專利名稱：：一種春蘭名品莖尖組織培養快速繁殖方法
技術領域：
：本發明屬于植物生物
技術領域：
，是通過植物組織培養技術的無性繁殖方法，具體為春蘭名貴品種的莖尖組織培養快速繁殖方法。
背景技術：
：春蘭(Cymbidiumgoeringii)屬蘭科蘭屬的地生蘭，為多年生常綠草本植物，春蘭花香馥郁，葉姿優美，花與葉均具觀賞性，極富雅韻之態，為中國的十大名花之一。春蘭主要分布于我國東南和西南地區，浙江省是春蘭的主產區，栽培歷史悠久，品種數多達300個左右，但由于春蘭生長緩慢，單株每年只萌發03個新芽，依靠分株方法，繁殖系數低，一些傳統名品如“綠云”、“宋梅”、“大富貴”、“龍字”、“集圓”等，盡管流傳已久，但至今仍數量有限，單株價格成百上千，難以成批量見諸于市場，國蘭中不少珍品，更是千金難求。春蘭分株繁殖速度慢，且長期分株，植株易帶病毒，導致種性退化，這都不利于名貴品種的普及和新品種的推廣，已成為春蘭名品工廠化大規模生產的一個瓶頸。植物組織培養技術是快速育苗的有效方法，已在園藝、林木等領域得到了廣泛的應用。利用組織培養方法快速繁殖春蘭名品的種苗，是提高春蘭名品的質量和數量，獲得大量性狀整齊一致的種苗的最佳方法。本發明針對幾種不同瓣型和花色的春蘭名品，已成功研發出用春蘭的莖尖為材料，進行新芽切割、消毒、莖尖剝取、根狀莖誘導、增殖、芽誘導、生根壯苗和試管苗移栽等春蘭組培快繁的一系列關鍵技術，解決了春蘭名品大規模生產的技術瓶頸，為傳統名花早日實現產業化生產打下了堅實的基礎，該技術方法具有較好的應用和推廣意義。
發明內容本發明的目的是針對春蘭名品的組培快繁中，如何解決莖尖初代培養中易污染褐變，啟動誘導根狀莖難度大和時間長，根狀莖增殖和芽分化的細弱，生根壯苗率和移栽成活率低等技術問題，提出一種既能解決上述技術難點，又能降低生產成本，實現春蘭名品規模化優質組培苗生產的方法，即一種春蘭名品莖尖組織培養快速繁殖方法。具體通過新芽切割、新芽消毒與莖尖剝取、根狀莖誘導、增殖、芽誘導、生根壯苗培養和試管苗移栽等步驟來實現本發明的目的。本發明一種春蘭名品莖尖組織培養快速繁殖方法，按以下步驟進行(1)新芽切割新芽切割時間以秋發新芽和冬發新芽為好，消毒和接種后不易污染；切割時盡量保證新芽的完整性，以免生長點受損，影響莖尖剝取和根狀莖誘導。春蘭新芽的萌發季節主要在春季，以春季的萌發數最多，只有栽培好的才會在秋季和冬季也有新芽萌發。在新芽高度、氣溫與污染率三者的關系方面，2月上旬，春芽未出土，芽高12cm時，氣溫低，芽小，病菌感染較少，消毒接種較不易污染褐變，到34月份，春芽已抽生出土，芽高34cm，氣溫升高，芽大，前期感染病菌的機會增多，消毒較難把握，消毒不夠易污染，消毒過頭，易褐變死亡；10月份的秋芽和12月份的冬芽，營養貯藏豐富，且氣溫降低，病菌減少，消毒接種不易污染褐化。秋芽和冬芽被切割后，養護管理跟上，還不影響春芽的萌發。切割芽時，必須脫盆，去掉新芽周邊的土壤，看清楚芽基部的狀況，用鋒利的手術刀緊貼新芽基部切下，要盡量保證新芽的完整度，以免生長點受損，而影響莖尖的剝取和進一步的根狀莖誘導。(2)新芽消毒與莖尖剝取新芽消毒以0.氯化汞溶液效果最好，對新生組織的刺激少，易成活；消毒方法采用二次消毒法，即新芽先剝取大些，用氯化汞消毒58分鐘，再剝取到要接種的大小，以0.40.8cm高度的莖尖為宜，用氯化汞消毒1分鐘，沖洗凈殘液后，直接接入培養基。