粉黃豆粉酵母粉KH2PO4MgSO4以FeSO4添加鐵以ZnSO4添加鋅以 Na2SeO3 添加硒以CrCl3添加鉻以CaCO3添加鈣VB1
3. Og 3. Og 1.5g 0. Ig 0. 05g 0. 02g 0. Olg 0. Olg
0. 2g 0. 002g
0.00002g 0. 00002g
7
成分±25％
鈣lo
鐵0．5
鋅0．4
硒0．00l
鉻0．00l
表3．維生素
成分±25％
維生素A0．02[Ol 20] 維生素gl0．075
維生素B20．08[Ol 22] 維生素B51．0[Ol 23] 維生素B60．1
維生素g120．0008[Ol 25] 維生素C2．0
維生素E0．00008
葉酸0．003。[Ol 28] 實施例2[Ol 29] 采用的菌種CGMCC NO．5．535的靈芝(Ganoderma lucidum)菌株。
a1配制液體培養基每lOOml培養基中添加下列成份(重量／體積百分比)
蔗糖4．og[Ol 32] 玉米粉4．og[Ol 33] 黃豆粉2．og[Ol 34] 酵母粉0．2g
KH，P。。0．1g
MgSO+0．02g
以PeSO。添加鐵0．0lg
以ZnSO。添加鋅0．0lg[Ol 39] 以Na，S00，添加硒0．00002g[Ol 40] 以CrCl，添加鉻0．00002g
以CaCl，添加鈣0．3g
VB10．003g[Ol 43] 添加水溶化后定容至lOOml；
120℃滅菌30分鐘后冷卻至30℃；
b1向上述步驟a的培養基中接種在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏， 保藏號為CGMCC NO．5．535的靈芝(Ganoderma lucidum)菌株，在30~C條件下150rpm搖瓶培養100小時，獲得液體靈芝菌種；
C1向上述步驟a的培養基中加入5％體積的液體靈芝菌種；在30℃條件下通氣攪拌培養100小時，獲得靈芝發酵液；
d、將步驟c得到的靈芝發酵液倒入大培養皿，厚度為1.0cm，在25°C的室溫下， 用功率30W的UV-B紫外光源(波長為280 325nm)照射，照射距離為20cm，照射時間為 40min。照射完畢將發酵液經濃縮、干燥，破壁粉碎成粉末狀產品，產品中維生素D含量達到 32mg/100g。
0148]測定產品中其他物質含量，每IOOg鈣強化劑中含有下列組分(重量份組成)
0149]表1. 一般分析
0150]成分士％25
0151]蛋白質20
0152]總糖(包括菌體多糖)7
0153]總脂4
0154]碳水化合物30
0155]礦物質20
0156]水分6
0157]表2.礦物質
0158]成分士 25%
0159] 丐15
0160]鐵0. 5
0161]鋅0. 4
0162]硒0.001
0163]鉻0.001
0164]表3.維生素
0165]成分士 25%
0166]維生素A0.02
0167]維生素Bl0.075
0168]維生素B20.08
0169]維生素B51.0
0170]維生素B60.1
0171]維生素B120.0008
0172]維生素C3.0
0173]維生素E0.00008
0174]葉酸0.003
0175]實施例3:
0176]采用的菌種CGMCCNO. 5. 535 的靈芝(Ganoderma lucidum)菌株。
0177]a、配制液體培養基每IOOml培養基中添加下列成份(重量/體積百分比)
0178]蔗糖6. Og
0179]玉米粉4. Og
0180]黃豆粉2. Og
0181]酵母粉0. 3g
0182]KH2PO40. Ig
MgSO4
0. 02g 0. Olg 0. Olg以FeSO4添加鐵以ZnSO4添加鋅以 Na2SeO3 添加硒以CrCl3添加鉻
0.00002g 0.00002g以Ca (NO3)2 添加鈣VB1
