專利名稱：一種芍藥組織培養方法
技術領域：
本發明涉及組織培養技術，具體地說，涉及一種芍藥組織培養方法。
背景技術：
芍藥(Paeonia lactiflora)為芍藥科芍藥屬多年生草本植物，是我國的傳統名 花，有悠久的栽培觀賞歷史，自古與“花王”牡丹相伴被稱為“花相”。芍藥的傳統繁殖方式有 分株、播種、扦插和壓條等，其中分株繁殖法應用最廣，也有利于保持品種原有的優良性狀， 但是該法繁殖系數小，無法滿足產業化生產的要求。隨著市場的開放，芍藥優良的觀賞特性 和切花品質受到世界矚目，歐美地區每年對芍藥的需求量很大，但是我國芍藥種苗的生產 形勢遠不能滿足國際花卉市場的需求。組織培養技術已廣泛應用到園林植物繁殖上，但在觀賞芍藥繁殖上應用的還很 少。以組織培養技術對芍藥進行離體快繁不僅能提高其繁殖系數，也能縮短其育種年限，對 芍藥的生產具有重要的意義。CN200510039010. 7公開了一種芍藥離體組織培養方法，具體 描述了從取材消毒到繼代的過程，沒有對生根及組培苗移栽成活做進一步的研究。目前，芍 藥屬植物的離體快繁研究多集中在牡丹上，有關芍藥組織培養的國內外研究較少，已有的 關于芍藥組織培養技術，僅討論了無菌體系的建立，還沒有形成一整套利用芍藥地下芽快 速繁殖的方法，也沒有涉及到芍藥組培苗的生根和移栽，不能為生產提供依據。
發明內容
本發明的目的是提供一種操作簡單、成本低廉且適于多種觀賞芍藥快速繁殖的芍 藥組織培養方法。為了實現本發明目的，本發明的一種芍藥組織培養方法，其包括芍藥莖尖的滅菌 消毒以及對滅菌消毒后的芍藥莖尖進行初代培養、繼代培養和生根培養的步驟。前述的組培方法，其中所述的芍藥莖尖取材自芍藥休眠期的地下芽。前述的組培方法，其中所述的芍藥莖尖的滅菌消毒使用酒精和84消毒液。前述的組培方法，其中所述的藥莖尖的滅菌消毒分兩步進行1)將帶有鱗片的芽 用濃度為70% 75%的酒精浸泡30 60秒后，用無菌水沖洗，然后用經過稀釋的84消毒 液浸泡12 15分鐘，其中84消毒液與水按1 3 4的體積比進行稀釋；2)剝去芽鱗， 露出莖尖，用經過稀釋的84消毒液浸泡12 15分鐘，其中84消毒液與水按1 5 7的 體積比進行稀釋，然后用無菌水沖洗。前述的組培方法，其中初代培養的培養基為1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+0. 2mg/ L lmg/L 6-BAU/2MS+0. lmg/L lmg/LGA3+lmg/L6-BA+0. lmg/L 0. 5mg/L NAA,優 選 l/2MS+lmg/LGA3+lmg/L 6-BA ；繼代培養的培養基為 1/2MS+0. 5mg/L lmg/L6_BA、 1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L TDZU/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L6_BA，優選 1/2MS+0. 2mg/L 6-BA ；生根培養的培養基為 WPM、WPM+0. lmg/L 0. 5mg/L IBA、ffPM+0. 5mg/L 1. Omg/L IBA、WPM+1. Omg/L 2. Omg/L IBA、WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L NAA。
前述的組培方法，其中繼代培養的次數為4 5次。前述的組培方法，其中生根培養分三步進行1)將繼代培養得到組培苗在3 6°C 冷藏8 10天，轉接到含NAA的生根培養基上培養15 20天，其中含NAA的生根培養基 優選WPM+1. Omg/L NAA ；2)將組培苗轉接到WPM+2% AC培養基上繼續培養20 30天，生 根后進行煉苗；3)將生根苗移栽到珍珠巖基質中。借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果(1)本發明通過對芍藥莖尖的滅菌消毒、初代培養、繼代培養和生根培養，得到完 整的芍藥組培苗植株，生根率最高達到26. 7%，并能實現出瓶移栽。(2)采用莖尖進行離體培養產生的組培苗能夠保持原品種的優良性狀，為良種繁 育和產業化生產奠定基礎。(3)本發明的芍藥組織培養方法，操作簡單、成本低廉，適于多數觀賞芍藥的快速繁殖。(4)對外植體表面進行滅菌消毒時，僅使用了酒精和84消毒液，對環境友好。(5)分兩步對外植體表面滅菌消毒，保證了消毒徹底且消毒液不對外植體造成傷 害，莖尖成活率達25%以上。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1.材料與方法于10月份取大田中3 4年生的芍藥品種‘種生粉’的地下芽作為外植體，放入 4°C冰箱冷藏保存4周后接種。