取春蘭名品的新芽為外植體，消毒時，先將新芽表面初步沖洗干凈，用70%醫用酒精藥棉擦拭后，放于燒杯中，加200ml自來水，水中滴入23滴洗潔精或吐溫-80，搖動均勻，杯口蓋好紗網，浸泡30分鐘，用自來水流水沖洗24小時，蒸餾水浸泡5分鐘和沖淋3次，放到超凈臺上，用70%醫用酒精藥棉擦拭新芽后，放在無菌慮紙上，用槍式鑷子和手術刀先剝去最外面的1層包葉后，新芽浸泡于70%醫用酒精中0.51分鐘，無菌水沖洗3次，再用二次消毒法進行消毒，即醫用酒精浸泡后的新芽，用0.氯化消毒58分鐘，無菌水沖洗5次，在無菌濾紙上一層層小心剝去包葉，并將基部切口褐化部分切去一段，剝到0.40.8cm大小的莖尖，再用0.氯化汞消毒1分鐘，無菌水沖洗5次后，直接接入誘導根狀莖培養基。比較次氯酸鈉、次氯酸鈣、雙氧水和施康等消毒液，結果表明以0.氯化汞消毒效果最好，不易污染，對新生組織的刺激少，易成活。春蘭初代建立時要特別注意消毒方法和莖尖切割的大小，莖尖接種一旦被污染，沒有任何補救辦法，只能失敗告終，我們試驗剝取莖尖大小以0.40.8cm為好，莖尖大小與污染率和生長速度成正比，春蘭名貴品種生長相對緩慢，莖尖剝取太小，即使沒有污染，也容易逐漸褐變死亡，以略偏大些為好，但若莖尖剝取太大，消毒不夠徹底，則容易污染死亡。(3)莖尖誘導根狀莖莖尖剝取大小在0.40.8cm高度合適，太小易褐變死亡，太大易污染死亡；莖尖剛接入培養基時，要放在培養溫度1520°C的黑暗條件下培養715天，以減少其在高溫和強光下易褐變的可能性，可以防止莖尖褐變死亡然后放到光照強度800lOOOlux的散射光或單支日光燈下培養34個月，光照12小時/天，可以在莖尖基部誘導出叢生狀的根狀莖。誘導根狀莖培養基配方:1/2MS+NAA36mg/l+IBA0.5lmg/l+CM1015%+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+瓊脂810g/l,pH5.4，其中1/2MS是指MS(Murashige-Skoog1962)基本培養基的母液1、母液2和母液3等大量元素母液的用量減半，其它鐵鹽、微量元素和維生素母液用量保持不變。CM為新鮮椰乳，如果條件有限，也可以用市售的椰子粉2030g/l替代。(4)根狀莖增殖初代獲得的根狀莖長至1cm左右時，可以接入增殖培養基，每個隔23個月司可繼代一次，通過反復分割繼代培養，可獲得大量的根狀莖，培養溫度2025°C，在光強800lOOOlux的散射光或單支口光燈下培養，光照12小時/天。增殖培養基配方1/2MS+NAA34mg/l+BA0.10.2mg/l+PT23g/l+活性炭2g/1+蔗糖20g/l+瓊脂810g/l，pH5.4，添加外源營養物質蛋白胨(PT)，可以使根狀莖生長更粗壯。(5)根狀莖誘導芽當根狀莖長至1.52cm長時，可以接入誘導芽培養基，培養溫度2025°C，在光強25001uX左右的雙支日光燈下培養，光照12小時/天，培養23個月后，在根狀莖的頂端和側面有芽點抽出，伸長，當芽高約4cm時可轉至生根壯苗培養。誘導芽培養基配方1/2MS+NAA0.20.5mg/l+BAl2mg/l+KT0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂810g/l，pH5.4，注意誘導芽培養基不需要添加活性炭，它會嚴重抑制芽的生長。