專利名稱：來源于水稻的miRNA-n3及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及來源于水稻的miRNA-n3及其應用。
背景技術：
miRNA(microRNA,微小RNA)是一類長度約為20_24nt的內源單鏈非編碼小分子 RNA，在生物體中廣泛存在(Bartel D P. MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004,116 :281_297.)。近年來大量研究表明，miRNA能夠調控生物體 中許多基因的表達，在調節生長發育、細胞增殖、凋亡、抵御環境脅迫等諸多方面發揮重要
(Bushati N, Cohen S Μ. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. ,2007,23 175-205.；金龍國，王川，劉進元.植物MicroRNA.中國生物化學與分子生物學報，2006， 22 =609-614.)。植物miRNA主要通過切割靶基因mRNA，或抑制靶mRNA翻譯，來調控植物個 體生長發育并影響其生理過程，是一種新的基因調控模式，具有重要的研究意義(Voirmet 0. Origin, biogenesis, andactivity of plant microRNAs· Cell，2009，136 :669_687·)。水稻不僅是世界最重要的糧食作物之一，同時也是一種重要的模式生物，在植物 研究特別是單子葉植物研究中占有重要地位。目前已經發現了相當數目的水稻miRNA基 因，但發現的水稻miRNA基因數量還只是生物體內全部miRNA基因數的一部分，可能仍存 在著相當大一部分未被發現的miRNA，它們一般在結構或者序列上非保守，表達具有低豐 度、組織特異性或者誘導特異性的特點。這也提示我們在水稻某個特定生長時期、某些特定 組織、某種特殊脅迫處理條件下，通過最新的技術手段，仍然有望發現該條件特異表達的新 miRNA。而盡可能多地發現水稻中的miRNA，對于全面了解水稻乃至整個植物miRNA的形成 過程、結構特點和功能機制具有現實意義。我國是世界上人口最多的國家，同時也是主要的稻米生產和消費國，水稻對于我 國具有舉足輕重的地位。國內外除了利用常規育種手段之外，逐步運用基因工程技術對水 稻品質(產量、抗蟲、抗旱等)進行遺傳改良已經成為了一種趨勢。由于miRNA對植物有廣 泛的調控作用，很可能成為植物遺傳改良的重點研究基因之一，因此迫切需要通過大規模 測序方法充分挖掘和開發屬于本國知識產權的新的miRNA基因，從而為后期定向改良和培 育優質性狀的水稻品種奠定基礎。
發明內容
本發明的目的是提供來源于水稻的miRNA-n3及其應用。本發明保護的miRNA-n3的序列如下(5’ 一 3’)CUUCGGGGGAGGAGAGAAGC (序列表的序列 1)。本發明保護的miRNA-n3前體(pre-miRNA_n3)序列如下(5’ 一 3，)GGUUUUCUUGGAUCUCUCUCUCCCUUGAAGGCUAUCUCAUGGAG⑶UUGAUGUACACCAUU⑶UGCCUA AGAAACUGAGAAAGCCUUCGGGGGAGGAGAGAAGCCAAGCAAGCC。(序列表的序列 2)。本發明還保護序列1所示RNA在抑制bHLH轉錄因子基因(0s02g0178700)表達中的應用；所述bHLH轉錄因子如序列表的序列3所示。所述bHLH轉錄因子基因可如序列表 的序列4自5’末端第79至711位核苷酸所示。所述bHLH轉錄因子基因也可如序列表的 序列4所示。本發明還保護序列1所示RNA在促進bHLH轉錄因子基因(0s02g0178700) WmRNA 降解中的應用；所述bHLH轉錄因子如序列表的序列3所示。所述bHLH轉錄因子基因可如 序列表的序列4自5’末端第79至711位核苷酸所示。所述bHLH轉錄因子基因也可如序 列表的序列4所示。序列表的序列1所示的RNA和/或序列表的序列2所示的RNA可用于水稻種質改
