專利名稱：一種高效誘導結球甘藍雙單倍體的方法
技術領域：
本發明涉及植物的雙單倍體(DH)誘導方法，特別是涉及園藝作物結球甘藍小孢子植株再生及其雙單倍體的高效誘導方法及其和培養基。
背景技術：
結球甘藍是一種栽培面積大，適應性廣、營養價值高，深受人民喜愛的食用蔬菜， 但由于原產于地中海沿岸，國內種質資源匱乏，而國外表現優勢的品種及親本資源又難以獲得，一直制約著我國甘藍優良品種選育工作的開展，若通過雙單倍體育種則必然為優良種質資源的獲得和新品種培育創建了一種新的有效途徑，也必然會大大提高育種選擇效率，縮小育種群體規模，縮短育種年限。同時，利用雙單倍體培養的變異能夠創造許多抗病、 耐鹽、抗旱、抗蟲等優良種質資源；該技術又可以和轉基因技術、分子標記技術相結合，能有效推進相關研究和分子育種技術，具有廣闊的應用前景。但我國的結球甘藍小孢子培養技術尚不夠成熟，大多處在對近緣種培養技術的消化吸收及其有限改進上，效果欠佳，要么受基因型的限制，常不能出胚，或出胚量很少；要么成胚成苗過程易玻璃化，苗小根弱，移栽成活率低，遠遠不能滿足大規模產胚并高效育種的要求。
發明內容
本發明的目的在于克服上述缺點，提供一種高效誘導結球甘藍雙單倍體的方法。 該方法涉及園藝作物結球甘藍的小孢子植株再生及其雙單倍體的誘導技術改進。一種高效誘導結球甘藍雙單倍體的方法，采用的技術方案和具體操作步驟如下(1)花蕾的選取和小孢子的分離選取處于單核靠邊期的花蕾，將其消毒處理后在分離培養基中進行無菌破碎，離心分離后獲得小孢子，所述分離培養基為含蔗糖濃度為140-170mg/L的B5液體培養基；(2)誘導加倍成胚培養對分離后的小孢子進行誘導加倍培養，首先在啟動培養基中同步進行啟動培養和加倍誘導，30-35°C的溫度下暗培養M-72小時，所述啟動培養基為含有0. 5-100ppm秋水仙素加倍劑且蔗糖濃度為150-180g/L的NLN液體培養基；將小孢子膨大率達70%的樣品離心，棄上清液后添加成胚誘導培養基懸浮，其中，小孢子的懸浮密度為5X 104-5X IO5 個/mL，然后進行成胚誘導暗培養，培養溫度為22-25°C，所述成胚誘導培養基為含有 0. Ol-Ippm的6-芐氨基嘌呤和/或0. 01-0. 5ppm的α -萘乙酸且蔗糖濃度為130_150g/L 的NLN液體培養基；(3)分化成苗與繼代培養A、分化成苗階段待胚狀體至肉眼可見后將其轉到溫度為2048°C、轉速為60rpm 的搖床上旋轉培養1-3周，然后將胚狀體接種于分化培養基上進行分化成苗，所述的分化培養基為含0. Ol-Ippm的6-芐氨基嘌呤和/或0. 01-0. 5ppm的α -萘乙酸，9_15g/L瓊脂的B5固體培養基；B、繼代培養階段待成正常試管苗后，再轉接至繼代培養基上進行繼代壯苗培養，所述的繼代培養基為含0. 01-0. 5ppm多效唑的B5固體培養基；分化成苗和繼代培養兩階段的培養條件為溫度22-25°C，光周期12-20h/d，光照強度1500-4000LUX ；(4)壯苗生根培養待胚狀體分化出莖葉，并成壯苗后，將其移至生根培養基上進行壯苗生根培養，直至苗壯根粗后移栽大田，所述生根培養基為含0. 01-0. 5ppm多效唑、0. 01-0. 5ppm α -萘乙酸的MS固體培養基。步驟(1)中所述花蕾大小為3. 5-5. 5mm，且小孢子發育時期在單核靠邊期的比例達70%以上。