專利名稱：對鱗翅目害蟲高抗性的cryIAc基因及其在甘蔗中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和生物防治領域，具體涉及到根據植物偏愛密碼子設計人工合成的Bt基因在甘蔗中的表達及轉基因植株抗蟲性的研究。
背景技術：
甘蔗是我國的重要經濟作物，近年來種植面積約120萬公頃，年產甘蔗糖920萬噸，占我國食糖總產量的90%以上。國家已把發展生物質能源作物為主要原料的生物質液體燃料列為可再生能源中長期發展規劃的重要內容，并確定了到2020年達到年替代石油 1000萬噸的能力的目標，其中甘蔗是最重要的能源作物之一。我國糖蔗產區主要分布在廣東、廣西、云南和海南等省區的經濟相對不發達地區，蔗糖業是這些地區的重要經濟支柱。 穩定和發展甘蔗產業對滿足國民的食糖消費需求、繁榮貧困蔗區地方經濟和促進綠色能源工業的發展有著重要的意義。在甘蔗生產中，蟲害一直是最大威脅因素之一，其中危害最嚴重的是甘蔗螟蟲 (鱗翅目害蟲)。幾乎所有蔗區都受著不同程度的螟蟲危害。我國蔗區發生的甘蔗螟蟲主要有二點螟、條螟、黃螟、大螟、白螟和臺灣稻螟等，不同蔗區，種類的分布有差異。螟蟲危害可導致枯心苗、蟲蛀節、枯稍、長側芽、蔗株停止生長、莖數減少、糖分下降等，從而造成產量、糖分損失，同時還由于蔗莖組織受傷害，導致病菌(如赤腐病菌等)易入侵和易受風折。 螟害造成的損失一般達5% 20%，嚴重的可達40%以上。特別是發展能源甘蔗時，一年四季各生長期的甘蔗都有，更有利于害蟲的生長、繁殖，害蟲的發生為害將更加嚴重。目前我國蔗區主要以施用殺蟲劑防治甘蔗害蟲。長期大量施用殺蟲劑，不但使生產成本增加，而且還導致嚴重的環境污染和生態平衡破壞、害蟲天敵數量和種群減少，進而形成需要繼續依賴殺蟲劑的局面和蟲害再猖獗現象。抗蟲育種是防治農作物害蟲最經濟、 最有效的措施之一。但甘蔗自身缺乏抗源。隨著分子育種研究的進展，基因工程打破了抗性基因來源的限制。近年來，Bt等抗蟲基因已被廣泛應用于多種作物的抗蟲育種，取得了可喜的成就。80年代以來，隨著生物技術的迅速發展和以蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt) δ -內毒素基因(Bt基因)為主的各種殺蟲蛋白基因的發現和克隆，抗蟲基因轉移研究已取得了可喜的成就。Bt基因在作物的蟲害防治方面具有重要的應用價值。Bt作物田間試驗的報道首見于1986年，但直至20世紀90年代中期，Bt作物才被應用于商業化生產。甘蔗轉基因抗蟲育種的進展相對較慢。目前尚未見轉基因抗蟲品種商品化種植的報道。古巴科學家1997年報道將Bt基因導入甘蔗品種但基因表達水平過低(少于總蛋白的0.0002%)而失去商品化價值。澳大利亞BSES的科學家將從馬鈴薯中克隆的抗蟲基因導入甘蔗Q117品種，獲得了轉基因植株。1998年已通過溫室盆栽試驗證明轉基因植株對金龜子有良好的抑制生長作用。我國科技工作者已將抗線蟲基因 Hslpro-I (2004)、調控花組織分化的基因LEAFY Q003)、抗病毒基因&MV-CP Q004)、抗旱基因Tsase (2000, 2003)及抗蟲基因Bt轉入甘蔗中，但均處于試驗階段。
蘇云金桿菌能產生蛋白性質的伴孢晶體，對多種昆蟲，線蟲，螨類等原生動物具有特異的殺蟲活性，對人畜無害，不污染環境，因而被廣泛應用于害蟲的生物防治。其中CryI 系列的S-內毒素對鱗翅目(L印idoptera)害蟲特別有效，因而cryl中的許多基因已被廣泛用于植物的抗蟲基因工程。但由于微生物與動植物的密碼子的使用差別使翻譯效率降低；野生型Bt基因中富含AT序列，在植物中表達的野生型Bt基因的mRNA通常不穩定易被降解等問題造成Bt基因在植物中表達量很低。因此，要使得Bt基因在轉基因植物中高效表達，必須對野生型Bt基因進行有效的改造。
發明內容