接種前，將市售“金魚牌”洗潔精用水稀釋800倍，用稀釋后的洗潔精溶液浸泡清 洗外植體，然后用水洗凈，再用鑷子剝去外層鱗片，留下最里面的一兩層黃白色鱗片并切去 基部多余部分，然后再用稀釋后的洗潔精溶液浸泡，用毛筆仔細刷洗鱗片和側芽的縫隙，最 后用自來水沖洗1小時。在超凈工作臺中，將帶有一兩層鱗片的芽用濃度為70%的酒精浸泡60秒，無菌水 沖洗3次，用經過稀釋的84消毒液浸泡15分鐘，其中84消毒液與水按1 3的體積比進 行稀釋；在濾紙上剝去剩余鱗片，露出黃白色莖尖，再用經過稀釋的84消毒液浸泡15分鐘， 其中84消毒液與水按1 5的體積比進行稀釋，然后用無菌水沖洗5次，切去基部被消毒 液滲透的部分，切口盡量平齊，減小創傷面積，保留2個側芽，輕輕放置在培養基表面上，每 瓶接2個芽子。初代培養采用不同的啟動培養基分批次進行，所采用的啟動培養基包括 1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+0. 2mg/L lmg/L 6-BA、1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+lmg/L 6-BA+O. lmg/L 0. 5mg/L NAA。待莖尖伸長展葉后，分別將上述分批次培養的莖尖轉接到 增殖培養基上進行繼代培養，繼代培養采用不同的增殖培養基分批次進行，所采用的增殖 培養基包括 1/2MS+0. 5mg/L lmg/L 6-BA、1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L TDZU/2MS+0. lmg/ L 0. 2mg/L 6-BA。增殖4代后，分別選擇上述分批次培養的生長健壯的組培苗放到4°C冰 箱中冷藏處理10天后轉接到生根培養基上，生根培養采用不同的生根培養基分批次進行，所采用的生根培養基包括WPM、WPM+0. lmg/L 0. 5mg/L IBA、WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L IBA、 WPM+1. Omg/L 2. Omg/L IBA.WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L NAA。15 天后再分別將上述分批次 培養的組培苗轉接到WPM+2% AC培養基上繼續培養。生根培養30天后，將打開封口膜煉 苗。1周后，將生根苗從三角瓶中取出，洗凈根部的瓊脂，移栽到盛有珍珠巖基質的穴盤中， 噴施稀釋50倍的MS稀釋液，用保鮮膜覆蓋。2.結果與分析(1)無菌體系的建立地下芽接種后2-3天，基部與培養基接觸處出現白色的菌絲，隨著芽的萌動和分 化，污染情況加重，最后導致芽的死亡，可能是地下芽在土壤中接觸細菌較多，消毒困難或 消毒時保留外層芽鱗，消毒不充分。參照上述芍藥莖尖的滅菌消毒方法，當使用酒精濃度75%處理帶有鱗片的芽 30s、84消毒液1 4稀釋處理15min;再用、84消毒液1 7稀釋處理15min，其莖尖成活 率為25%以上。參照上述芍藥莖尖的滅菌消毒方法，當使用酒精濃度70%處理帶有鱗片的芽 60s、84消毒液1 3稀釋處理12min;再用84消毒液1 5稀釋處理12min，其莖尖成活 率為25%以上。采用本發明芍藥莖尖的滅菌消毒方法，接種后的莖尖成活率最高可達31. 5%。(2)叢生芽的誘導接種后，黃白色的芽在光下變成綠色，莖尖伸長，隨后側芽萌動，葉片伸展開，葉片 呈綠色。出現污染的芽依然能夠萌動和分化，但是隨著污染情況的加重，逐漸死亡。采用本發明提供的初代培養的啟動培養基1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+0. 2mg/ L lmg/L 6-BA 或 1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+lmg/L 6-BA+O. lmg/L 0. 5mg/L NAA 可 使地下芽最高萌動率達到100%，最高分化率達到56. 25%，部分芽基部出現愈傷組織。(3)叢生芽的增殖采用本發明提供增殖培養基1/2MS+0. 5mg/L lmg/L 6-BA、1/2MS+0. lmg/L
0.2mg/L TDZ或1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L 6-BA進行繼代培養，結果表明，添加了 TDZ的 培養基誘導叢生芽的增殖系數大于添加6-BA的培養基，但是TDZ導致部分叢生芽的生長畸 形，葉片扭曲膨大，且組培苗莖葉細弱，顏色較淺，有玻璃化的趨勢，高濃度的6-BA也能引 起部分組培苗出現玻璃化的現象。低濃度的6-BA能夠保證組培苗穩定增殖，增殖系數達到 2. 1，且生長健壯。因此低濃度的6-BA是增殖培養階段適宜的激素。(4)生根培養采用本發明提供的生根培養基WPM、WPM+0. lmg/L 0. 5mg/LIBA、WPM+0. 5mg/L