(6)生根壯苗培養當芽高約4cm時可轉至生根壯苗培養，放在溫度2025°C，光強25001UX的雙支日光燈，光照12小時/天的條件下培養23個月，在培養后期的12個月，可放在溫室內，靠自然光照培養，可以節省能源。生根壯苗培養基1/2MS+NAA12mg/l+IBA0.20.5mg/l+BA0.20.5mg/l+活性炭23g/l+蔗糖20g/l+瓊脂810g/l，pH5.4，在生根壯苗階段，如果有條件，可以添加3050g/l的椰子粉，能使根更加粗壯些。(7)試管苗移栽待小苗高67cm，有23條根時，根苗茁壯，即可移栽，移栽前要開瓶口煉苗710天，移栽介質以珍珠巖蛭石=32的組合為好，介質干凈，使新生苗不易受微生物影響而爛根，介質的透氣和保水性兼顧，小苗易成活，注意掌握好溫度、光照、水分、空氣濕度、肥料和病蟲害預防等栽培條件。移栽具體方法是開瓶口煉苗710天，在有細孔的塑料筐內裝滿介質(珍珠巖和蛭石以32混合為好)，將洗凈根部瓊脂的小苗種植于筐內，介質填埋于根莖部位，不要種植太深，以防止通氣不夠，引起莖腐爛，種好后先放置在高濕弱光(15001UX)條件緩苗1015天，以后放在15°C25°C，空氣相對濕度70%左右，光線稍強的條件下養護，12個月噴施1/1000的營養液和抗菌劑，控制澆水量為栽種的秘訣，成活率可達8590%，蘭苗年生長量達58cm，經35年種植可開花。與現有技術相比，本發明具有以下優點和效果(1)本發明極大的提高了春蘭名品的繁殖系數。目前春蘭主要還是依靠傳統分株法繁殖，一年能發03個芽，繁殖速度慢，難以滿足大規模生產和消費的需求，本發明利用莖尖為外植體，一旦無性系建立，繁殖量呈平方數增加，能為大規模生產提供高質量的種田o(2)本發明以名貴春蘭的秋發和冬發新芽莖尖為外植體，通過根狀莖進行增殖，保證了品種的遺傳穩定性，試管繁殖23年后可以再次通過莖尖更新無性系，從而使此法具有很高的商業價值。(3)本發明采用獨特的0.氯化汞溶液的二次消毒法，即對略加清洗的大芽先消毒58分鐘，再對剝成的莖尖再消毒1分鐘，這對蘭花莖尖的刺激少，消毒效果好，不易污染，較好地解決了地生蘭難消毒，消毒時間短易污染，時間長不污染，但易褐變死亡等。(4)本發明將初代接種的莖尖放在1520°C的黑暗條件下培養715天，可以減少其剛開始培養時在25°C左右和25001UX光照下易發生褐變的可能性。(5)本發明篩選優化的莖尖誘導根狀莖、根狀莖增殖、根狀莖誘導芽和生根壯苗的四種培養基，有著簡便易配制，莖尖誘導根狀莖率高的特點，已建立了宋梅、大富貴、逸品、集圓、蒼巖素和元紅等春蘭名品的無性系，并可舉一反三，適當修改后使用，使得本發明具有較高的應用和推廣價值。(6)為了降低在生產上應用的成本，本發明進行了簡化試驗，如培養基添加白糖替代蔗糖，減少10倍的開銷，根狀莖增殖采用明亮的散射光，生根壯苗后期放在溫室中可利用自然光照，均取得較好的增殖率和壯苗率，這使得組培中大量耗電的普遍問題，得到一定的解決，能節約能源，簡化試驗有效地降低了蘭花組培苗的生產成本。(7)本發明篩選出適宜春蘭試管苗煉苗的條件和移栽介質，如整齊一致的標準苗，現經過開瓶口煉苗，再出瓶移栽，珍珠巖和蛭石的組合介質，干凈膨松，兼顧通氣性和保水性，有利于根系進一步生長，試管苗成活率可達8590%。圖1為春蘭名品宋梅新芽。圖2為宋梅莖尖剝取。圖3為宋梅莖尖接種。圖4為宋梅根狀莖的誘導。圖5為宋梅根狀莖的增殖。圖6為宋梅根狀莖誘導芽。圖7為宋梅生根壯苗培養。