本發明的目的是提供一種對甘蔗條螟等鱗翅目重要害蟲具有極高毒力的適用于單子葉植物中表達的合成基因mcrylAc。本發明的另一個目的是提供一種使植物產生對鱗翅目害蟲抗性的方法。具體技術方案構思為針對蘇云金桿菌的野生型cryIAc基因片段較長(3534bp)， 難以在甘蔗中表達的特點，采用5'端活性片段序列(1845bp)，根據單子葉植物偏愛密碼子設計了可以在甘蔗中高效表達的具有持久生物活性的Bt蛋白及其編碼序列。采用用遞歸的PCR的方法進行擴增，分三段合成了蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白基因cryIAc的活性區序列，經克隆將其組裝成完整的mcrylAc基因片斷(1845bp)，與原始cryIAc DNA序列比較，該 DNA序列編碼蛋白質的氨基酸組成和序列不變，甘蔗偏愛性密碼子的使用頻率很高，消除了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重復序列以及不明確的真核DNA序列內含子序列，G+C含量由37. 4%提高到56. 3 %，所用密碼子中，第三位堿基的GC含量由23. 提高到65.8%，使其能在甘蔗中穩定高表達。構建了高效啟動子控制該目的基因表達的轉化質粒，采用基因槍法轉化甘蔗愈傷組織，利用Southern bl0t*Wfestern blot檢測該基因在轉基因甘蔗植株中的插入和表達情況，發現mcrylAc基因已插入甘蔗染色體中，在蔗莖和葉中的表達量為5-50ng/mg。無性繁殖第7代還很穩定表達CryIAc晶體蛋白，保持良好的抗蟲性，是已知的轉基因抗蟲甘蔗中，對甘蔗螟蟲抗性最好的材料。本發明的提供了一種DNA分子，它編碼對鱗翅目害蟲高抗性的cryIAc基因 mcrylAc，該DNA分子具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本發明的提供了一種具備對鱗翅目害蟲高抗性的的蛋白質，該蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。該蛋白質的核苷酸序列編碼序列如SEQ ID NOl所示。本發明提供了一種植物表達載體，該植物表達載體含有在大腸桿菌和甘蔗中穿梭的雙元載體序列和具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。例如，該載體由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列和大腸桿菌和甘蔗中穿梭的雙元載體序列構成。本發明提供了一種使單子葉植物產生對鱗翅目害蟲抗性的方法，即用上述植物表達載體轉化單子葉植物。單子葉植物例如實施例中所述的甘蔗。本發明提供了植物表達載體的應用，即將含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的大腸桿菌-甘蔗穿梭載體轉化甘蔗，從而使甘蔗產生對鱗翅目害蟲的抗性。本發明提供了所述的人工合成對鱗翅目害蟲高抗性的cryIAc基因mcrylAc的應用，將相應的蛋白質應用于抗鱗翅目害蟲。較好的，所述的鱗翅目害蟲是螟蟲。本發明還提供了檢測轉化植株的方法即以mcrylAc基因為探針與樣品進行雜交，利用southern blot檢測是否存在mcryIAc基因并插入植物染色體中。具體而言，檢測在植物中表達的具有Bt晶體蛋白活性的方法，其步驟如下(1)將cryIAc基因連于表達載體pGEX_4T中形成cryIAc的晶體蛋白表達載體；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入E. coli，形成可表達CryIAc晶體蛋白的原核宿主細胞；(3)在適合表達CryIAc晶體蛋白的條件下，提取純化該蛋白；(4)將獲得的純CryIAc晶體蛋白免疫兔子；(5)以免疫后的兔血清為第一抗體，利用western blot檢測轉基因植株中CryIAc 晶體蛋白的表達。本發明中，基因合成、裝載體、轉化植株都采用本領域的常規方法和操作。本發明在不改變晶體蛋白氨基酸序列的情況下，對cryIAc基因通過人工合成進行完全改造，選用植物偏愛的密碼子，去除了原序列中干擾基因在植物中表達的元件使轉基因植物的目標蛋白表達量獲得提高。根據單子葉植物偏愛性密碼子設計多條長鏈寡聚核苷酸，進行人工改造和全合成，利用基因槍法轉化甘蔗的重要栽培品種，并且能夠穩定表達，獲得了一批高表達量的轉基因甘蔗品系，溫室和田間實驗證明對鱗翅目害蟲具有天然的抗性。抗螟甘蔗品種選育將有助于減少螟蟲對甘蔗生產的威脅，減少化學農藥施用，保護生態環境，促進蔗糖業的可持續發展。
