專利名稱::一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法
技術領域:
:本發明涉及一項玉米組織培養再生技術,屬于植物基因工程和轉基因育種領域,是一種玉米自交系農系531的高效再生體系的建立方法。
背景技術:
:玉米是我國主要的糧食、飼料作物之一,也是重要的工業原料。隨著畜牧業和加工工業的不斷發展,對玉米的需求勢必進一步增加。據統計本世紀初我國糧食產量需求達5Xl()8t,其中玉米則達到了1.25乂108仁預計到2030年,我國玉米的需求則要達到1.61.75Xl()8t。如果種植面積保持不變,則需要將現在4387kg/hi^的單產水平提高到5000kg/hn^左右,這就是面向21世紀我國玉米育種的艱巨任務。世界上玉米生產先進國家,如荷蘭、希臘、新西蘭、意大利、奧地利、法國、西班牙、加拿大、美國等,玉米單產都在7000kg/hm2以上,希臘和新西蘭分別為9876kg/hm2和9355kg/hm、說明我國玉米單產水平還有很大的提升空間。但要實現這種提升,必須突破常規育種的方法,而采用最經濟有效的轉基因育種技術等先進方法。利用轉基因技術,可以打破種間限制,直接將外源有益基因引入受體,實現育種"定向化",并且可以使有益性狀快速穩定下來,取得傳統、常規育種技術難以達到的效果和效益。轉基因新種質應用于育種實踐的最快捷的方式是利用外源基因直接導入育種上常用的優良自交系。所以,對生產上常用的優良玉米自交系進行研究,建立其高效再生技術,對于促進玉米轉基因育種的應用具有重要推動作用。高效再生體系的建立是實現基因轉化的先決條件,關系到基因轉化的成敗,是轉基因育種的基礎和首要條件。玉米幼胚經誘導產生的愈傷組織有三種類型1型為致密的瘤狀胚性愈傷組織,此類愈傷組織在許多玉米自交系和雜交種上很容易高頻誘導;11型愈傷組織為白色或淡黃色、松脆的高度胚性愈傷組織,II型愈傷組織增殖快,但基因型依賴性強且誘導率低。ni型愈傷組織為松散的、柔軟的、半透明的無組織結構的愈傷組織。II型胚性愈傷組織的低頻誘導是制約玉米再生頻率的主要因素。玉米高頻再生體系的建立有兩個關鍵環節一是穩定的II型胚性愈傷組織的高頻誘導;二是高頻的正常可育植株的再生。1975年,Green和Phillips首次成功地從玉米模式自交系A188誘導再生了植株。此后,許多文獻對玉米模式自交系A18S、B73、墨西哥甜玉米及生產上常用的優良自交系進行了再生系統的研究,并獲得了再生植株。但這些II型愈傷組織誘導成功率和植株再生成功頻率普遍較低(最高值分別為64.28%和22.4%),并且表現出強烈的基因型依賴性。模式自交系A188雖然誘導效率高,但其農藝價值很低,外源基因導入后還需經過長時間的雜交轉育和選擇才能形成轉基因的新種質;已報道的玉米生產上常用的優良自交系再生能力則普遍偏低,不能滿足玉米轉基因育種的需要。而作為我國玉米的一個品系的自交系農系531的株型高、果穗大、花粉量大,農藝價值很高,如果將外源基因導入后可直接產生轉基因新種質,可大大縮短育種時間,加速轉基因育種進程。但目前還沒有進行關于優良自交系農系531高效再生體系建立方面的研究。
發明內容本發明需要解決的技術問題是提供一種建立優良玉米自交系農系531的高效再生體系的方法,其增殖快,誘導率高,為對農系531玉米進行外源基因轉化及轉基因育種應用提供技術前提。為解決上述技術問題本發明所采取的技術方案是—種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,它是以玉米的農系531的幼胚為外植體,經合適的培養基配方進行誘導,高頻的產生II型胚性愈傷組織,II型胚性愈傷組織在胚狀體誘導培養基中經光下誘導產生綠色胚狀體,轉移至再生培養基中光下培養可再生成苗,經生根誘導即可再生完整植株,再生植株經Hogland營養液煉苗,長出新根后移栽至營養土中,光照培養箱中緩苗后移栽至大田生長并正常結實。