專利名稱：用于進行細胞測定的方法
技術領域：
本發明涉及細胞測定或基于細胞的測定，尤其涉及用于這樣的測定的深低溫保藏細胞的提供。
背景技術：
如同本領域的當前實踐，藥物發現是長時間的多步驟過程。首先，該過程涉及識別特定疾病靶標、開發基于特定靶標的測定、驗證該測定、優化和接著使該測定自動化以進行篩選。隨后可利用該測定進行化合物文庫的高通量篩選(HTS)以鑒別表現出作為潛在藥物的前景的候選化合物；接著驗證并化學優化這些化合物。該過程得到先導化合物，先導化合物進入臨床前試驗，若經驗證，則最終進入臨床試驗。在該過程中，篩選階段與測定開發階段不同，且包括測試化合物在活生物系統中的功效。歷史上，藥物發現是費時的高成本過程，每種藥物的產生歷時多年并耗費數億美元。基因組和HTS領域的發展已經引起靶標識別和化合物篩選領域中能力和效率的增加。HTS技術的應用提供了解決和易化藥物發現過程中當前遭遇的瓶頸的可能。在 HTS方法中，針對在生物系統中的可能效果和所選先導化合物對特定靶標的特異性篩選候選藥物。初級篩選已經由于HTS測定法和測定微型化的發展而解決，測定微型化采用96、 384、1536或更多微型孔的微量滴定孔板形式，其能夠達到超過100，000次試驗/天的通量水平。多種原本開發用于測量純化蛋白質(主要是酶)的生化活性的無細胞測定可容易地通過應用不需要將反應產物與底物分離的檢測系統而轉變成HTS。例如，基于熒光的技術允許在不需要分離、分級或純化步驟的情況下檢測酶活性以及分子間相互作用 (Hertzbamerg R P 禾口 Pope AJ. High-throughput screening :new technology for the 21st century (高通量篩選21 世紀的新技術).Curr. Opin. Chem. Biol. 4，第 445-451 頁， 2000)。這些自動化測定使得能夠快速篩選大的化合物文庫，以鑒定所謂的“命中物(hit) ”， 即在離體的體外系統中對特定靶標的生化活性表現出所需效應的化合物。然后對命中物進行化學修飾，并通過HTS系統進一步篩選，以選擇更具特異性和有效性的稱為“先導”化合物的衍生物。在經典的藥物發現過程中，隨后利用細胞模型和動物模型在多種體內測定中測試先導化合物，以選擇可成為臨床試驗候選藥物的那些先導化合物。近幾年，對于藥物發現過程早期的HTS，利用基因工程細胞和微生物的基于細胞的測定已經成為體外生化測定日益吸引人的備選方案。這樣的測定需要檢查由限定的靶標所引發的特異性細胞過程的能力和容易地在HTS系統中測定其輸出的工具。越來越多可用的基因修飾細胞和微生物的生物技術工具的利用已使得能夠開發簡單的容易地應用于HTS 的自動化系統的對于細胞過程的讀出測定。與傳統體外生化測定相比，基于細胞的測定具有顯著的優點。首先，這些細胞測定不需要純化靶蛋白，因此消除了對獲取用于獲得生化活性靶標的必要知識的資源的投入一該優點已隨著可被潛在藥物治療靶向的蛋白質數量日益增多而變得尤為重要，因為建立用于天然底物仍基本未知的數百新蛋白質的特異性生化測定實在困難。其次，靶蛋白的構象和活性以及用于監測化合物效果的讀數在與體外測定相比較很可能更為接近地表現自然生理狀態的細胞環境中研究。再次，基于細胞的測定可立即選擇排除通常具有細胞毒性的化合物或不能穿過細胞膜到達胞內靶標的化合物。因此，通過基于細胞的測定確定的命中物和先導化合物已經通過了重要的驗證步驟。該信息的可用性比許多體外測定領先，并可在藥物開發中節省寶貴的時間和成本。然而，近來用于藥物發現(尤其是用于HTS)的細胞生長對細胞供應商和用戶提出許多挑戰；即，批量性能變化、細胞生產計劃以及能力和容量管理。細胞系通常每周傳代培養兩次并放大用于每次測定。該傳代培養和放大通常在數月期間內循環重復。在大的單一批次中生長并保存于冰箱中的深低溫保藏細胞的應用具有顯著優點(a)改善基于細胞的測定結果的一致性一一旦冷凍，同批細胞可在長時期內使用，(b)增加靈活性一新的測定可在需要測試化合物的任何時刻開始，以及(C)降低成本一節省在藥物篩選活性同期將細胞系保持在培養物中所花費的時間。