圖1是人工合成目的基因mcryIAc的設計。先將cryIAc基因的前184^ps序列設計成適合在甘蔗中表達的假想基因mcryIAc，保持氨基酸順序不變，分析單一酶切位點后選擇其中DraIII (616)和BamHI (1364)為分界點。將mcryIAc分成三個片段I，II，III。在片段I 5’端引入Smal，在分別在三個片段的兩邊的外引物中引入EcoRI和McI以用于克隆和測序。圖2是三個遞歸PCR(Recursive PCR)后得到的產物片段I :650bps。圖3是三個遞歸PCR(Recursive PCR)后得到的產物片段II :780bps。圖4是三個遞歸PCR(Recursive PCR)后得到的產物片段III :520bps。圖5是yIAc基因核苷酸堿基G+C含量的變化。合成基因mcryIAc中核苷酸堿基 G+C總含量由37. 4%提高到56. 3%，第三位堿基GC含量由23. 提高到65. 8%。圖6是轉化質粒pWiimBt的構建示意圖。限制性酶切位點H，HindIII ；B,BamHI ； S, SmaI ；A,AvaI ；K, KpnI ；Sc, SacI ；E, EcoRI.基因片段Amp, ampicilin resistance gene ； NPTII，G418和卡那霉素抗性基因；Pubi，玉米泛激素啟動子；mcryIAc，Bt基因的插入片段； Tnos，胭脂堿氧化酶的3’終止區域。圖7是質粒pEmukn的意圖。ScjacI ；E,EcoRI.基因片段。nos，胭脂堿氧化酶的 3’終止區域。圖8是狗計吐11 blot檢測。分析結果表明改造后的Bt基因mcryIA表達量明顯提高。81.來源于細菌的CryIAc蛋白，82-87.轉基因甘蔗葉片中的總蛋白提取物。圖9是抗蟲性效果分析。橫坐標是甘蔗株號，縱坐標是死亡率。1和7為未轉基因的對照株，蔗螟不死亡。3，4，6，10，11，12，13，15均為高表達轉基因植株，蔗螟全部死亡。2，5，8，14轉基因植株的CryIAc蛋白表達量不高，抗蟲效果就略差。轉基因甘蔗的抗蟲性隨著CryIAc蛋白表達量的增多而提高。
具體實施例方式實施例1目的基因的合成過程(1)設計寡聚核苷酸合成目的基因依據甘蔗偏好使用密碼子，先將1845bps的cryIAc基因序列設計成適合在甘蔗中表達的假想基因mcrylAc，保持其氨基酸順序和原天然的一樣，分析單一酶切位點后選擇其中DraIII (616)和BamHI (1364)為分界點(如圖1)。將mcryIAc分成三個片段(I, II， III)來設計，我們引入SmaI在片段15’端(它可用于mcryIAc基因安插在W^i-I啟動子下)，EcoRI和SacI在三個片段(I，II，III)的兩邊的外引物中以用于克隆和測序，對于片段I，我們還設計了 10個內引物(80bps到100bps)，片段IIlO個內引物，片段III8個內引物。每個內引物設計時有15-20個核苷酸序列是重疊的。所有引物的退火溫度是從50°C到
之間，以確保其PCR的專一性。(2)遞歸的PCR反應(Recursive PCR)。cryIAc基因合成采用遞歸的PCR的方法， 結合高保真的Pfu耐高溫DNA聚合酶進行PCR擴增。分別合成I，II，III三個片段。第一段從ATG起始密碼到616DraIII位點，共有616bp核苷酸(見圖2)；第二段從616DraIII 位點到1364BamHI，共有748bp核苷酸(見圖；3)。第三段從1364BamHI位點到終子密碼 TGA，共有481bp核苷酸(見圖4)。