本發明的方法包括以下步驟A、幼胚接種及II型胚性愈傷組織誘導以農系531玉米授粉后12天的幼胚為外植體,接種于愈傷組織誘導培養基中進行誘導,使其產生II型胚性愈傷組織;所述外植體的最佳接種胚齡為自交系農系531玉米授粉后12天的幼胚,此時幼胚呈白色半透明狀態,大小約2.0mm。B、胚狀體誘導將步驟A中的II型胚性愈傷組織在胚狀體誘導培養基中,在培養溫度為2『C、光照強度為1500Lx、光/暗=8h/16h的培養箱中培養2周,對胚狀體進行誘導,產生綠色胚狀體;C、再生苗誘導將綠色胚狀體轉移至再生培養基中,在培養溫度為2『C、光照強度為1500Lx、光/暗=14h/10h的條件下培養1520天,使綠色胚狀體生成再生植株;這樣培養的再生植株的再生苗絕大部分為單株,極少為從生苗。D、生根誘導將步驟C產生的再生植株中的單株剪去細弱的根并移至生根培養基中,在培養溫度為28t:、光照強度為1500Lx、光/暗=14h/10h的培養條件下培養814天,使再生植株產生出粗壯的新根,形成完整的再生植株;E、Hogland營養液煉苗將上述步驟D中的完整的再生植株從培養基中取出放入Hogland營養液中,洗凈培養基(注意保護根部),在培養溫度為2『C、光照條件為1500Lx、光/暗=14h/10h的條件下培養35天;對再生植株進行煉苗,使再生植株的根部長出新的粗壯的根;F、土中培養將經上述步驟E培養的長出新根的再生植株移栽至營養土中,在培養溫度為28°C、光照強度為1500Lx、光/暗=8h/16h的條件下培養815天,對植株進行緩苗培養;G、將上述緩苗培養的植株從小培養缽中移栽至溫室或大田中,使其正常生長并直至結實。本發明所述的步驟A中接種和愈傷組織誘導的具體操作方法是取農系531玉米授粉后12天的幼穗,剝去苞皮;在超凈臺中用酒精進行表面消毒后,用手術刀切去上部l/2籽粒的胚乳部分,用小鑷子挑取大小為2.0mm的幼胚,使幼胚的盾片向上接種于愈傷組織誘導培養基中;酒精的濃度一般為70%;在3(TC下進行暗培養,經3040天誘導產生淡黃色、致密的顆粒狀II型胚性愈傷組織。這樣就能高頻的產生出II型胚性愈傷組織。上述的愈傷組織誘導培養基的原料配比為包括基本培養基N6、在基本培養基N6中添加的適當濃度的2,4-二氯苯氧乙酸、L-脯氨酸、酸水解酪蛋白、AgN(^、蔗糖、瓊脂;愈傷組織誘導培養基的pH值為5.78-5.82。本發明的方法的進一步改進在于為了保持II型胚性愈傷組織的活性,可以對II型胚性愈傷組織進行繼代培養,以便在任何需要的時候進行進一步培養。繼代培養是在步驟A后,是將步驟A幼胚接種及II型胚性愈傷組織誘導產生后的II型胚性愈傷組織在30°C溫度下在繼代培養基上進行暗培養,每2030天更換一次繼代培養基,以保持II型胚性愈傷組織的良好再生能力,在需要時再進行步驟B的胚狀體誘導。II型胚性愈傷組織的保持能力是指經誘導產生的II型胚性愈傷組織經多次繼代培養后仍能夠良好再生的II型胚性愈傷組織的能力,用II型胚性愈傷組織的保持率表示(再生II型胚性愈傷組織的愈傷組織塊數占接種II型胚性愈傷組織塊數的百分比)。本發明上述的繼代培養基包括基本培養基N6,并且N6中再添加2,4_二氯苯氧乙酸1.02.Omg/L、L-脯氨酸700mg/L、酸水解酪蛋白200mg/L、AgN03l0mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂7g/L;繼代培養基的pH值為5.785.82。本發明的胚狀體誘導培養基的原料配比為胚狀體誘導培養基包括基本培養基N6,在N6中添加L-脯氨酸700mg/L、酸水解酪蛋白200mg/L、蔗糖50g/L、瓊脂7g/L;胚狀體誘導培養基的PH值為5.785.82。