因此，減少了細胞培養試劑、一次性用品和細胞培養設備的使用。深低溫保藏本身通常對化合物的藥理學沒有影響，并可用于許多細胞類型和測 定(Guido J. R. Zaman, 等.Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery(深低溫保藏細胞有利于基于細胞的藥物發現).Drug Discovery Today.第 12卷，第13/14期，2007年7月)。例如，比較深低溫保藏的瞬時轉染H印G2細胞和新轉染H印G2細胞在孕烷X受體(PXR)反式激活測定中的使用。兩種細胞制品的測定性能相仿；但是，深低溫保藏細胞表現較少的測定間變化。用不同PXR活化效能和功效的藥物驗證表明在深低溫保藏細胞和新鮮細胞之間的優異相關性(r2 > 0. 95)。深低溫保藏不改變細胞滲透性差的已知CYP3A4誘導物的效果，表明深低溫保藏對膜透性幾乎沒有影響。此外，深低溫保藏HepG2細胞與瞬時轉染對照細胞相比未表現出對細胞毒性化合物提高的敏感度。深低溫保藏細胞的應用使該測定能夠以提高的效率進行(Zhu，Ζ.等.Use of cryopreserved transiently transfected cells in high-throughput pregnane X receptor transactivation assay (深低溫保藏的瞬時轉染細胞在高通量孕烷X受體反式激活測定中的使用)· Journal of Biomolecular Screening. 12，248-254，2007)。在文獻中描述的實例包括廣泛用于藥物篩選的細胞類型(例如CHO和HEK293)和讀出(例如β-內酰胺酶和FLIPR)。來自 AstraZeneca(Molndal，Sweden)的 Louise Stjernborg 和同事描述了冷凍細胞在用銣流出量測定篩選化合物對人ERG(hERG)途徑的副作用中的用途。在他們的團體中，hERG途徑篩選不是每天進行，而是以每月一次為基礎(當收集了足夠的新化合物時)。冷凍細胞的應用明顯節約了維持細胞培養物所花時間(Ding，M.等.Application of cryopreserved cells to hERG screening using a non-radioactive Rb+ efflux assay (深低溫保藏細胞在用非放射活性Rb+流測定的hERG篩選中的應用).Assay Drug Dev. Technol. 4，83-88，2006.)因此，在藥物發現中使用深低溫保藏細胞具有三個優點。第一，增加靈活性，因為新的測定可在任何時間開始。第二，提高數據質量，因為在某測定中某化合物的全部試驗結果可來自于同批細胞。第三，用冷凍細胞工作實質上減少了在細胞培養工作(尤其是維持細胞系)上花費的時間，從而減少了細胞培養設備、材料和一次性用品的使用。
聚賴氨酸被用作非特異性細胞附著因子，并常規用于促進某些細胞類型粘著到固體底物，例如合成培養表面；載玻片電鏡格柵等(Jac0bs0n，B.等.Plasma membrane :rapid isolation and exposure of the cytoplasmic surface by use of positively charged beads(等離子膜通過使用帶正電珠粒快速分離并暴露細胞質表面).Science 195 302-304，1977)。其通常用于一般不附著于固體表面的細胞(Mazia，等.Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy (細胞與涂覆有聚賴氨酸的表面的粘著，應用于電子顯微鏡術).The Journal of Cell Biology，第 66卷，198-200，1975)。這通過簡單地用陽離子聚賴氨酸的溶液涂布固體表面(塑料、玻璃等)來實現。聚賴氨酸部分與存在于塑料和玻璃表面上的帶負電荷的分子產生靜電相互作用。然而，聚賴氨酸也用于在從傳統的基于活細胞的分析到免疫組織化學的方法中增加許多其他非哺乳動物細胞和組織的粘著。在科學文獻中存在其用于促進哺乳動物/非哺乳動物細胞附著的許多實例。聚賴氨酸用于附著來源于全部主要生物物種(包括哺乳動物類、昆蟲類、兩棲動物類、魚類、爬行動物類和禽類)的細胞。此外，給出的實例包括來源于細菌、線蟲和腹足類等不同物種的細胞。