圖8為宋梅試管苗移栽。具體實施例方式本發明結合附圖和實施例作進一步的說明，但本發明的內容不是僅限于此。實施例一春蘭名品“宋梅”的莖尖組織培養快速繁殖方法(1)新芽切割時間在1月底，方法是蘭株脫盆，去掉新芽周邊的土壤，看清楚芽基部的狀況，用鋒利的手術刀緊貼新芽基部切下，要盡量保證新芽的完整度，以免生長點受損，新芽高2厘米左右(見圖1)，蘭株晾放30分鐘后，種回盆中。(2)新芽消毒與莖尖剝取將宋梅新芽表面初步沖洗干凈，用70%醫用酒精藥棉擦拭后，放于燒杯中，加200ml自來水，水中滴入23滴吐溫-80，搖動均勻，杯口蓋好紗網，浸泡30分鐘，用自來水流水沖洗24小時，蒸餾水浸泡5分鐘和沖淋3次，放到超凈臺上，用70%醫用酒精藥棉擦拭新芽后，放在無菌慮紙上，用經火焰消毒過的槍式鑷子和手術刀先剝去最外面的1層包葉后，新芽浸泡于70%醫用酒精中30秒鐘，無菌水沖洗3次，用0.1%氯化汞消毒5分鐘，無菌水沖洗5次，在無菌濾紙上一層層小心剝去包葉，并將基部切口褐化部分切去一段，剝到0.6cm大小的莖尖(見圖2)，再用0.氯化汞消毒1分鐘，無菌水沖洗5次后，直接接入誘導根狀莖培養基(見圖3)。(3)莖尖誘導根狀莖接有莖尖的培養瓶要放在1520°C的黑暗條件下培養715天，以減少其在高溫和強光下易褐變的可能性，然后放到光強8001ux的散射光下培養34個月，光照12小時/天，可以在莖尖基部誘導出叢生狀的根狀莖(見圖4)。誘導根狀莖培養基配方l/2MS+NAA4mg/l+IBA0.5mg/l+CM10%+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+瓊脂10g/1，pH5.4，其中1/2MS是指MS(Murashige-Skoog1962)基本培養基的母液1、母液2和母液3等大量元素母液的用量減半，其它鐵鹽、微量元素和維生素母液用量保持不變。CM為新鮮椰乳，如果條件有限，也可以用市售的椰子粉20g/l替代。(4)根狀莖增殖初代獲得的根狀莖長至lem左右時，可以接入增殖培養基，每個隔2個月可繼代一次(見圖5)，通過反復分割繼代培養，可獲得大量的根狀莖，培養溫度2025°C，在光強lOOOlux的散射光或單支日光燈下培養，光照12小時/天。增殖培養基配方l/2MS+NAA3mg/l+BA0.lmg/l+PT2g/l+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+瓊脂10g/l,pH5.4，添加外源營養物質蛋白胨(PT)，可以使根狀莖生長更粗壯。(5)根狀莖誘導芽當根狀莖長至1.52cm長時，可以接入誘導芽培養基，培養溫度2025°C，在光強2500lux左右的雙支日光燈下培養，光照12小時/天，培養2個月后，當芽高約4cm時可轉至生根壯苗培養(見圖6)。誘導芽培養基配方1/2MS+NAA0.2mg/l+BA2mg/l+KT0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂10g/l,pH5.4。(6)生根壯苗培養當芽高約4cm時可轉至生根壯苗培養，放在溫度2025°C，光強25001UX的雙支日光燈，光照12小時/天的條件下培養3個月(見圖7)，在培養后期的1個月，可放在溫室內，靠自然光照培養，可以節省能源。