所述成胚誘導培養基中優選含有0. 1-0. 2ppm的6_芐氨基嘌呤和0. 01-0. 02ppm 的α-萘乙酸。所述分化培養基中優選含有0. 1-0. 2ppm的6_芐氨基嘌呤和0. 01-0. 02ppm的 α-萘乙酸。本方法適用于多種基因型，如Q2、Q4、Q5、Q8、ΗΡ63和HW06，效果均較好。本發明的有益效果(1)基因型適應性廣，受植物生長環境影響小，可以在人工氣候箱、玻璃溫室、大田等多種生長環境下對各種基因型材料進行誘導培養，出胚率高，可大批量規模化生產雙單胚體；( 小孢子胚誘導和加倍可一次實現，時間短、費用低、加倍效率高，可直接獲得雙單倍體頻率達50% -90%以上，克服了根、芽加倍效率低，處理繁瑣，藥品消耗多、有毒污染大等諸多弊端；同時在啟動培養基中添加加倍劑不僅使加倍誘導一次完成，而且大大提高了小孢子的膨大率，并使出胚率成倍提高；C3)能有效消除分化成苗過程的玻璃化問題；苗子表現綠壯，個體干重增加，抗逆能力增強，成株率高；同時生根后苗壯根粗，大田移栽成活率高；另外還減少了繼代培養頻次，節約了成本，降低了因頻繁繼代所產生的不可避免的污染，減少了 DH植株的無謂損失。
圖1是誘導加倍成胚培養后NLN液體培養中的胚狀體；圖2是胚狀體轉至B5固體分化培養基上分化顯綠圖；圖3是胚狀體在B5固體分化培養基上培養30天后形成的葉、莖、芽圖；圖4是壯苗生根圖。
具體實施例方式實施例1本實施例中所用各種培養基的配方見表1。本實施例選用了基因型為Q2、Q4、Q5、Q8、HP63和HW06的幾種結球甘藍作為原材
料，按照如下步驟進行結球甘藍雙單倍體的誘導和培養，同時設立對照組，對照組中啟動培養基中無秋水仙素加倍劑，繼代和生根培養基中無多效唑(1)花蕾的選取和小孢子的分離待生長在人工氣候箱、玻璃溫室和大田自然環境下的結球甘藍至初花期，結合鏡檢觀察花蕾大小在3. 5-5. 5mm范圍，確定小孢子發育時期在單核靠邊期的比例達70%以上時，選取對應花蕾裝入鋼籃中，用70%酒精滅菌30秒后，然后用0. 升汞消毒8-10分鐘， 無菌水清洗3次，在分離培養基中搗碎，在無菌條件下將游離出的小孢子離心清洗。(2)誘導加倍成胚培養首先將小孢子在啟動培養基中同步進行啟動培養和加倍誘導暗培養，溫度 32-33°C，時長36-48小時；鏡檢，對小孢子膨大率達到70%以上的樣品進行離心，去上清， 新添成胚誘導培養基懸浮，其中，小孢子的懸浮密度為IOX IO4個/mL，暗培養兩周左右，培養溫度為22-25°C ；(3)分化成苗培養待胚狀體至肉眼可見后將其轉到溫度為25°C、轉速為60rpm的搖床上旋轉培養1-2周，胚狀體見圖1，然后將胚狀體接種于分化培養基上進行分化成苗，培養溫度為 22-25°C，光周期為16-20h/d，光照強度為3500-4000LUX，分化現綠見圖2。(4)繼代壯苗生根培養溫度在22-25°C、光周期16_20h/d、光強3500-4000LUX的環境條件下，待胚分化出
莖葉、植株(見圖幻，將植株移至繼代培養基進行繼代壯苗；再在生根培養基上，進行生根壯苗培養，生根后的植株見圖4，苗壯根粗后移栽大田。按照該實施例高效誘導的各基因型的結球甘藍雙單倍體的出胚數、成苗數、繼代次數、移栽成活數和加倍株數見表2。由表2可見，本方法基因型適應性廣，對于本實施例中的6種基因型效果均較好， 加倍效率、出胚率、移栽成活數有大幅度提高，繼代次數明顯減少。表1實施例1中各培養基的配方
