一種植物抗熱基因JAZ5a及其應用的制作方法

專利名稱：一種植物抗熱基因JAZ5a及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和植物學領域；更具體地，本發明涉及一種植物抗熱基因 JAZ5a及其應用。
背景技術：
白菜類蔬菜主要包括結球類大白菜(Brassica campestris L. ssp. pekinensis) 禾口不結球類小白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis)。小白菜簡稱青菜，北方稱油菜，其適應性強，生長快，產量高，營養好，消費量居各類蔬菜之首，是我國長江流域各省普遍栽培的一種大眾化蔬菜。小白菜種類和品種繁多，生長期短，適應性廣，高產，省工，易種，可周年生產供應。產品鮮嫩、營養豐富，為廣大消費者所喜愛。其年產量占蔬菜總產量的30-40%，對補充蔬菜淡季、實現周年均衡供應貢獻很大。大白菜和小白菜特性都為喜涼性，一年四季均可生產，生長最適溫度為15 20°C。近年來，為了適應市場的需要，集約栽培是白菜類蔬菜生產的主要特點。為了保證白菜類蔬菜一年四季的均衡生產和供應，小白菜常需一年四季采用不同的方式進行生產。以往主要在春冬季生產小白菜，開始在較炎熱的夏秋季采取各種栽培方式種植小白菜，無疑在其生育期內，尤其是春末、夏季和早秋往往會受到高溫逆境的脅迫。高溫季節栽培小白菜在20天以后即可分批上市，但高溫障礙往往使小白菜植株節間拉長、生長緩慢、味苦、纖維含量明顯增加等，常常導致產量低、品質差， 市場價格上揚，供不應求，不能滿足居民的消費需求。大白菜對炎熱的高溫忍耐力不強，特別在蓮座期和結球期對溫度要求嚴格，平均溫度過高心葉就不能抱合，不能結球，即使勉強結球，也比較松散。夏季田間自然條件下，形成正常的葉球是耐熱大白菜生產的先決條件， 田間自然高溫條件下的結球性是鑒定大白菜耐熱性的標準。大白菜和小白菜原產我國，國外對白菜類蔬菜的育種研究較少，從日本、韓國及我國臺灣地區引進的品種耐熱性差，不適宜在我國夏季生長和推廣。國內所選育的品種主要為秋季抗病品種，白菜類蔬菜耐熱基因庫窄，耐熱白菜品種選育僅局限于白菜材料之間的篩選，選出的品種耐熱性、抗逆性不夠理想。鑒于上述情況，我國育種家采用傳統的育種方法廣泛開展耐熱白菜類蔬菜品種的選育工作，引進耐熱基因，擴大資源來源途徑，一定程度提高了白菜類蔬菜耐熱能力，在生產上已經發揮了作用。然而，目前推出的是適合當地氣候條件的為主要依據的評價耐熱性的方法，且其依據主要是植物在高溫脅迫下表現出形態結構的變化。這一方法在溫帶地區很難創造選擇壓力適宜的田間環境，即使選出耐熱性單株，要將耐熱性狀保存到第二年春采種，需要采用一系列的較為繁雜的方法和措施，篩選周期長，且有地域性限制，不能將耐熱品種廣泛推廣到其他地區。因此對白菜類蔬菜苗期熱害癥狀的發生發展變化規律進行深入的研究，建立易于操作，結果穩定，效率較高的具有廣泛推廣性的苗期抗熱性篩選方法和技術是白菜類蔬菜抗熱育種工作亟需解決任務。與白菜抗熱密切相關的性狀屬于數量性狀，對其數量性狀的基因型進行選擇是非常困難的。針對分子育種，這種難度不僅表現在可利用于輔助選擇的DNA標記不多，且QTUQuantitative Traits Loci，數量性狀位點)在數目和作用上變化較大。因此，在白菜基因組測序工作尚未完成，功能基因組研究方興未艾的情況下，遺傳育種學家需要尋找一種快速、敏感、高效的， 在植株水平上各性狀和DNA定性分析技術，以及植株水平上表型和基因表達變化的定量分析技術，用以白菜類蔬菜抗熱育種研究。近年來分子生物學研究發展迅速，尤其是基因芯片技術在作物分子育種上的應用也越來越廣泛。基因芯片技術是20世紀90年代中期以來影響最為深遠的重大科技進展之一，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術。基因芯片是將大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規律地排列固定于支持物上，形成DNA微陣列。樣品DNA或RNA通過PCR擴增、體外轉錄等技術摻入熒光標記分子，然后探針再與已經標記過的樣品分子進行雜交，最后通過熒光檢測系統對芯片進行掃描，并配以計算機系統對每一探針上的熒光信號做出比較和檢測，通過檢測到的每個探針分子的雜交信號強弱，進而快速的獲取樣品分子在數量和序列方面的信息。目前，基因芯片技術已廣泛應用于藥物篩選、農業、疾病診斷和治療、中藥物種鑒定、司法鑒定、食品衛生監督、環境檢測、國防等許多領域。關于基因芯片技術在植物中應用的報道并不多，主要集中在擬南芥、 草莓、牽牛花等方面。在基因芯片應用上，基因表達水平的分析與檢測是目前研究最多、最為成熟的領域。由于芯片上可以固定成千上萬的探針，使眾多基因同時檢測成為可能，不僅可以比較在不同條件一個基因組大量基因的轉錄水平差異，而且可以對比不同基因組中對應基因的轉錄水平差異，從根本上突破了以前研究中一次只能關注1個或幾個基因的瓶頸。因此，本領域需要探索利用芯片技術來開發植物抗熱相關的基因的方法，以期獲得一些有用的植物抗熱相關基因。

發明內容
本發明的目的在于提供一種植物抗熱基因JAZ5a。本發明的另一目的在于提供所述基因的應用。在本發明的第一方面，提供一種分離的植物抗熱蛋白，該蛋白是(a) SEQ ID NO 4氨基酸序列的蛋白；或(b)將SEQ ID NO 4氨基酸序列經過一個或多個(如1_20個，較佳地1_10個，更佳地1-5個，最佳地1-3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白；或(C)與SEQ ID NO 4氨基酸序列有至少90%相同性，且具有與SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白。 在一個優選例中，所述的植物是十字花科植物。在另一優選例中，所述的十字花科植物選自蕓苔屬植物；鼠耳芥屬植物。在另一優選例中，所述的蕓苔屬植物是白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis)。在另一優選例中，所述的鼠耳芥屬植物是擬南芥(Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.)。在另一優選例中，所述的植物抗熱蛋白來源于蕓苔屬植物。較佳地，來源于小白菜。在本發明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組