生根壯苗培養基l/2MS+NAA2mg/1+IBA0.2mg/l+BA0.2mg/l+活性炭3g/l+蔗糖20g/l+瓊脂10g/l，pH5.4，在生根壯苗階段，如果有條件，可以添加30g/l的椰子粉，能使根更加粗壯些。(7)試管苗移栽當小苗高7cm左右，根數23條，葉片34片，根苗茁壯，即可移栽。開瓶口煉苗715天，在10X5的穴盤中裝滿介質(珍珠巖和蛭石32混合)，將洗凈根部瓊脂的小苗種植于筐內，介質填埋于根莖部位，種好后先放置在高濕弱光(15001UX)條件緩苗1015天，以后放在15°C25°C，空氣相對濕度70%左右，光線稍強的條件下養護，12個月噴施1/1000的營養液和抗菌劑，控制澆水量為栽種的秘訣，成活率可達8590%(見圖8)。實施例二春蘭名品“元紅”莖尖組培快繁中白糖代替蔗糖的降低成本方法蔗糖價格約為白糖的10倍，若能替代，可有效降低生產成本。培養3個月后調查數據，從表1、表2、表3看出，使用白糖效果優于蔗糖或相近，結果表明根狀莖增殖可選用白糖20g/l，根狀莖誘導芽和根狀莖直接誘導生根壯苗，要求碳水化合物營養高些，可選用白糖30g/l。(1)根狀莖增殖選用長度1cm無分叉的根狀莖頂端為材料，從表1看，糖濃度梯度對增殖數沒有顯著的影響，蔗糖間差值為17條，白糖間差值為7條，以白糖20g/l最高達218條；而糖濃度對生長量(鮮重)有比較大的影響，濃度高，生長量多，蔗糖30g/l比20g/l增加0.lg,20g/l比10g/l增加1.4g，差14倍，白糖30g/l比20g/l增加0.19g，20g/l比10g/l增加1.67g，差8.79倍，以白糖20g/l最高達5.37g。說明白糖優于蔗糖，20g/l的濃度最經濟。表1糖處理對根狀莖增殖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注每處理調查6瓶，每瓶接種4條，總根狀莖數24條，鮮重0.183g/瓶，根狀莖長lcm，無分叉。(2)根狀莖誘導芽選用長度1.52cm有35個分叉的根狀莖頂端為材料，從表2看，蔗糖和白糖30克/升時，最高芽的平均數和生長量(總鮮重)都是最高的，蔗糖比白糖在總芽數上多13個，最高芽的平均數高0.046cm，生長量(總鮮重)重0.78g。從價格產出比看，用30克/升的白糖代替蔗糖還是可行的。表2糖處理對根狀莖誘芽的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注每處理調查6瓶，每瓶接種4條，總根狀莖數24條，鮮重0.275g/瓶，根狀莖長1.52cm，有3-5個分叉。(3)根狀莖直接誘導生根壯苗選用長度1.52cm有35個分叉的根狀莖頂端為材料，從表3看，在直接成苗上，用白糖30g/l較好，總芽數為19個，總根數14條，成苗數6株，成苗率為2.56%。從成苗率看，生長3個月，根狀莖直接成苗數極少，小苗達不到移栽標準，無法獲得批量整齊的優質試管苗，說明想過度節約成本而缺少根狀莖誘導芽這一步驟，來直接生根成苗行不通，用白糖20克/升時反而根狀莖增殖數最高達262條。表3糖處理對根狀莖生根壯苗的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注每處理調查6瓶，每瓶接種4條，總根狀莖數24條，鮮重0.275g/瓶，根狀莖長1.52cm，有3-5個分叉。無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可應用本發明對春蘭名品進行莖尖組織培養快速繁殖。