在聚賴氨酸上常規培養的一些細胞系實例包括-HEK293人胚腎細胞(Sugawara， Τ·等· A missense mutation of the Na+channel alpha II subunit gene Na(V)L 2 in a patient with febrile and afebrile seizures causes channel dysfunction(在,患有發熱性和無熱性癲癇患者中Na+通道α II亞基基因Na(v) 1. 2的錯義突變導致通道功能障礙).Proc Natl Acad Sci U S Α. 98 (11)，6384-9，2001)、MDA_231 乳腺癌細胞系(Yoneda， Τ.等· Inhibition of 溶骨性骨轉移of breast cancer by combined treatment with the bisphosphonate ibandronate and tissue inhibitor of the 基質金屬蛋白Sl ( ffl過用伊班二膦酸鹽(bisphosphonate ibandronate)和基質金屬蛋白酶_2組織抑制劑的聯合治療抑制乳腺癌的溶骨性骨轉移).J. Clin. Invest. 99 (10)，2509-17，1997)、垂體前葉細胞(Hinuma, S,等· A prolactin-releasing peptide in the brain (腦中釋方文催乳素的 Ι ). Nature, 393 (6682), 22-6,1998)、小膠質MG-7 細胞(Szcz印anik，AM.等.Amyloid-beta peptide fragments p3 and p4 induce pro-inflammatory cytokine and chemokine production in vitro and in vivo (淀粉狀β肽片段p3和p4誘發體外和體內促炎細胞因子和趨化因子產生).J. Neurochemistry, 77 (1)，304-17，2001)和大鼠原代星形膠質細胞(Little, EB.等·Α short segment within the cytoplasmic domain of the neural cell adhesion molecule (N-CAM) is essential for N-CAM induced NF-kappa B activity in astrocytes (神經細胞粘著分子(N-CAM)的胞質域內的短節段對于星形膠質細胞中的 N-CAM 誘導的 NF-kappa B 活性是必不可少的)· PNAS USA，98 (5)，2238-43，2001)。GB2427411A涉及使用藻酸鹽/多糖微膠囊/水凝膠的用于來源于組織的細胞的深低溫保藏方法。聚賴氨酸用于促進細胞附著到多糖。在該文件中沒有提及將聚賴氨酸用于改進測定性能。美國專利6657003公開了用于涂布基材的液體溶液，該液體溶液表現出長期的穩定性和細胞粘著性質。更具體而言，其涉及用于施用于細胞樣品載玻片的包含交聯氨基酸聚合物的溶液。該發明中所用氨基酸聚合物選自中性或堿性氨基酸，例如聚ι-賴氨酸或聚1-精氨酸。 WO 2005/034625涉及一種表面(例如細胞培養表面)，其包括結合抗細胞粘著 (CAR)材料的載體和結合該CAR材料的膠原VI或其生物活性片段或變體，以及任選的一種或多種其他ECM蛋白質或其生物活性片段或變體和/或一種或多種聚陽離子聚合物。美國專利5512474描述了細胞生物學領域的生物反應器的細胞培養表面，尤其描述了改善表面以獲得更好的細胞附著和細胞生長的方法。公開了細胞培養載體，其包括微載體形式的載體材料和用于細胞附著的承載表面，該表面具有包括以下物質的組合帶正電荷的分子和由丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺聚合而成的丙烯酸類物質。