良οSolexa克服了常規miRNA克隆技術的缺點，具有靈敏度高的優點，能夠檢測出最 少一個小RNA分子，并且準確性高，檢出的小RNA分子堿基錯誤率極低。同時該技術還具有 高通量、大規模的特點，能夠覆蓋整個基因組，兩個文庫的測序量高達500萬條小RNA序列 以上。基于這種最新的測序手段，將有望識別水稻中過去難以發現的低豐度或者某些條件 下特異表達的新miRNA。本發明采用國際上先進的Solexa高通量測序技術結合生物信息學分析、 Northern雜交、5’ RACE等多種生物學手段，首次從基因組水平鑒定到miRNA-n3，并且證實 miRn3的靶基因為bHLH轉錄因子基因，參與了植物發育過程的調控。過表達miRNA-n3的轉 基因植株會有明顯的發育方面的變化(根毛的長度、開花的時間等)，這都將為水稻的品質 育種(如培育抗逆性水稻)提供寶貴的基因資源，帶來一定的研究價值和社會效益，并最終 用于實際生產。本發明提供的miRNA廣泛參與了水稻多種生命活動的調節，具有重要的生 物學意義和潛在應用價值。
圖1為小RNA測序數據中分離和鑒定新miRNA的流程圖。圖2為0Sa-miRn3的前體二級結構圖；黑線部分指示成熟miRNA所在的位置。圖3為Northern雜交檢測不同濃度H2O2處理的水稻幼苗中osa_miRn3的表達。圖4為0Sa-miRn3的靶基因5’ RACE驗證；序列上方的箭頭表示發生切割的位點， 數值表示該切點處發生切割的克隆數與克隆總數比值。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中所用水稻品種均為秈稻品種93-11 (Oryza sativa L. ssp indica cv. 93-11)，水稻種子購自國家農作物種質保存中心(中國農業科學院作物科學研究所，郵 編100081聯系電話010-68919715)。該水稻品種已經由中國北京基因組研究所完成基因 組測序工作。 實施例1、miRNA_n3的發現
一、H2O2 處理
水稻種子經表面消毒后，37°C浸泡24h，然后催芽萌發45h。萌發后將水稻轉移 到光照培養箱中，培養箱條件設定為溫度28°C /21 V (白天16h/夜晚8h)，光照強度 400μ mol/m2 · s，相對濕度70%，由Hogland營養液提供水稻生長所需的全部營養，營養液 每2天更換一次。12天齡的水稻幼苗采用H2O2處理分別浸泡在0. 6mM、3. OmM和15. OmM H2O2水溶 液中，將浸泡在蒸餾水中的水稻幼苗作為對照；各種處理的幼苗同時置于25°C搖床中處理 6h。處理完畢后，將各個處理的水稻樣品按0. 5g分裝，液氮速凍后保存于-80°C備用。二、miRNA_n3 的發現1、RNA 提取將水稻樣品在液氮中研磨，用TRIZOL試劑盒(Invitrogen)提取總RNA，操作步驟 按TRIZOL試劑盒自帶的說明書進行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(Amersham Biosciences)測定提取的RNA在260nm(OD26tl)和280nm(OD28tl)波長的吸光度值以確定RNA 的純度和濃度。質量合格的RNA濃度應在1 μ g/ μ 1以上，OD260/OD280的比值在1. 8-2. 0之 間，且經電泳檢測條帶清晰，無明顯降解和DNA污染。2、小RNA文庫的構建將質量檢驗合格的水稻幼苗總RNA用于構建小RNA文庫。3種濃度(0. 6mM、3. OmM 和15. OmDH2O2處理的水稻樣品提取的RNA各取10 μ g等量混合，總共30 μ g用于構建水 稻幼苗H2O2處理的小RNA文庫。對照樣品提取的RNA取30 μ g，用于構建水稻幼苗對照小 RNA文庫。小RNA文庫的構建按照Illumina Sample Preparation Protocol文庫構建方 法進行，構建好的文庫采用Solexa高通量測序(北京華大基因研究中心)，獲得高質量的 18-30nt的小RNA序列(兩個小RNA文庫均獲得了五百多萬條序列)。3、兩個小RNA文庫中應答H2O2的miRNA的鑒定參考之前國外文獻對高通量測序數據分析的成功方法(Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification of plant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell，2004，14 :787_799.)，建立一套計算機分 析方法用來發現和鑒定測序數據中的水稻miRNA(分析流程如圖1所示)。