專利名稱：半滑舌鰨三倍體的誘導方法
技術領域：
本發明涉及一種魚類的養殖方法，特別是涉及一種三倍體半滑舌鰨的生產方法， 該技術屬于海洋生物技術領域。
背景技術：
半滑舌鰨味道鮮美、口感爽滑，是我國海水養殖業近年開發的養殖品種，具有很高的經濟價值。但半滑舌鰨雌雄生長差異大，雌性明顯快于雄性。雄性生長速度緩慢，經二年的培育也難達到商品魚規格，養殖者常在半年后把雄魚逐漸淘汰掉，而只留下雌魚養殖到商品規格。因此，實際成活率相當于雌魚的比例。人工育苗所獲得的魚苗中，雄性比例一般在60%以上，有時能多達到70%。50%以上的尾數在養殖半年以上后才被淘汰掉，使養殖成本大幅提高，養殖效益大幅度下降，嚴重地影響了養殖者的積極性。為解決這些問題，研究者們進行了許多有益的嘗試，主要集中在雌性單性化誘導及養殖環境的優化方面，但是至今沒有明顯的效果。但從國內外水產動物研究的趨勢來看， 三倍體技術是具有潛力的一種方法。三倍體水產動物由于具有不育性的特點，即性腺不能發育成熟或發育畸形，而不能繁殖后代，因此沒有性成熟或繁殖方面的能量損耗，避免了繁殖階段的生長停止或高死亡率。目前，三倍體水產動物在控制過度繁殖、加快生長速度等方面都顯示了良好的效果。因此根據半滑舌鰨的特性，開發一種誘導方法，獲得三倍體半滑舌鰨，回避雄性生長速度緩慢的缺點，以改善半滑舌鰨的生長速度，提高其經濟效益和社會效益是養殖業者的共同期盼。
發明內容
本發明旨在提供一種半滑舌鰨三倍體的誘導方法。本發明的步驟為1)選取性腺成熟的半滑舌鰨雄魚和雌魚，分別采集精液和成熟卵子；2)將精液與卵粒均勻混合，室溫靜置2min，加入海水進行人工受精；3)三倍體獲得將受精后2-lOmin的受精卵轉移至0-10°C海水浴中進行冷休克 15-55min，抑制第二極體的形成及其排出，使染色體組加倍。4)、解除休克將卵移至常溫海水中孵化，按照普通半滑舌鰨苗種生產方法管理，培育半滑舌鰨三倍體魚苗。在步驟2)中，海水水溫為20-25°C。在步驟3)中，海水中起始冷休克的時間為受精后2-8min;冷休克持續時間為 15-55min ；冷休克溫度為3_8°C。在步驟4)中，海水孵化的溫度為20_25°C。更優選地，步驟3)中，海水中起始冷休克的時間為受精后6-8min;冷休克持續時間為20-40min，冷休克溫度為4-6°C ；步驟4)中，海水孵化的溫度為22°C。 采用上述方法誘導，能夠得到較高的誘導率。本發明的進一步方案為誘導得到三倍體半滑舌鰨后，利用染色體核型分析、流式細胞儀等技術測定上述魚體的染色體倍數，鑒別、篩選出三倍體半滑舌鰨進行培育。本發明的有益效果在于1.本發明通過利用低溫休克方法進行誘導，并通過控制誘導持續時間，抑制第二極體釋放，從而大大提高三倍體半滑舌鰨的誘導率，據實驗統計，所獲得的三倍體半滑舌鰨的人工誘導率可達80%以上。2.本發明工藝簡單，成本低，可操作性強，避免了化學方法進行誘導帶來的污染。3.采用本發明所述方法培育的三倍體半滑舌鰨，具有生長速度快、個體規格大、養殖成活率高，抗病能力強等優點，具有良好的經濟效益和社會效益。在半滑舌鰨三倍體誘導中，其中最優選的誘導條件為，選取性腺成熟的半滑舌鰨雌魚和雄魚，分別采集成熟卵和精液，人工受精，受精后 Smin用4°C的海水浴冷休克處理30min，抑制第二極體排出，然后在22°C的海水中孵化，完成冷休克法的三倍體誘導。采用該條件進行半滑舌鰨的三倍體誘導，實驗結果表明，受精率=34. 1%，孵化率 =82. 45%，三倍體率達88%。三倍體半滑舌鰨誘導中，孵化率較低影響了三倍體誘導率的進一步提高，即使在本發明的實驗條件下，一般孵化率也只在50%左右，然而該條件下誘導，并不影響其孵化率。
圖1半滑舌鰨二倍體魚苗細胞DNA熒光分布直方2半滑舌鰨三倍體魚苗細胞DNA熒光分布直方圖