美國專利5932473描述了用組合物涂布的細胞培養基材，所述組合物包含在鹽溶液中的促細胞粘著劑。用在0. 005M-約0. 5M檸檬酸鹽或硫酸鹽溶液中包含約5 μ g/ml-約 1000 μ g/ml聚D-賴氨酸的組合物涂布基材，例如塑料、玻璃或微孔纖維，以便為每cm2基材提供約50 μ 1-約500 μ 1該組合物。Ma, Μ.等，2006 (Neuroscience Lett.，403，84-89)描述了粘著性哺乳動物神經元網絡的深低溫保藏。將分離的脊髓細胞附著于35mm培養皿上，該培養皿上已涂布有兩種粘著因子聚D-賴氨酸和層粘連蛋白。然后將該網絡嵌入膠原，并裝載冷凍保護劑海藻糖， 隨后轉移到包含DMS0、FBS和培養基的冷凍培養基。將該網絡在-196的液氮中貯藏至多2 個月。深低溫保藏后該網絡的表征包括利用發光探針(Viability/Cytotoxity試劑盒， Molecular Probes)測定細胞生存力、通過免疫細胞化學測定神經元標記的表達和利用發光探針FM1-43 (Molecular Probes)闡明突觸小泡再循環。Son, J. H.等，2004 (Biotechnology Letters, 26，829-833)描述了利用 1 型膠原涂覆的6孔板和包含DMS0、胎牛血清和培養基的冷凍混合物促進大鼠肝細胞的深低溫保藏。 細胞在-70°C僅進行短期(24hr)深低溫保藏。深低溫保藏后肝細胞的表征包括利用簡單的分光光度法MTT測定法測定細胞生存力和利用基于ELISA的系統測定白蛋白分泌。Shoji R.等，2000 (Cytotechnology, 32，147-155)描述了利用 1 型膠原、纖維結合素連接蛋白(pronectin F)或粘連蛋白涂覆的96孔板深低溫保藏人肝癌細胞。這些試劑用來促進細胞附著。深低溫保藏在_85°C利用補充有10% DMSO的肝細胞培養基完成。這些條件講細胞維持最佳狀態約7天。深低溫保藏后肝細胞的表征限于僅貯藏7天的細胞， 包括通過測量酸性磷酸酶活性測定細胞生存力和體外細胞毒性試驗(響應有毒試劑挑戰的存活/死亡劑量應答曲線)。技術問題在制藥工業中需要在容器中深低溫保藏細胞，該容器可用于低溫貯藏和隨后用于篩選目的二者；因此，該容器能貯藏在零下溫度，并簡單地從冰箱中移走使得細胞能夠解凍和直接用于HTS。目前，細胞通常深低溫保藏在小瓶(例如冷凍小瓶)中，并于低溫貯藏在這些小瓶中直到試驗所需；然后將細胞逐漸復蘇/解凍、用緩沖液洗滌并轉移到培養皿或微孔板上，為HTS的檢驗/測定作準備。此時，細胞由于解凍時的高死亡率和測定應答的易變性二者而不能深低溫保藏在培養皿或微孔板中。后者在這樣的測定中獲得的低Z-因子中明顯。深低溫保藏細胞并在相同容器或器皿中對復蘇細胞進行測定的能力將為制藥工業提供可行的技術。因此，存在通過去掉從小瓶/冷凍小瓶轉移到培養皿/微孔板的過程中的一個或多個步驟來改進工藝流程從而簡化步驟以減少成本和時間的需要。此外，存在改善已深低溫保藏在培養皿或微孔板中的細胞的細胞生存力和/或測定性能的需要。 本發明解決上述問題，并提供深低溫保藏細胞培養物和制備它們的方法，其使得能夠在單個容器中深低溫保藏和測定復蘇細胞。發明概述依據本發明第一方面，提供深低溫保藏細胞培養物，其包括至少具有表面的容器、承載在所述表面上的冷凍細胞，其中所述表面涂覆有聚賴氨酸。已知聚賴氨酸促進某些細胞類型附著到表面，但也已令人驚奇地發現其通過獨立于細胞附著的過程改善測定性能(甚至在長時間的深低溫保藏后)。聚賴氨酸常規用作增進哺乳動物細胞粘著到細胞培養處理表面的分子。這通過簡單地用陽離子聚賴氨酸的溶液涂布固體表面(塑料、玻璃等)來實現。聚賴氨酸部分可與存在于塑料和/或玻璃表面的帶負電荷的分子產生靜電引力。聚賴氨酸可獲自多個供應商(例如3丨811^，？7405，>30(^或？6407，70-15010。聚