①將獲得的兩個 小RNA文庫中的原始序列通過計算機方法去掉3’接頭，并過濾掉序列長度在ISnt以下的序 列，獲得所謂的“干凈”序列庫；②通過SOAP程序(Li R，Li Y,Kristiansen K,Wang J. SOAP short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics, 2008, 24713-714.)將 “干凈”序列庫中的序列與水稻93-11基因組(http://rice. genomics, org. cn/rice/)進 行匹配，保留能與基因組完全匹配的序列，進行后續分析；③將與基因組匹配的序列與國 際權威的 miRNA 數據庫 miRBase (http//microrna. Sanger, ac. uk/sequences/)中公布的 水稻miRNA成熟序列及前體序列進行BLAST，從而發現哪些序列來自于已知的水稻miRNA， 不能與已知miRNA匹配的序列再進入下一步分析；④將剩下的基因組匹配序列再與其它 非編碼 RNA 數據庫(ftp://ftp. sanger. ac. uk/pub/databases/Rfam/)、重復序列數據庫 (ftp://ftp. tigr. org/pub/data/TIGR_Plant_Repeats/)以及 93-11 蛋白編碼基因數據 庫(http://rice, genomics, org. cn/rice/)進行匹配，從而發現哪些序列來自于其它非編 碼RNA、重復序列以及蛋白編碼基因，過濾掉這些序列，剩下的序列中可能含有新的miRNA， 稱為潛在miRNA序列庫；⑤將潛在miRNA序列庫中的序列還原到基因組中，取基因組中該序列上下游各150nt進行二級結構分析，若能形成類似miRNA前體(pre-miRNA)的良好莖 環結構且其該序列在莖環結構中位置符合成熟miRNA要求，則該序列可以認為是候選的新 miRNA ；⑥考察候選的新miRNA序列所在的莖環結構前體的小RNA分布特征，若主要分布在 候選的新miRNA區域以及對應的miRNA*區域，則認為該候選的新miRNA序列高度可信，是 真實的 miRNA 序列(Meyers B C, Axtell M J,Bartel B,Bartel D P,Baulcombe D,Bowman J L,Cao X,Carington J C,Chen Χ,Green P J,et al. Criteria for annotation of plant microRNAs. Plant Cell,2008，20 :3186_3190.)。鑒定到1 個新的 miRNA，命名為 osa_miRn3 (miRn3 ；miRNA-n3)。osa-miRn3 的序列如下(5，— 3，)CUUCGGGGGAGGAGAGAAGC。H2O2處理小RNA文庫的測序次數(Q_2)為48，對照小RNA文庫(Qwm)的測序次數 為47。miRNA前體(pre_miRNA)序列的二級莖環結構是miRNA基因最顯著的特點之一，也 是所有miRNA鑒定方法都不可逾越的重要規則。osa-miRn3 前體(pre-osa_miRn3)序列如下(5，一 3，)GGUUUUCUUGGAUCUCUCUCUCCCUUGAAGGCUAUCUCAUGGAG⑶UUGAUGUACACCAUU⑶UGCCUA AGAAACUGAGAAAGCCUUCGGGGGAGGAGAGAAGCCAAGCAAGCC(序列表的序列 2)。pre-osa-miRn3能形成良好的莖環結構，成熟的miRNA從miRNA前體的莖部產生， 完全符合miRNA前體的結構特征(見圖2)。三、miRNA Northern 雜交為了進一步驗證osa-miRn3具有應答H2O2的表達模式，采用miRNA Northern雜交 檢測幾種H2O2處理濃度下(0、0. 6,3. O、15. OmM)miRNA的表達情況。1、制備探針檢測osa-miRn3 的探針(5，一 3，)的序列GCTTCTCTCCTCCCCCGAAG。采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對上述序列末端磷酸基團進行 同位素(Y -32P ATP)標記，得到探針，用Microspin G-25柱(GE Healthcare)純化探針，去 除未標記的同位素，純化后的探針用于Northern雜交。