1.Omg/L IBA、WPM+1. Omg/L 2. Omg/L IBA 或 WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L NAA 誘導生根，然 后將組培苗轉接到含活性炭的空白培養基上培養，生根培養最高生根率達到26. 7%，每株 平均生根數為2. 25條，平均根長為0. 88cm。在含有NAA的生根培養基上培養的組培苗基部 有白色的愈傷組織。3.總結在芍藥地下芽的組織培養中，采用兩步消毒法可以使成活率達到25%以上，啟動 培養采用培養基l/2MS+lmg/L GA3+lmg/L 6-BA較為適宜；增殖培養基采用1/2MS+0. 2mg/L
56-BA能使組培苗穩定的增殖；在生根培養過程中，先用生根培養基WPM+1.0mg/L NAA處理， 再轉接到WPM+2% AC培養基上，生根效果好。 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種芍藥組織培養方法，其包括芍藥莖尖的滅菌消毒以及對滅菌消毒后的芍藥莖尖 進行初代培養、繼代培養和生根培養的步驟，其特征在于，芍藥莖尖的滅菌消毒分兩步進行1)將帶有鱗片的芽用濃度為70% 75%的酒精浸 泡30 60秒后，用無菌水沖洗，然后用經過稀釋的84消毒液浸泡12 15分鐘，其中84 消毒液與水按1 3 4的體積比進行稀釋；2)剝去芽鱗，露出莖尖，用經過稀釋的84消 毒液浸泡12 15分鐘，其中84消毒液與水按1 5 7的體積比進行稀釋，然后用無菌 水沖洗。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，生根培養分三步進行1)將繼代培養得到 組培苗在3 6°C冷藏8 10天，轉接到含NAA的生根培養基上培養15 20天；2)將組 培苗轉接到WPM+2% AC培養基上繼續培養20 30天，生根后進行煉苗；3)將生根苗移栽 到珍珠巖基質中。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述芍藥莖尖取材自芍藥休眠期的地 下芽。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，初代培養的培養基為1/2MS+0.Img/ L lmg/L GA3+0. 2mg/L lmg/L 6-BA 或 1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+lmg/L 6-BA+O. lmg/ L 0. 5mg/L NAA ；繼代培養的培養基為 1/2MS+0. 5mg/L lmg/L 6-BA、1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L TDZ 或 1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L 6-BA ；生根培養的培養基為 WPM、WPM+0. lmg/ L 0. 5mg/L IΒΑ、WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L IBA、WPM+1. Omg/L 2. Omg/L IBA或WPM+0. 5mg/ L 1. Omg/L NAA。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，初代培養的培養基為lAMS+lmg/L GA3+lmg/L 6-BA。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，繼代培養的培養基為1/2MS+0.ang/L 6-BA。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，繼代培養的次數為4 5次。
8.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步驟1)的含NAA的生根培養基 為 WPM+1. Omg/L NAA。
全文摘要
本發明提供了一種芍藥組織培養方法，其包括對芍藥莖尖滅菌消毒的步驟，以及對滅菌消毒后的芍藥莖尖進行初代培養、繼代培養和生根培養的步驟，其中對芍藥莖尖的滅菌消毒分兩步進行，保證了消毒徹底且對外植體無傷害，莖尖成活率高。本發明的芍藥組織培養方法，操作簡單、成本低廉、生根率高，并能實現出瓶移栽，適于多數觀賞芍藥品種的快速繁殖，同時，采用本發明的組培方法能夠保持原品種的優良性狀，為良種繁育和產業化生產奠定基礎。
文檔編號A01H4/00GK102124946SQ201010102618
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月27日 優先權日2010年1月27日
發明者于曉南, 張啟翔, 潘瞳 申請人:北京林業大學