片段I的兩個外引物(5’端含EcoRI/Smal位點，3’端含Dralll/SacI位點)，片段II的兩個外引物(5’端含EcoRI/Dralll位點，3’端含BamHI/ SacI位點)，片段III的兩個外引物(5，端含EcoRI/BamHI位點，3，端含McI位點)，這三個片段的3對外引物的濃度分別是10個內引物的20到100倍。反應體積50 μ 1，反應條件為94°C，4分鐘，然后30個循環(920C，1分鐘，50°C，1分鐘，72°C，1分鐘)，最后72°C延伸 10分鐘。(3)組裝3個片段三個Recursive PCR后得到的三個產物均含5，端EcoRI位點和3’端Mel位點。將I，II，III片段以EcoRI/&icI位點分別插入pBluescript SK載體中得到pBluescript SK I，II，III三個質粒，進行測序，檢測其中pBluescript SK II和 pBluescriptSK III中分別有一個堿基與設計的不符。用定點突變的方法(stratagene定點突變試劑盒)進行糾正，序列正確的片段II和III分別通過DraIII/BamHI，BamHIAacI 相連進入pBluescript SK I質粒得到重組質粒pBluescript SK I+II+III，連接成完整的 m-crylAc基因。合成基因與野生型基因相比，整個基因的核苷酸組成發生了變化，增加了結構穩定的堿基含量，mRNA不穩定的AT核苷酸集聚區域序列全部替換，并改動了 5個易形成二級發夾結構區域核苷酸序列。其中核苷酸堿基G+C總含量由37. 4%提高到56. 3%，第三位堿基GC含量由23. 提高到65. 8% (見圖5)。實施例2轉化質粒pWiimBt的構建質粒pBI121 (Clontech,USA)中nos終止片段(胭脂堿氧化酶的3’終止區域)和 2. 11Λ⑶S基因片段克隆到pGEM-4Z(Pr0mega，USA)并插入21Λ含玉米泛激素啟動子Pubi及其增強子(來源于質粒 pAHC18，Christensen AH, Transgenic Research 5 :213_8，1996，在甘蔗中可提高基因的轉錄水平從而增加基因產物的表達量。)，得到質粒pWDiGUS。將質粒ρ^ ⑶S中的⑶S基因去除，連入多克隆位點片段(來源于質粒pGEM-3Z Promega)得到質粒pU3Z.將合成基因mcryIAc通過Smal/&icl而克隆插入pU3Z植物表達載體的多克隆位點就得到得到適合在甘蔗中高效表達的質粒PWDimBt (如圖6)。實施例3.甘蔗的轉化采用基因槍法(Bio-fcid1000/He Biolistic gun)將兩個質粒(pEmuKN 和 pUbimBt)導入甘蔗的胚性愈傷組織，質粒pEmuKN 由 David Last(CSIR0 Division of Plant Industry, Canberra, Australia)提供，卡那霉素抗性基因(或G418抗性基因)aphA來源于質粒pEmukn (如圖7)。獲得了轉化植株，經PCR和southern檢測表明甘蔗的染色體中存在mcryIAc基因。實施例4.轉基因產物的鑒定蛋白免疫分析基因表達量利用Western blot，根據標準CryIAc蛋白的情況推算出轉基因甘蔗的葉片和莖中Bt毒素蛋白的含量。利用Western blot檢測mcryIAc基因在轉基因甘蔗中的表達。以往的數據顯示Bt基因在葉和莖上的表達程度是一致。我們只針對甘蔗葉上的蛋白表達量進行測定。部分植株的定量Western blot分析結果(見圖8)，表明改造后的Bt基因mcryIA表達量明顯提高，在蔗莖和葉中的表達量為5-50ng/mg總蛋白。 特異免疫反應的蛋白分子量與該基因片段在大腸桿菌中表達產物(泳道1)大小一致。表明人工合成的mcryIA基因能在植物中正確地表達毒素蛋白CrylAc。實施例5.轉基因植株抗蟲性的檢測將mcryIA基因轉入甘蔗，篩選毒素蛋白CryIAc高表達量的轉基因植株，獲得一批抗性良好的Bt甘蔗品系。分別在玻璃溫室和大田進行抗蟲性的篩選鑒定。轉基因甘蔗的殺蟲活性變化趨勢與CryIAc蛋白表達量有關，即隨著CryIAc蛋白表達量的由少到多，殺蟲活性也由低變高。抗蟲性效果如圖9。