本發明的再生培養基的原料配比為1/2MS為基本培養基,在1/2MS中添加蔗糖20g/L、瓊脂7g/L,再生培養基的pH值為5.785.82。MS培養基主要成分包括大量元素、鐵鹽、微量元素、有機物。1/2MS是指MS基本培養基中的大量元素和鐵鹽用量減半。本發明的生根培養基的原料配比為1/2MS為基本培養基,在其中添加萘乙酸(NAA)O.5mg/L、蔗糖20g/L、瓊脂7g/L,生根培養基的pH為5.78。本發明的營養土的原料配比為所述營養土包括雞糞、蛭石、生土、草炭土,其比例為雞糞/蛭石/生土/草炭土=1/2/2/4。由于采用上述技術方案本發明的方法所取得的技術進步在于本發明的優良玉米自交系農系531的高效再生體系的培養方法,增殖快,誘導率高,呈現出強基因型依賴性,為對農系531玉米進行外源基因轉化及轉基因育種應用提供技術前提。n型胚性愈傷組織的誘導被公認為是高頻再生的關鍵環節之一。本發明以優良玉米自交系農系531適宜大小和時期的幼胚為外植體,通過適宜的培養基誘導,II型胚性愈傷組織誘導率較以往報道有顯著提高,誘導率能夠達到72.4%,為高頻再生奠定了基礎。本發明的植株再生類型主要以單株再生為主,單株比例能夠達到90%以上,高頻的單株再生為后續的移栽成活及結實提供了保證,是農系531高頻再生的又一關鍵技術。本發明所建立的再生技術是針對玉米生產及育種中常用的優良自交系,結合轉基因技術,可以直接創造具有有益基因的玉米新種質,避免了模式自交系轉化后還要通過雜交等手段將有益基因導入優良自交系的繁瑣過程,節省了育種時間,加速了轉基因育種進程。圖1為本發明方法的工藝路線流程圖。具體實施例方式本發明建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法的工藝路線如下幼胚接種一II型胚性愈傷組織誘導一胚狀體誘導一再生苗誘導一生根誘導生成完整植株一Hogland營養液煉苗一移栽至營養土培養一移栽至溫室或大田生長結實。其流程見說明書附圖1。實施例1.試驗材料本實施例選用玉米生產和育種上常用的4個優良自交系——黃早4、農系531、沈137和邢抗36,并對它們進行比較試驗。2.試驗方法及步驟2.1幼胚接種及II型胚性愈傷組織誘導在玉米授粉后第12天,取下其整個雌穗,剝去苞皮,于超凈工作臺中進行如下操作用70%的酒精進行表面消毒2分鐘后,用手術刀切去上部1/2籽粒的胚乳部分,用小鑷子挑取幼胚,盾片向上接種于愈傷組織誘導培養基中,在3(TC下進行暗培養,經35天即可誘導產生出淡黃色、致密的顆粒狀II型胚性愈傷組織。上述的II型胚性愈傷組織誘導培養基最適宜的配比為基本培養基為N6,在基本培養基N6中添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4_D)1.02.0mg/L、L-脯氨酸2880mg/L、CH(酸水解酪蛋白)100mg/L、AgNO蔗糖20g/L、瓊脂7g/L;愈傷組織誘導培養基的PH值為5.8。其中N6的主要成分包括大量元素KN032830mg/L、(NH4)2S04463mg/L、KH2P04400mg/L、MgS047H2085mg/L、CaCl22H20166mg/L;鐵鹽FeS047H2027.85mg/L、Na2_EDTA37.25mg/L;微量元素MnS044H204.4mg/L、ZnS047H201.5mg/L、H3B031.6mg/L、KI0.8mg/L;有機物甘氨酸2.Omg/L,鹽酸硫胺素1.Omg/L,鹽酸吡哆醇0.5mg/L,煙酸0.5mg/L,肌醇100mg/L。