2、miRNA Northern 雜交Northern雜交中，每個泳道上樣量為20 μ g低分子量RNA，TO基因作為內參，與 miRNA在同一張膜上檢測。TO基因的探針序列為TATGCGTGTCATCCTTGCGCAG。(1)分別提取步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。(2)采用 Park 等報道的 PEG8000/NaCl 沉淀法(Park W, Li J, Song R, MessingJ， Chen X. CARPEL FACTORY,a Dicer homolog, and HENl, a novel protein,act inmicroRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol.，2002，12 :1484_1495.)從總 RNA 中富 集低分子量RNA (有利于提高miRNA的檢測能力)。(3) miRNA Northern 雜交①富集的低分子量RNA溶于DEPC水，再加入等體積的2 X RNA上樣緩沖液(95%甲 酰胺，18mM EDTA, 0. 1 %溴酚藍和0. 1 %二甲苯青)，混合后95°C變性5min，得到RNA樣品。②RNA樣品用15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用電轉移裝置 (BIO-RAD)轉移到 Hybond N+尼龍膜(Amersham Biosciences)上。
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③轉移有RNA樣品的尼龍膜經6XSSC溶液短暫漂洗，紫外交聯 (Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h，使RNA完全固定在尼龍膜上。④將轉移了 RNA的尼龍膜放入雜交管中，加入5ml ULTRAhyb-Oligo雜交液 (Ambion)在雜交爐中42°C預雜交2h，然后加入探針，混勻，42°C雜交過夜。⑤雜交結束后，小心倒出雜交液，加入含0. 5% SDS的2XSSC溶液，42°C洗滌三次， 每次IOmin。⑥洗膜結束后，將膜用保鮮膜包裹，平整壓于X光片下，附加增感屏，-70°C曝光1 周。⑦曝光結束后，沖洗X光片，進行光密度掃描，以對照組的雜交信號為1，計算各個 處理組雜交信號的相對強度。結果見圖3。Northern雜交結果和測序數據很吻合，osa-miRn3幾乎不受H2O2誘 導表達，暗示了它在氧化脅迫中可能起不同的作用。實施例2、miRNA的靶基因預測與驗證由于植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補，因此可以通過生物信息學方法預測 osa-MIRn3的靶基因。采用Schwab等描述的方法預測miRNA的靶基因(Schwab R，Palatnik J F,Riester Μ,Schommer C,Schmid Μ,Weigel D. Specific effects ofmicroRNAs on the plant transcriptome. Dev. Cell, 2005,8 :517_527.)。使用 Patscan程序在水稻 93-11 全長 cDNA和基因庫(http://rice. genomics, org. cn/rice/)中尋找能與miRNA序列近乎完全互 補的cDNA或基因，即為miRNA的靶標；參數設置為=Patscan程序參數為默認設置，允許最 大錯配數為3個，miRNA的第10和11位堿基不允許有錯配，靶標的功能通過NCBI (http // www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性檢索，以同源性最高的已知功能基因進行注釋。預測結果見表1。表losa-MIRn3的靶基因及功能 osa-miRn3 的靴基因為 bHLH 轉錄因子(bHLH transcription factor)基因 0s02g0178700 (GENBANK ACCESSION NO. 0s02g0178700 ；見序列表的序列 4，其編碼的蛋白質 見序列表的序列3)。