具體實施例方式以下實驗例和實施例將對本發明做進一步的說明。實驗例1半滑舌鰨三倍體的倍性鑒定采用德國Partec公司Cystain DNA 1 st印染液一步法染色，通過流式細胞儀測定細胞DNA含量來鑒定倍性。1、組織細胞懸液制備及測定采用隨機抽取方式對60日齡半滑舌鰨三倍體進行鑒定，每次以4尾二倍體作為對照。(1)組織細胞提取及DNA熒光染色取每一尾魚的活體尾鰭約1mm3，放入1. 5mL微量離心管中，加入Cystain DNA 1 st印染液0. 5ml，剪碎尾鰭組織至肉眼看不見塊狀物， 再輕輕研至均漿狀；用300目德國Partec公司生產的細胞過濾網過濾，再向濾液中加入 CystainDNA 1 st印染液0. 5ml，進一步染色。(2)流式細胞儀測定PARTEC為德國Partec Gmbh公司生產，型號PA，該機激發光源為負離子激光器。測量前，用鞘液調整細胞濃度在IX 106個/ml左右，測量時保持測量速率在200 300個/S。選正常二倍體細胞懸液為對照樣品。(3)檢測控制測定前調校流式細胞儀使管道暢通，噴嘴清潔，儀器處于最佳狀態，進行FL0WCHECK校正，使各通道的變異系數(CV)穩定在3%以下，DNA含量由儀器自動檢出。通過控制流速保持細胞分離純度。2、檢測原理與表示方法以二倍體對照組細胞為參考計算二倍體和三倍體頻率，細胞DNA含量以DNA指數 (DNAindex, DI)表示。DI =處理組細胞G0/1峰值道數/對照組細胞G0/1峰值道數均值以DI = 1. 0士0. 1為DNA 二倍體的判斷標準。如果DI = 1. 5士0. 1，則為三倍體。對三倍體處理組與二倍體對照組的DNA進行分析(表1)，結果表明二者細胞DNA 的G0/1峰值道數差異顯著。流式細胞儀給出的對照組與三倍體處理組細胞DNA含量熒光分布直方圖見圖1和圖2。表1三倍體處理組與二倍體對照組的DNA比較(均值士標準差)
權利要求
1.一種半滑舌鰨三倍體的誘導方法，其特征在于包括如下步驟1)選取性腺成熟的半滑舌鰨雄魚和雌魚，分別采集精液和成熟卵子；2)將精液與卵粒均勻混合，攪拌后室溫靜置2min，加入海水進行人工受精；3)三倍體獲得將受精后O-IOmin的受精卵轉移至2-10°C海水浴中進行冷休克處理 15-55min,使染色體組加倍。4)解除冷休克將卵移至海水中孵化，按照普通半滑舌鰨苗種生產方法管理，培育半滑舌鰨三倍體魚苗。
2.如權利要求1所述的半滑舌鰨三倍體誘導方法，其特征在于步驟2)中，海水水溫為20-25 °C。
3.如權利要求1所述的半滑舌鰨三倍體誘導方法，其特征在于海水中起始冷休克的時間為受精后2-8min ；冷休克持續時間為15-55min ；冷休克溫度為 3-8"C。
4.如權利要求1所述的半滑舌鰨三倍體誘導方法，其特征在于步驟4)中，海水孵化的溫度為20-25°C。
5.如權利要求1所述的半滑舌鰨三倍體誘導方法，其特征在于海水中起始冷休克的時間為受精后6-8min ；冷休克持續時間為20-40min，冷休克溫度為 4-6 °C ；
6.如權利要求1所述的半滑舌鰨三倍體誘導方法，其特征在于步驟4)中，海水孵化的溫度為22°C。
7.如權利要求1所述的半滑舌鰨三倍體誘導方法，其特征在于選取性腺成熟的半滑舌鰨雌魚和雄魚，分別采集成熟卵和精液，人工受精，受精后 2-10min用3°C的海水冷休克處理18min，抑制第二極體排出，然后在22°C的海水中孵化。
8.如權利要求1所述的半滑舌鰨三倍體誘導方法，其特征在于選取性腺成熟的半滑舌鰨雌魚和雄魚，分別采集成熟卵和精液，人工受精，受精后4min 用8 V的海水浴冷休克處理25min，抑制第二極體排出，然后在22°C的海水中孵化，完成冷休克法的三倍體誘導。
9.如權利要求1所述的半滑舌鰨三倍體誘導方法，其特征在于選取性腺成熟的半滑舌鰨雌魚和雄魚，分別采集成熟卵和精液，人工受精，受精后Smin 用4°C的海水浴冷休克處理30min，抑制第二極體排出，然后在22°C的海水中孵化，完成冷休克法的三倍體誘導。
全文摘要
一種半滑舌鰨三倍體的誘導方法，該技術屬于海洋生物技術領域。其主要步驟為選取發育成熟的半滑舌鰨雌魚和雄魚，分別采集成熟卵和精液，人工受精，受精后2-10min用2-10℃的海水冷休克處理15-55min，然后在20-25℃的海水中孵化，完成冷休克法的三倍體誘導。本方法發明工藝簡單，成本低，可操作性強，并且大大提高三倍體半滑舌鰨的誘導率，據實驗統計，所獲得的三倍體半滑舌鰨的人工誘導率可達80％以上，三倍體半滑舌鰨的人工誘導率最高可達88％，具有良好的經濟效益和社會效益。
文檔編號A01K61/00GK102246708SQ201010175409
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月18日 優先權日2010年5月18日
發明者侯吉倫, 劉永新, 劉海金, 張曉彥, 楊立更, 王玉芬, 趙文江 申請人:中國水產科學院研究院, 中國水產科學院研究院北戴河中心實驗站