序列表
SEQUENCE LISTING <110>復旦大學
<120>對鱗翅目害蟲高抗性的cryIAc基因及其在甘蔗中的應用
<130>1040
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1848
<212>DNA
<213>Artificial
<400>1
atggacaacaacccaaacatcaacgagtgcatcccatacaactgcctgagcaacccagag60gtggaggtgctgggtggcgagcgcatcgagaccggttacacccccatcgacatctccctg120tccttgacccagttcctgctcagcgagttcgtgccaggtgctggcttcgtgctcggcctg180gtggacatcatctggggtatcttcggtccatcccaatgggacgccttcctggtgcaaatc240gagcagctgatcaaccagaggatcgaagagttcgccaggaaccaggccatctccaggctg300gagggcctgagcaacctctaccaaatctacgccgagagcttcagggagtgggaggccgac360ccgaccaacccagctctccgcgaggaaatgcgcattcaattcaacgacatgaacagcgcc420ctgaccaccgctatcccactgttcgccgtccagaactaccaagtgccgctcctgtccgtg480tacgtgcaagccgctaacctgcacctcagcgtgctgcgcgacgtgagcgtgttcggccaa540aggtggggcttcgatgctgccaccatcaacagccgctacaacgacctgaccaggctgatt600ggcaactacaccgaccacgctgtgcgctggtacaacaccggcctggagcgcgtctggggt660ccggactccagggactggatcaggtacaaccagttcaggagggagttgaccctcaccgtg720ctggacattgtgtccctcttcccgaactacgactccaggacctacccgatccgcaccgtg780tcccaactcaccagggagatctacaccaacccagtgctggagaacttcgacggtagcttc840cgcggttccgcccagggtatcgagggctccatcaggagcccacacctgatggacatcctg900aacagcatcaccatctacaccgacgctcacaggggcgagtactactggtccggccaccag960atcatggcctccccagtgggcttcagcggccccgagttcaccttcccgctctacggcacc1020atgggcaacgccgctccacagcaacgcatcgtggctcaactgggtcagggtgtctacagg1080accctgtcctccaccctgtacaggaggcccttcaacatcggtatcaacaaccagcaactg1140tccgtgctcgacggcaccgagttcgcctacggcacctcctccaacctgccatccgctgtc1200tacaggaagagcggcaccgtggactccctggacgagatcccaccacagaacaacaacgtg1260ccacccaggcaaggcttctcccacaggctgagccacgtgtccatgttccgctccggcttc1320agcaacagctccgtgagcatcatcagggctccgatgttctcctggatccaccgcagcgct1380gagttcaacaacatcatcgcctccgacagcatcacccaaatcccggccgtgaagggcaac1440ttcctcttcaacggttccgtcatttccggcccaggcttcaccggtggcgacctcgtgagg1500ctcaacagcagcggcaacaacatccagaacaggggctacatcgaggtgccaatccacttc1560ccatccacctccaccaggtacagggtgcgcgtgaggtacgcttccgtgaccccgatccac1620ctcaacgtgaactggggtaactcctccatcttctccaacaccgtgccagctaccgctacc1680tccctggacaacctccaatccagcgacttcggttacttcgagagcgccaacgctttcacc1740tcctccctcggtaacatcgtgggcgtgaggaacttcagcggcaccgccggcgtgatcatc1800gacaggttcgagttcatcccagtgaccgccaccctcgaggctgagtga1848
<210>2
<211>615
<212>PRT
<213>Artificial
<400>2
Met Asp Asn Asn 1
Ser Asn Pro Glu 20
Tyr Thr Pro lie 35
Glu Phe Val Pro 50
Pro 5
Val Asp Gly
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Glu
lie Ser
Ala Gly 55lie Asn Glu Val Leu
Leu
40
Phe
Gly
25
Ser
Cys 10 Gly
lie Pro
Glu Arg
Leu Thr Gln
Val Leu Gly Leu 60
Tyr
lie
Phe
45
Val
Asn Cys Leu 15
Glu Thr Gly 30
Leu Leu Ser Asp lie lie
8
權利要求
1.一種DNA分子，其特征是它編碼對鱗翅目害蟲高抗性的cryIAc基因mcrylAc，該DNA 分子具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.一種具備對鱗翅目害蟲高抗性的蛋白質，其特征是該蛋白質的核苷酸序列編碼序列如SEQ ID NOl所示。
3.一種植物表達載體，其特征是該植物表達載體含有在大腸桿菌和甘蔗中穿梭的雙元載體序列和權利要求1所述的基因序列。
4.如權利要求3所述的植物表達載體，其特征是，該載體由權利要求1所述的基因序列和大腸桿菌和甘蔗中穿梭的雙元載體序列構成。
5.一種使單子葉植物產生對鱗翅目害蟲抗性的方法，其特征是用權利要求4所述的植物表達載體轉化單子葉植物。
6.權利要求3所述的植物表達載體的應用，其特征是，將權利要求3所述的植物表達載體轉化甘蔗。
7.權利要求2所述的蛋白質的應用，其特征是，將權利要求2所述的蛋白質應用于抗鱗翅目害蟲。
8.如權利要求7所述的應用，其特征是，所述的鱗翅目害蟲是螟蟲。
全文摘要
本發明屬于基因工程和生物防治領域，具體涉及人工合成的Bt基因及其轉基因植株抗蟲性的應用。本發明提供了一種DNA分子，它編碼對鱗翅目害蟲高抗性的cryIAc基因mcry IAc，該DNA分子具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本發明還提供了相應的蛋白質及植物表達載體。本發明對cry IAc基因進行完全改造，選用植物偏愛的密碼子，去除了原序列中干擾基因在植物中表達的元件，由此獲得的高表達量的轉基因甘蔗品系，在溫室和田間實驗證明對鱗翅目害蟲具有天然的抗性。抗螟甘蔗品種選育將有助于減少螟蟲對甘蔗生產的威脅，減少化學農藥施用，保護生態環境，促進蔗糖業的可持續發展。
文檔編號A01N63/02GK102250923SQ201010178699
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月19日 優先權日2010年5月19日
發明者勞方業, 安玉興, 徐金玲, 李奇偉, 汪聯輝, 翁麗星, 鄧海華, 陳勇生, 陳建文, 齊永文 申請人:復旦大學, 廣州甘蔗糖業研究所