0. 003g添加水溶化后定容至IOOml ；120°C滅菌30分鐘后冷卻至30°C ；b、向上述步驟a的培養基中接種在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號 為 CGMCC NO. 5. 535 的靈芝(Ganoderma lucidum)菌株，在 28°C條件下 150rpm搖瓶培養 120 小時，獲得液體靈芝菌種；c、向上述步驟a的培養基中加入8%體積的液體靈芝菌種；在28°C條件下通氣攪 拌培養120小時，獲得靈芝發酵液；d、將步驟c得到的靈芝發酵液倒入大培養皿，厚度為1.0cm，在30°C的室溫下， 用功率30W的UV-B紫外光源(波長為280 325nm)照射，照射距離為20cm，照射時間為 60min。照射完畢將發酵液經濃縮、干燥，破壁粉碎成粉末狀產品，產品中維生素D含量達到 48mg/100go測定產品中其他物質含量，每IOOg鈣強化劑中含有下列組分(重量份組成)表1. 一般分析成分士 25%蛋白質24總糖(包括菌體多糖)8總脂4碳水化合物30礦物質20水分6表2.礦物質成分士 25%鈣18鐵0. 5鋅0. 4硒0. 001鉻0.001表3.維生素成分士 25%維生素A0.02維生素Bl0.075維生素B20.08
10
維生素B51.0維生素B60.1維生素B120.0008維生素C4.0維生素E0. 00008葉酸0.003。
權利要求
一種紫外光照射提高靈芝鈣強化劑中維生素D含量的方法，其步驟是a、配制培養基以碳源、氮源、礦質元素等制備液體培養基，每100ml培養基中添加下列成份培養基中的碳源包含2～10％重量/體積百分比的糖類如葡萄糖、蔗糖、糖蜜，或是淀粉類如谷類淀粉、玉米粉、紅薯粉的一種或六種以下組成；氮源包括1～4％重量/體積百分比的酵母粉、黃豆粉、花生餅粉、玉米漿的一種或五種以下組成；碳、氮比為10∶1～40∶1；礦質元素為鉀、鎂、磷、鈉、硫等物質KH2PO40.05 0.5gMgSO4 0.02 0.2g以FeSO4添加鐵 0.001～0.1g以ZnSO4添加鋅 0.001～0.1g以Na2SeO3添加硒 0.000001～0.0001g以CrCl3添加鉻 0.000001～0.0001g以CaCl2、Ca(NO3)2或CaCO3添加鈣0.01～1.0g；VB1 0.001 0.01g；添加水溶化后定容至100ml；將配制好的培養基滅菌，120℃滅菌30分鐘后冷卻至30℃以下；b、向上述培養基中接種靈芝Ganoderma lucidum菌株，在26～30℃條件下100 150rpm搖瓶培養80 120小時，獲得液體冬蟲夏草菌種；c、向上述步驟(a)的培養基中加入2～10％體積百分比的液體靈芝菌種，在20℃～30℃下100 150rpm通氣攪拌培養60～120小時，取出發酵液；d、選用UV B紫外光源，功率14 60W，波長為280～325nm，將靈芝菌發酵液倒在大培養皿中，菌液厚度為0.2～2cm，將紫外光源安放在距離培養皿的正上方10～30cm處，在15 30℃的室溫下，對步驟(c)得到的發酵液進行照射，照射時間確定在20min～60min，照射完畢將發酵液經濃縮、干燥，破壁粉碎成粉末狀產品。
全文摘要
本發明公開了一種紫外光照射提高靈芝鈣強化劑中維生素D含量的方法，其步驟是a、配制培養基以碳源、氮源、礦質元素等制備液體培養基，將配制好的培養基滅菌，冷卻；b、向上述培養基中接種靈芝菌株，在一定條件下搖瓶培養，獲得液體冬蟲夏草菌種；c、向上述培養基中加入一定的液體靈芝菌種，通氣攪拌培養，取出發酵液；d、選用UV-B紫外光源，功率14-60W，波長為280～325nm，將靈芝菌發酵液倒在大培養皿中，將紫外光源安放在距離培養皿的正上方，得到的發酵液進行照射，照射完畢將發酵液經濃縮、干燥，破壁粉碎成粉末狀產品。本發明工藝簡單，操作方便，可廣泛用于兒童佝僂病、婦女缺鈣、老年人骨質疏松癥的預防和治療。
文檔編號A01G1/04GK101904497SQ201010230330
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者胡征 申請人:湖北工業大學