權利要求
1.一種高效誘導結球甘藍雙單倍體的方法，其特征在于，按照以下步驟進行(1)花蕾的選取和小孢子的分離選取處于單核靠邊期的花蕾，將其消毒處理后在分離培養基中進行無菌破碎，離心分離后獲得小孢子，所述分離培養基為含蔗糖濃度為140-170mg/L的B5液體培養基；(2)誘導加倍成胚培養對分離后的小孢子進行誘導加倍培養，首先在啟動培養基中同步進行啟動培養和加倍誘導，30-35°C的溫度下暗培養M-72小時，所述啟動培養基為含有0. 5-100ppm秋水仙素加倍劑且蔗糖濃度為150-180g/L的NLN液體培養基；將小孢子膨大率達70%的樣品離心，棄上清液后添加成胚誘導培養基懸浮，其中，小孢子的懸浮密度為5 X 104-5 X IO5個/mL，然后進行成胚誘導暗培養，培養溫度為22-25°C，所述成胚誘導培養基為含有0. Ol-Ippm的6-芐氨基嘌呤和/或0. 01-0. 5ppm的α -萘乙酸且蔗糖濃度為130_150g/L的NLN液體培養基；(3)分化成苗與繼代培養A、分化成苗階段待胚狀體至肉眼可見后將其轉到溫度為20-28°C、轉速為60rpm的搖床上旋轉培養1-3周，然后將胚狀體接種于分化培養基上進行分化成苗，所述的分化培養基為含0. Ol-Ippm的6-芐氨基嘌呤和/或0. 01-0. 5ppm的α -萘乙酸，9_15g/L瓊脂的B5 固體培養基；B、繼代培養階段待成正常試管苗后，再轉接至繼代培養基上進行繼代壯苗培養，所述的繼代培養基為含0. 01-0. 5ppm多效唑的B5固體培養基；分化成苗和繼代培養兩階段的培養條件為溫度22-25°C，光周期12-20h/d，光照強度1500-4000LUX ；(4)壯苗生根培養待胚狀體分化出莖葉，并成壯苗后，將其移至生根培養基上進行壯苗生根培養，直至苗壯根粗后移栽大田，所述生根培養基為含0. 01-0. 5ppm多效唑、0. 01-0. 5ppma-萘乙酸的 MS固體培養基。
2.根據權利要求1所述的高效誘導結球甘藍雙單倍體的方法，其特征在于，步驟(1)中所述花蕾大小為3. 5-5. 5mm。
3.根據權利要求1所述的高效誘導結球甘藍雙單倍體的方法，其特征在于，所述成胚誘導培養基中含有0. 1-0. 2ppm的6-芐氨基嘌呤和0. 01-0. 02ppm的a -萘乙酸。
4.根據權利要求1所述的高效誘導結球甘藍雙單倍體的方法，其特征在于，所述分化培養基中含有0. 1-0. 2ppm的6-芐氨基嘌呤和0. 01-0. 02ppm的a -萘乙酸。
全文摘要
本發明公開了屬于生物育種技術領域的一種高效誘導結球甘藍雙單倍體的方法。該方法涉及園藝作物結球甘藍的小孢子植株再生及其雙單倍體的誘導技術改進，包括以下步驟(1)花蕾的選取和小孢子的分離；(2)誘導加倍成胚培養；(3)分化成苗與繼代培養；(4)壯苗生根培養。本發明可大批量規模化生產結球甘藍雙單倍體，為育種提供大量的新基因型純系。該方法受生長環境和基因型的影響小，出胚成胚率高，加倍效果好，成苗植株生長健壯，繼代培養頻次減少，生根后苗壯根粗，大田移栽成活率高。
文檔編號A01H4/00GK102204511SQ20101013758
公開日2011年10月5日 申請日期2010年3月29日 優先權日2010年3月29日
發明者同曉麗, 李殿榮, 王灝, 田建華, 趙小萍 申請人:陜西省雜交油菜研究中心