表1中的MS培養基主要成分包括大量元素KN031900mg/L、(NH4)2N031650mg/L、KH2P04170mg/L、MgS047H20370mg/L、CaCl22H20440mg/L;鐵鹽FeS047H2027.85mg/L、Na2_EDTA37.25mg/L;微量元素MnS044H2022.3mg/L、ZnS047H208.6mg/L、H3B036.2mg/L、KI0.83mg/L,CuS045H200.025mg/L,Na2Mo042H200.25mg/L,CoCl26H200.025mg/L;有機物甘氨酸2.0mg/L,鹽酸硫胺素0.4mg/L,鹽酸吡哆醇0.5mg/L,煙酸0.5mg/L,肌醇100mg/L。表1列出了本發明的方法所用的各種培養基的主要配方,并對多種愈傷組織誘導培養基進行了比較,各種培養基的各成分的比例列在表l中,但具體數值可以有所浮動。不同的愈傷組織誘導培養基對不同品種的誘導率結果如表2。表1玉米再生體系所用培養基(mg/1)編號基本培養基2,4-DNAAL-proCHAgN03蔗糖瓊脂應用1N61.0—288010010200007000愈傷組織誘導2N62.0—288010010200007000愈傷組織誘導3N62.0—70020010200007000愈傷組織誘導4N62.0----——200007000愈傷組織誘導5N61.0-2.0--70020010300007000繼代6N6--—700200—500007000胚狀體資導71/2MS—————200007000再生81/2MS—0.5———200007000生根誘導2.2胚狀體誘導選取狀態良好的II型胚性愈傷組織接種在胚狀體誘導培養基上,于2『C、光照培養箱中培養(1500Lx、光/暗=8h/16h),經2周即可誘導產生綠色胚狀體。2.3再生苗誘導再生苗誘導將上述產生的綠色胚狀體接種在再生培養基上,于28t:、光照培養箱中培養(1500Lx、光/暗二14h/10h),經2周時間即可再生成苗,這樣培養的再生植株的再生苗絕大部分為單株,極少為從生苗。2.4生根培養經再生誘導所得植株也會產生大量細弱的根,但不利于成活。生根培養時,先剪去其細弱的根,再轉接至生根培養基中,于28t:、光照培養箱中培養(1500Lx、光/暗二14h/10h),經10天誘導產生粗壯的新根,從而形成完整的再生植株。2.5煉苗及移栽將生根后的完整再生植株從培養基中取出,洗凈培養基(注意保護根部),在Hogland營養液中煉苗,在培養溫度為28t:、光照條件為1500Lx、光/暗=14h/10h的條件8下培養,3天后根部長出新的根原基,即再生植株的根部長出新的粗壯的根,再移栽至裝有營養土(雞糞蛭石生土草炭土=i:2:2:4)的小培養缽培養,培養溫度為2『c、光照強度為1500Lx、光/暗=8h/16h的培養箱中培養10天,對植株進行緩苗;緩苗后移栽至溫室或大田,使其正常生長并直至結實。3.結果與分析3.1高頻II型胚性愈傷組織的誘導及適宜培養基選擇幼胚經30d誘導產生了I型、II型、。III型的三種類型的愈傷組織。II型胚性愈傷組織的高頻誘導首先要有適宜的培養基,選用N6培養基對于II型胚性愈傷組織的誘導率比MS培養基效果好。在所試的4種愈傷組織誘導培養基(表1中的編號為14的愈傷組織誘導培養基)中,在對農系531、沈137、邢抗36、黃早4四個品種的對比試驗中,對農系531中表現出了極顯著差異(見表2),前3種含有L-脯氨酸、CH和AgN03的愈傷組織誘導培養基明顯優于第4種培養基,從II型愈傷組織誘導率比較,以培養基1和2為農系531幼胚誘導產生II型胚性愈傷組織的最適宜培養基。表24種培養基中4種品種基因型的II型胚性愈傷組織誘導率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2中的II型愈傷組織誘導率%=誘導II型愈傷組織的胚數/接種胚數X100。