專利名稱：培育抗細菌性條斑病轉基因植物方法及其專用載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中的一種培育抗細菌性條斑病轉基因植物方法及其專用載體。
背景技術：
水稻細菌性條斑病簡稱細條病，病原菌為水稻細菌性條斑病菌 (Xanthomonasoryzae pv. oryzicola (Fang) Swings et al)。廣泛分布于亞洲熱帶禾口亞熱帶地，國內主要分布于華南、華中、西南等地區。該病發生時，蔓延迅速，導致稻葉變黃枯死、空 /秕粒增多、產量下降，嚴重時減產可達40% -60%。由于近年來感病的雜交水稻大面積推廣，稻種的南繁和調運致使此病迅速蔓延，病區不斷擴大，現已成為水稻主要病害。因此研究植物的細條病抗性的機理具有重要應用價值。在植物的抗病性應答中，基因表達調控起著重要的作用。通過調控特異基因的表達，植物可以迅速完成抗病應答，抵御病原菌的入侵，提高植物的抗病性。調控病害應答基因表達是植物抵御外界病源物入侵的重要途徑。在病源物入侵時，植物可以通過特異抗病基因的表達，低于外界病源物入侵，提高植物的抗病性。因此，培育抗細菌性條斑病植物為研究熱點。
發明內容
本發明的目的是提供一種培育抗細菌性條斑病轉基因植物方法及其專用載體。本發明提供的培育抗細菌性條斑病的方法，為將JERFl蛋白的編碼基因導入目的植物獲得轉基因植物；所述轉基因植物的細菌性條斑病抗性高于所述目的植物；所述JERFl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述序列2由372個氨基酸殘基組成。所述JERFl蛋白的編碼基因為序列表中的序列1的自5’末端第87位到第1205
位核苷酸。其中序列1由1391個核苷酸組成，其開放閱讀框為自5’末端第87位到第1205 位，開放閱讀框編碼JERFl蛋白。所述目的植物可為雙子葉植物或者單子葉植物，優選為單子葉植物，尤其優選為水稻。所述細菌性條斑病可由下述致病菌引起水稻細菌性條斑病菌 (Xanthomonasoryzae pv. oryzicola(Fang)Swings et al)。所述JERFl蛋白的編碼基因通過下述植物表達載體導入所述目的植物。所述植物表達載體的啟動子可為花椰菜花葉病毒35S啟動子。所述植物表達載體具體為將所述JERFl蛋白的編碼基因插入載體pCAMBIA1200的 ACSI和SpeI的識別位點間。載體pCAMBIA1200上有ADHl內含子，該內含子位于ACSI識別位點的上游。
所述抗細菌性條斑病的轉基因植物中病程應答基因的表達率高于所述目的植物。所述病程應答基因為OsChin和Osfcil。本發明的研究結果表明，轉JERFl水稻的細菌性條斑病抗性高于野生型水稻，具體表型為，在受病原菌侵染后，轉JERFl水稻的病斑長度明顯短于野生型水稻。經過檢測抗病基因表達，結果發現，與野生型水稻相比，轉JERFl水稻中抗病基因的表達顯著提高。因此本發明提供的轉JERFl水稻的細條病抗性具有廣闊的應用前景。
圖1為JERFl植物表達載體構建示意2為野生型和轉基因水稻接種細條病21天后的發病情況圖3為野生型和轉基因水稻抗病基因表達的檢測
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1轉JERFl水稻的培育1、重組菌的構建提取番茄(Lycopersicum esculentum Mill)(品種為麗春番茄，麗春番茄種子購自中國農業科學院蔬菜花卉研究所。)的葉片DNA，以該DNA為模板，用引物5’-AGGCGCGCCTG TGGTGGTGCAATTATC-3，(下劃線為 ACSI 的酶切位點)和 5’-GACTAGTAAGATGTGTATGCAGC-3’ (下劃線為SpeI的酶切位點)進行PCR，擴增得到PCR產物，將PCR產物電泳檢測，結果表明PCR 產物為1. 151Λ。經測序，該PCR產物具有序列表中的序列1自5’末端第87位到第1205 位核苷酸序列，序列表中的序列1自5’末端第87位到第1205位核苷酸序列編碼序列2 所示的蛋白，該蛋白命名為JERF1，該蛋白的編碼基因命名為JERF1。對PCR產物進行ACSI 和SpeI酶切，將經ACSI和SpeI酶切后的PCR片段連接到經同樣酶切植物雙元表達載體 PCAMBIA1200 (Cambia, GPO Box 3200, Canberra, ACT 2601, Australia)的大片段上獲得重組表達載體PCAMBIA1200-JERF1 (見圖1)。將重組表達載體pCAMBIA1200-JERFl通過電轉化方法導入農桿菌LBA4404(購自 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), http//www. cbs.knaw.nl/, NCCBbacteria/plasmids database, NCCB number 2760。 ) 1 H i 會且胃 LBA4404/ PCAMBIA1200-JERF1，經菌落 PCR 鑒定獲得陽性重組菌 LBA4404/pCAMBIA1200_JERFl。2.根癌農桿菌介導pCAMBIA1200-JERFl轉化水稻1)將75%乙醇滅菌后的水稻種子(日本晴)種于誘導培養基(NB培養基(購自北京西美杰科技有限公司)+ang/L 2,4-D)上，28°C黑暗培養兩周后獲得愈傷組織，將愈傷組織轉入新的誘導培養基，28°C繼代暗培養。2)將第三代繼代愈傷組織中自然分散、顏色淡黃的胚性愈傷顆粒置于繼代培養基 (NB培養基+2mg/L 2,4-D)上，28°C暗培養3天，獲得繼代培養愈傷組織。