該類轉錄因子在植物發育過程中起重要的調控作用，如控制根毛的發 育，調控水稻的分枝發育等。實施例3、miRNA對靶基因mRNA的切割osa-miRn3對靶基因0s02g0178700 (見序列表的序列4)mRNA的切割用5，RACE方 法進行驗證(Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification ofplant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell,2004,14 787-799.)。靶基因mRNA被miRNA切割后，其較為穩定的3’切割產物5’端核苷酸磷酸集團暴露，用T4RNA連接酶在該切割產物5’端連接上5’ RACE專用接頭；通過反轉錄反應合 成cDNA ；通過靶基因特異的巢式外引物和試劑盒所帶的巢式外引物進行第一輪PCR，靶基 因特異的巢式內引物和試劑盒所帶的巢式內引物進行第二輪PCR;將5’RACE獲得的PCR產 物連接到PMD 19-T載體后測序，就能知道精確的靶基因mRNA切割位點。1、分別提取實施例1的步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。2、按Firstchoice RLM-RACE試劑盒(Ambion)操作說明進行5，RACE，靶基因特異 的巢式外弓I物的序列為TGCATGGAAATGTAGTTCTCGGCA，靶基因特異的巢式內引物的序列為 GGACTTGATGGCACGCTTCCTCTC。3、PCR產物進行瓊脂糖電泳，回收170bp左右的特異條帶(圖4中泳道1所示)。4、將回收的PCR產物連接到pMD 19-T載體(TaKaRa)，并轉化大腸桿菌 DH5α (TaKaRa)。5、挑單克隆測序，根據測序結果確定靶基因mRNA的切割位點。PCR產物的電泳圖和測序結果顯示的切割位點見圖4。osa-miRn3的靶基因在與其 互補的區域發生了切割，這個結果強有力的證明了 0s02g0178700確實是0Sa-miRn3體內真 正調控的靶基因(圖4中，有兩個切割位點，切割概率比為1 8)。
權利要求
序列表的序列1所示的RNA。
2.序列1所示RNA在抑制bHLH轉錄因子基因表達中的應用；所述bHLH轉錄因子如序 列表的序列3所示。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述bHLH轉錄因子基因如序列表的序列4 自5’末端第79至711位核苷酸所示。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述bHLH轉錄因子基因如序列表的序列4 所示。
5.序列1所示RNA在促進bHLH轉錄因子基因的mRNA降解中的應用；所述bHLH轉錄 因子如序列表的序列3所示。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述bHLH轉錄因子基因如序列表的序列4 自5’末端第79至711位核苷酸所示。
7.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述bHLH轉錄因子基因如序列表的序列4 所示。
8.序列表的序列2所示的RNA。
9.序列表的序列1所示的RNA和/或序列表的序列2所示的RNA在水稻種質改良中的應用。
全文摘要
本發明公開了來源于水稻的miRNA-n3及其應用。本發明保護的miRNA-n3是序列表的序列1所示的RNA。本發明保護的miRNA-n3前體(pre-miRNA-n3)是序列表的序列2所示的RNA。本發明還保護序列1所示RNA在抑制bHLH轉錄因子基因表達和/或促進bHLH轉錄因子基因的mRNA降解中的應用。所述bHLH轉錄因子如序列表的序列3所示。應用miRNA-n3有望獲得在生長發育以及耐受逆境脅迫方面有重要表型的植株，具有重要的生物學意義和潛在應用價值，將為水稻的良種培育(如培育抗逆性水稻)提供寶貴的基因資源，具有重要的研究價值和潛在的社會效益，并最終用于生產實踐。
文檔編號A01H5/00GK101892232SQ201010221438
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者劉進元, 李甜 申請人:清華大學