(i)編碼所述的蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。在一個優選例中，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示。在本發明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體或基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發明的另一方面，提供一種植物，其包含前面任一項所述的多核苷酸。在本發明的另一方面，提供一種所述的蛋白的制備方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出所述的蛋白。在本發明的另一方面，提供所述的蛋白或其編碼基因的用途，用于提高植物的抗熱能力。在一個優選例中，用于提高植物在抽薹期的抗熱能力。在本發明的另一方面，提供一種提高植物的抗熱能力的方法，該方法包括提高植物中所述的蛋白的表達或活性。在一個優選例中，所述方法包括將編碼所述的蛋白的多核苷酸轉入到植物基因組中。在另一優選例中，所述方法包括(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有所述的蛋白的編碼序列；(2)將植物細胞、組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使所述蛋白的編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上。在另一優選例中，所述方法還包括(3)選擇出轉入所述蛋白的編碼序列的植物細胞、組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞、組織或器官再生成植株。在本發明的另一方面，提供一種由前述方法制備獲得的轉基因植物。在本發明的另一方面，提供一種鑒定植物的抗熱能力的分子標記物，所述的分子標記物是引物對，具有SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1.青菜抗熱和感熱品種中BccL0X3和BccJAZ5的cDNA_AFLP結果。HSO、 HSl. . . HS5中數字0、1. . . 5分別表示處理編號，對應于上面的熱處理后取樣時間。m表示分鐘，h表示小時。圖2. RT-PCR分析抗熱和熱敏青菜品種中BccJAZfe和BccJAZ5b轉錄水平。46°C 熱處理1個小時，提取植株總RNA。UBQ5作為對照。CK表示未進行熱處理的對照，就是正常生長溫度。0-1，0-2表示對照的兩個重復，1-1，1-2表示熱處理的兩個重復。圖3.轉基因株系35S: :BccJAZ5a的T2代幼苗的熱忍受表型。A. RT-PCR分析轉基因植株(gBccJAZ5a)及野生型植株(Col)的BccJAZfe和內源AtJAZ5表達水平。gBccJAZ5A HR/Col T2表示將BccJAZ5A基因組DNA轉入擬南芥中的轉基因植株繁殖第二代的雜合株(g代表基因組DNA)。1-1，1-2，2-1，2-2，3-1，3-2中“-”之前數字分別表示轉基因株系1，2和3，“-”后面數字分別表示轉基因株系的兩個重復。Col-I 與Col-2表示野生型擬南芥的兩個重復。B.熱處理轉基因植株及野生型植株。7天苗齡的幼苗生長在22°C，熱處理從40°C 到46°C 1個小時，然后恢復到22°C，7天后拍照。C. 3個轉基因株系苗期生長狀態。在正常生長條件下，與其它兩個轉基因株系(1# 和3#)相比，2號(2#)轉基因株系植株變小。圖4. 35s: =BccJAZfeR基因株系在抽薹期抗熱能力增強。植株生長在22°C到抽薹，然后45°C熱處理3小時或46°C熱處理2. 5小時，再恢復到22°C生長5天后拍照。每個株系重復兩個。圖中1-1-1，1-1-2分別表示轉基因株系1的兩個T2代株系，2-1-8等分別表示轉基因株系2的一個T2代株系，2-1-7是轉基因株系2的T2代又一個株系。同樣，3-1-1 和3-1-3是轉基因株系3的T2代的兩個株系。圖5.分析BccJAZfe蛋白(SEQ ID NO 4)的結構域的示意圖。
具體實施例方式本發明人經過長期的研究，利用芯片技術來開發植物抗熱相關的基因，首次在蕓苔屬植物中分離到一種新的植物抗熱基因，其可使得植物具有更好的熱耐受能力。本發明人將該基因命名為“BccJAZ5a”。基于該基因，可制備抗熱能力增強的轉基因植物。本發明中，對于適用于本發明的植物沒有特別的限制，只要其適合進行基因的轉化操作，如各種農作物、花卉植物、或林業植物等。所述的植物比如可以是(不限于)雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。更具體地，所述的植物包括(但不限于)小麥、大麥、 黑麥、水稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、櫻桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罌粟、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、檸檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆筍、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿
卜、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒、鱷梨、桂皮、樟腦、煙葉、堅果、咖啡、茄子、甘蔗、茶葉、胡椒、葡萄樹、蠔麻草、香蕉、天然橡膠樹和觀賞植物等。作為一種優選方式，所述的“植物”包括但不限于十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥屬植物，禾本科的水稻，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科蕓薹屬或鼠耳芥屬的植物。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的植物抗熱蛋白(多肽)”、“分離的提高植物抗熱能力的多肽”、 “分離的BccJAZfe蛋白”或“分離的BccJAZfe多肽”是指BccJAZfe蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化BccJAZ5a蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構