3)將上述獲得的重組菌 LBA4404/pCAMBIA1200-JERFl 接種于 IOOuM AS+AA 液體培養基(NB培養基+2mg/L 2,4-D+100uM/L AS)中培養至OD為0. 3時獲得菌液，然后將繼代培養愈傷組織置于所述菌液中浸泡10 20分鐘，其間輕輕搖動。倒掉菌液，小心取出浸泡后的愈傷組織用濾紙濾干多余菌液，再轉移到共培養培養基(NB培養基+2mg/L 2， 4-D+100uM/LAS)上，21°C _22°C暗培養3天，獲得共培養愈傷組織。4)挑選共培養愈傷組織，用無菌水洗去多余菌體，濾紙濾干后平鋪于篩選培養基 (含50mg/L潮霉素Hyg) (NB培養基+2mg/L 2，4_D+50mg/L Hyg)上，28°C進行暗培養2周時繼代一次，然后再培養2周繼代2次，獲得繼代后的共培養愈傷組織。5)將生長旺盛，呈乳白色或微黃色的新鮮繼代后的共培養愈傷組織轉至預分化培養基(NB培養基+5mg/LABA+0. 5mg/L NAA)，暗培養1周，然后光照培養兩周，繼代一次獲得分化成苗。6)將長勢好的分化成苗移至生根培養基(MS基本培養基，上海生工購買)(瓶裝) 上。培養1-2周后移栽溫室獲得23株TO代轉JERFl水稻。將上述獲得的TO代轉JERFl水稻采用Northern blot鑒定，以JERFl的cDNA序列為探針，鑒定結果為獲得14株陽性TO代轉JERFl水稻。收獲鑒定后陽性的TO代轉JERFl 水稻的種子，使用潮霉素選擇平板萌發獲得Tl代轉JERFl水稻，確認其具有3 1的分離比，然后將Tl代轉JERFl水稻轉至土壤培養直至成熟，收獲Tl代轉JERFl水稻種子采用同樣的方法獲得T2代轉JERFl水稻，收獲T2代轉JERFl水稻種子采用同樣的方法獲得7個 T3代轉JERFl水稻株系。實施例2、轉JERFl水稻抗病性鑒定在正常光、溫、水條件下培養水稻(日本晴)(以下稱為野生型，WT)和4株T3代轉 JERFl 水稻(編號為 JERF1-0E4、JERF1-0E8、JERF1-0E9 和 JERF1-0E10)，當野生型和 T3 代轉JERFl水稻長到抽穗期時，在水稻的展開葉片葉脈兩側進行針刺接種水稻細菌性條斑病病原菌水稻細菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola(Fang)Swings et al)。 病菌的接種濃度為5X IO8CfVml。每株接種3個葉片，每葉4-6個針刺點。接種后7天觀察接種植物的發病情況，接種后21天統計發病植株的病斑長度(取平均值)，結果如表1所示。
病斑長大于IOmm為敏感性(S)，病斑長小于IOmm為抗性(R)。表1發病植株的病斑長度
權利要求
1.一種培育抗細菌性條斑病轉基因植物方法，為將JERFl蛋白的編碼基因導入目的植物，獲得抗細菌性條斑病的轉基因植物；所述JERFl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述JERFl蛋白的編碼基因為序列表中的序列1的自5’末端第87位到第1205位核苷酸。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優選為單子葉植物。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為水稻。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述細菌性條斑病由下述致病菌弓I起水禾苗細菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Fang) Swings et al)。
6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述JERFl蛋白的編碼基因通過植物表達載體導入所述目的植物。
7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述植物表達載體中的啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子。
8.根據權利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述植物表達載體為將所述JERFl 蛋白的編碼基因插入載體PCAMBIA1200的多克隆位點間得到的。
9.根據權利要求1-8任一所述的方法，其特征在于所述抗細菌性條斑病的轉基因植物中病程應答基因的表達率高于所述目的植物。
10.根據權利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述病程應答基因為OsChin和 OsXal0
全文摘要
本發明提供一種培育抗細菌性條斑病轉基因植物方法及其專用載體，該方法為將JERF1蛋白的編碼基因導入目的植物獲得轉基因植物；所述轉基因植物的細菌性條斑病抗性高于所述目的植物；所述JERF1蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發明的研究結果表明，轉JERF1水稻的細菌性條斑病抗性高于野生型水稻，具體表型為，在受病原菌侵染后，轉JERF1水稻的病斑長度明顯短于野生型水稻。經過檢測抗病基因表達，結果發現，與野生型水稻相比，轉JERF1水稻中抗病基因的表達顯著提高。因此本發明提供的轉JERF1水稻的細條病抗性具有廣闊的應用前景。
文檔編號A01H5/00GK102260678SQ20101018369
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月25日 優先權日2010年5月25日
發明者周時榮, 張執金, 張海文, 權瑞黨, 李小湘, 黃榮峰 申請人:中國農業科學院生物技術研究所