從表2各自交系的II型胚性愈傷組織誘導率的差異顯著性檢驗結果可以看出,農系531的II型胚性愈傷組織誘導率最高達72.4%,與其它3個自交系均表現出極顯著差異,說明這一再生技術呈現出強基因型依賴性,對于農系531表現出高效的再生能力。3.2植株再生及類型在胚狀體誘導培養基上經2周培養,幾乎100%都能誘導產生綠色胚狀體。將其轉入再生培養基,2周后再生了大量植株。我們將再生植株類型劃分為單株和從生苗2種類型,其中單株率見表3。表3農系531的植株再生率及再生類型基因型植抹再生率%植抹數單抹比例%從生苗比例%<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3中植株再生率%=植株再生數/接種II型愈傷組織塊數X100。從表3可見,農系531的植株再生率高達83.9%,遠遠高于已報道關于自交系的結果,與一些雜交種的植株再生率相當。而且再生植株中單株占到了91.43%,再生的單株表型健壯,為后續的成活奠定了基礎。3.3生根誘導及移栽結實生根誘導也是再生體系建立的一個關鍵環節。生根誘導分為2步生根培養基中誘導和Hogland營養液中培養以獲得健壯的根。在再生培養基上產生的植株通常有細弱的根,即使在Hogland營養液中培養也很難獲得健壯的根。將2種植株類型和2種根類型組合所得3種植株的移栽成活率進行比較,結果見表4。表4農系531自交系3種類型植株的移栽成活率植抹類型植抹數人工氣候箱中成活率%溫室中成活率°/0結實率%單株健壯根9610010021.18從生苗健壯根933.311.10單林細弱根5000表4中人工氣候箱中成活率是指植株移栽至裝有營養土的小花盆中在人工氣候箱中培養io天的結果。移栽入溫室后,全部單株均成活并且生長健壯,而從生苗則僅有11.1%存活,但不能結實,有細弱根的單株則根本不能成活。這表明單株再生及生根誘導是高成活率及再生體系建立的兩個關鍵因素。只有具健壯根的單株才能保證高成活率。10權利要求一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,其特征在于包括以下步驟A、幼胚接種及II型胚性愈傷組織誘導以農系531玉米授粉后12天的幼胚為外植體,接種于愈傷組織誘導培養基中進行誘導,使其產生II型胚性愈傷組織;B、胚狀體誘導將步驟A中的II型胚性愈傷組織在胚狀體誘導培養基中,在培養溫度為28℃、光照強度為1500Lx、光/暗=8h/16h的培養箱中培養2周,對胚狀體進行誘導,產生綠色胚狀體;C、再生苗誘導將綠色胚狀體轉移至再生培養基中,在培養溫度為28℃、光照強度為1500Lx、光/暗=14h/10h的條件下培養15~20天,使綠色胚狀體生成再生植株;D、生根誘導將步驟C產生的再生植株中的單株剪去細弱的根并移至生根培養基中,在培養溫度為28℃、光照強度為1500Lx、光/暗=14h/10h的培養條件下培養8~14天,使再生植株產生出粗壯的新根,形成完整的再生植株;E、Hogland營養液煉苗將上述步驟D中的完整的再生植株放入Hogland營養液中,在培養溫度為28℃、光照條件為1500Lx、光/暗=14h/10h的條件下培養3~5天;對再生植株進行煉苗,使再生植株的根部長出新的粗壯的根。F、土中培養將經上述步驟E培養的長出新根的再生植株移栽至營養土中,在培養溫度為28℃、光照強度為1500Lx、光/暗=8h/16h的培養條件下培養8~15天,對植株進行緩苗;G、將上述緩苗培養的植株移栽至溫室或大田中,使其正常生長結實。2.根據權利要求1所述的一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,其特征在于所述步驟A中接種和愈傷組織誘導的具體操作方法是取農系531玉米授粉后12天的幼穗,剝去苞皮,在超凈臺中用酒精進行表面消毒后,切去上部1/2籽粒的胚乳部分,挑取大小為2.Omm的幼胚,使幼胚的盾片向上接種于愈傷組織誘導培養基中,在3(TC下進行暗培養,經3040天誘導產生淡黃色、致密的顆粒狀II型胚性愈傷組織。