成”、“基本上由......構成”、和“由......構成”；“主要由......構成”、“基本上
由......構成”和“由......構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選的是重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主 (例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括BccJAZfe蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、 “衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的BccJAZ5a蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或 (iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發明中，術語“BccJAZfe蛋白”指具有提高植物抗熱能力的功能的SEQID NO 4序列的多肽。該術語還包括具有提高植物抗熱能力的、SEQ ID NO :4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個， 最佳地1-10個，還更佳如1-8個或1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5 個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括BccJAZ5a蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與BccJAZ5a蛋白的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗BccJAZfe蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含 BccJAZfe蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了 BccJAZfe蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有BccJAZfe蛋白序列的至少約20個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。本發明還提供BccJAZfe蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然BccJAZfe蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，“BccJAZ5a蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 4的氨基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。表 權利要求
1.一種分離的植物抗熱蛋白，其特征在于，該蛋白是(a)SEQ ID NO :4氨基酸序列的蛋白；或(b)將SEQID NO :4氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)與SEQID NO :4氨基酸序列有至少90%相同性，且具有與SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組(i)編碼權利要求1所述的蛋白的多核苷酸；或( )與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。
3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO :1 或 SEQ ID NO 2 所示。
4.一種載體，其特征在于，它含有權利要求2所述的多核苷酸。
5.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求4所述的載體或基因組中整合有權利要求2所述的多核苷酸。
6.一種權利要求1所述的蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求5所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出權利要求1所述的蛋白。
7.權利要求1所述的蛋白或其編碼基因的用途，用于提高植物的抗熱能力。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，用于提高植物在抽薹期的抗熱能力。
9.一種提高植物的抗熱能力的方法，其特征在于，該方法包括提高植物中權利要求1 所述的蛋白的表達或活性。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括將編碼權利要求1所述的蛋白的多核苷酸轉入到植物基因組中。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，包括(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有權利要求1所述的蛋白的編碼序列；(2)將植物細胞、組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使所述蛋白的編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上。
12.一種鑒定植物的抗熱能力的分子標記物，其特征在于，所述的分子標記物是引物對，具有SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及一種植物抗熱基因JAZ5a及其應用。本發明人首次在蕓苔屬植物中分離到一種新的植物抗熱基因，其可顯著提高植物(特別是抽薹期植物)的熱耐受能力。本發明還提供了所述基因編碼的蛋白及其制備方法，含有所述基因的載體和宿主細胞，制備攜帶所述基因的轉基因植物的方法。
文檔編號A01H5/00GK102311490SQ20101022284
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月8日 優先權日2010年7月8日
發明者何玉科, 孫傳寶 申請人:中國科學院上海生命科學研究院