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的范圍。權利要求一種春蘭名品莖尖組織培養快速繁殖方法，是以春蘭品種的莖尖為外植體，包括新芽切割、新芽消毒與莖尖剝取、根狀莖誘導、根狀莖增殖、根狀莖芽誘導、生根壯苗培養和試管苗移栽，其特征在于，莖尖誘導根狀莖、根狀莖增殖、根狀莖誘導芽和生根壯苗四個過程的不同培養基選用(1)莖尖誘導根狀莖1/2MS+NAA3～6mg/l+IBA0.5～1mg/l+CM10～15％+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+瓊脂8～10g/l，pH5.4；(2)根狀莖增殖1/2MS+NAA3～4mg/l+BA0.1～0.2mg/l+PT2～3g/l+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+瓊脂8～10g/l，pH5.4；(3)根狀莖誘導芽1/2MS+NAA0.2～0.5mg/l+BA1～2mg/l+KT0.2～0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂8～10g/l，pH5.4；(4)生根壯苗1/2MS+NAA1～2mg/l+IBA0.2～0.5mg/l+BA0.2～0.5mg/l+活性炭2～3g/l+蔗糖20g/l+瓊脂8～10g/l，pH5.4。2.根據權利要求1中所述一種春蘭名品莖尖組織培養快速繁殖方法，其特征在于，新芽切割時間選擇秋發新芽或冬發新芽，切割時盡量保證新芽的完整性。3.根據權利要求1中所述一種春蘭名品莖尖組織培養快速繁殖方法，其特征在于，新芽消毒選用0.氯化汞溶液，消毒方法采用二次消毒法，即新芽先剝取大些，用氯化汞消毒58分鐘，再剝取到0.40.8cm高度的莖尖，用氯化汞消毒1分鐘，沖洗凈殘液后，直接接入培養基。4.根據權利要求1中所述一種春蘭名品莖尖組織培養快速繁殖方法，其特征在于，誘導根狀莖時，當0.40.8cm高度的莖尖接入培養基時，要放在黑暗條件下培養715天，然后放到光照強度800lOOOlux的散射光或單支日光燈下培養，培養溫度在1520°C。5.根據權利要求1中所述一種春蘭名品莖尖組織培養快速繁殖方法，其特征在于，試管苗移栽時，待小苗高67cm，有23條根時移栽，移栽前要開瓶口煉苗710天，移栽介質選用珍珠巖蛭石=32的組合介質。全文摘要本發明提供一種春蘭名品莖尖組織培養快速繁殖方法，以春蘭名貴品種的新芽莖尖為外植體，包括莖尖誘導根狀莖培養、根狀莖繼代增殖培養、根狀莖誘導芽培養、生根壯苗培養以及試管苗移栽煉苗培養等步驟，在新芽切割、消毒和莖尖剝取，根狀莖誘導、增殖、芽分化和生根壯苗等培養階段選擇優化培養基，從而使得春蘭名貴品種能夠實現種苗快速繁殖，獲得量多、質優、價廉的種苗，為春蘭的工廠化生產奠定基礎。本發明的方法，可操作性強，較好的解決了春蘭依靠傳統分株法，繁殖速度慢，易退化等問題，可以逐步實現商品性好的春蘭品種的產業化生產，該方法具有較高的應用和推廣價值。文檔編號A01H4/00GK101822220SQ20101016954公開日2010年9月8日申請日期2010年5月11日優先權日2010年5月11日發明者夏宜平,李方,柴明良,陳昆松,黃焱申請人:浙江大學