3.根據權利要求1或者2所述的一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,其特征在于所述愈傷組織誘導培養基包括基本培養基N6、在基本培養基N6中添加的適當濃度的2,4-二氯苯氧乙酸、L-脯氨酸、酸水解酪蛋白、AgN(^、蔗糖、瓊脂;愈傷組織誘導培養基的pH值為5.785.82。4.根據權利要求1所述的一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,其特征在于在步驟A后還包括繼代培養步驟Al,繼代培養是將步驟A幼胚接種及II型胚性愈傷組織誘導產生后的II型胚性愈傷組織在3(TC溫度下在繼代培養基上進行暗培養,每2030天更換一次繼代培養基,以保持II型胚性愈傷組織的良好再生能力,在需要時再進行步驟B的胚狀體誘導。5.根據權利要求4所述的一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,其特征在于所述繼代培養基包括基本培養基N6,并且每升N6中再添加2,4-二氯苯氧乙酸1.02.0mg、L-脯氨酸700mg、酸水解酪蛋白200mg、AgN0310mg、蔗糖30g、瓊脂7g;繼代培養基的pH值為5.785.82。6.根據權利要求1所述的一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,其特征在于所述胚狀體誘導培養基包括基本培養基N6,在每升N6中添加L-脯氨酸700mg、酸水解酪蛋白200mg、蔗糖50g、瓊脂7g;胚狀體誘導培養基的pH值為5.785.82。7.根據權利要求1所述的一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,其特征在于所述再生培養基為1/2MS,在1/2MS中添加蔗糖20g/L、瓊脂7g/L,再生培養基的pH值為5.785.82。8.根據權利要求1所述的一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,其特征在于所述生根培養基為1/2MS,在1/2MS中添加萘乙酸O.5mg/L、蔗糖20g/L、瓊脂7g/L,生根培養基的pH為5.785.82。9.根據權利要求1所述的一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,其特征在于所述營養土包括雞糞、蛭石、生土、草炭土,其比例為雞糞/蛭石/生土/草炭土=1/2/2/4。全文摘要本發明公開了一種建立優良玉米自交系農系531高效再生體系的方法,屬于植物基因工程和轉基因育種領域。本發明以農系531的幼胚為外植體,在愈傷組織誘導培養基中進行誘導,產生II型胚性愈傷組織,將II型胚性愈傷組織在胚狀體誘導培養基中進行光下胚狀體誘導,產生綠色胚狀體,再將綠色胚狀體轉移至再生培養基中,在光下培養成再生植株,然后在生根培養基中進行生根誘導、Hogland營養液中進行煉苗,使再生植株的根部長出新的粗壯的根,再移栽至營養土中緩苗培養,最后移栽至大田中,即可正常生長結實。該再生技術適用的是應用價值很高的優良自交系玉米農系531,在玉米轉基因育種過程中可以使農系531玉米的優良品質得以遺傳,對功能基因組研究也具有重要意義。文檔編號A01G31/00GK101779598SQ20101003339公開日2010年7月21日申請日期2010年1月19日優先權日2010年1月19日發明者刁現民,智慧,李偉,李海權,王永芳申請人:河北省農林科學院谷子研究所