賴氨酸增強細胞膜的帶負電荷離子和培養表面之間的靜電相互作用。當被吸附到培養表面上時，聚賴氨酸增加了可用于細胞結合的帶正電荷位點的數目。聚D-賴氨酸聚合物和聚 L-賴氨酸聚合物二者以及其混合物均可用于涂覆固體表面。但是，某些細胞能夠以蛋白酶解方式降解聚L-賴氨酸，在這種情況下，聚D-賴氨酸通常用于防止L-賴氨酸的過度降解和最終吸收。低分子量聚賴氨酸(Mr = 30，000-70, OOOkD)比較容易利用，因為它在溶液中粘性較小，但是> 300，OOOkD的高分子量為每個分子提供更好的細胞附著。細胞生物學中通常使用的聚賴氨酸的分子量范圍一般為70，000-150，OOOkD。在本發明另一個方面，細胞培養容器選自器皿、小瓶、微量滴定板和細胞培養板。在本發明又一個方面，在細胞培養表面上冷凍的細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞、爬行動物細胞和禽類細胞。優選所述細胞為哺乳動物細胞。更優選所述細胞選自CHO細胞(來源ECACC-85050302)、HEK293細胞(來源ATCC_CRL1573) 和 AD293 細胞(來源Invitrogen R705-07)。依據本發明第二方面，提供在細胞培養物中深低溫保藏細胞的方法，所述方法包括以下步驟a)將含有細胞的培養基加到容器表面，使得細胞附著在所述表面上并形成細胞培養物b)加入深低溫保藏培養基，和c)將所述細胞培養物的溫度降低至_20°C或更低；其中在步驟a)之前用聚賴氨酸涂覆所述表面。聚賴氨酸是用作涂料以增強細胞附著到塑料和玻璃表面的分子。它已用于培養多種類型細胞，包括神經元、膠質細胞和轉染細胞。聚D-賴氨酸通常用作培養基材，以促進多種神經元細胞系和轉染細胞系的粘著、生長和分化。聚D-賴氨酸、聚L-賴氨酸二者和其混合物均可用于涂覆固體表面，且傳統上用作細胞的非特異性附著因子。聚賴氨酸的已知功能之一是增強與細胞膜相關聯的帶負電離子和細胞培養表面之間的靜電相互作用。當被吸附到細胞培養表面上時，聚賴氨酸增加了可用于細胞結合的帶正電荷位點的數目。
在本發明另一個方面，細胞培養容器選自器皿、小瓶、微量滴定板和細胞培養板。
在本發明又一個方面，在細胞培養系統的表面上冷凍的細胞選自哺乳動物細胞、 昆蟲細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞、爬行動物細胞和禽類細胞。優選所述細胞為哺乳動物細胞。更優選所述細胞選自CHO細胞、HEK293細胞和AD293細胞。在本發明另一個方面，細胞貯藏在低于-80°C的溫度。更優選地，將細胞培養板冷凍至-80°C并持續16小時，之后轉移到-140°C長期貯藏。依據本發明第三方面，提供用于進行細胞測定的方法，所述方法包括以下步驟a) 將含有細胞的培養基加到容器表面，使得細胞附著在所述表面上并形成細胞培養物；b)加入深低溫保藏培養基；c)降低所述細胞培養物的溫度以冷凍細胞；d)在低于-20°C的溫度下貯藏所述細胞培養物；e)通過升高所述細胞培養物的溫度解凍細胞；和f)對細胞進行細胞測定，其中在步驟a)之前用聚賴氨酸涂覆所述容器表面。在一個方面，所述方法包括將含有細胞的培養基加到容器表面，使得細胞在所述表面上附著16小時的時間和形成細胞培養物；用深低溫保藏培養基(90%胎牛血清和 10%二甲基亞砜(DMSO))替換生長培養基；降低所述細胞培養物的溫度以冷凍細胞；在低于-20°C的溫度下貯藏所述細胞培養物；接著通過升高所述細胞培養物的溫度解凍細胞； 和對細胞進行細胞測定。在另一個方面，所述細胞培養物貯藏于-80°C的溫度。在又一個方面，聚賴氨酸選自聚D-賴氨酸、聚L-賴氨酸和其混合物。在又一個方面，所述容器選自器皿、小瓶、微量滴定板和細胞培養板。優選所述容器是細胞培養板。在一個方面，所述細胞是貼壁細胞。特別地，所述細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞、爬行動物細胞和禽類細胞。優選所述細胞為哺乳動物細胞。更優選所述細胞選自CHO細胞、HEK293細胞和AD293細胞。在另一個方面，將步驟a)中所用細胞附著到一種或多種微載體上。優選所述微載體涂覆有聚賴氨酸。在本發明又一個方面，所述細胞培養容器選自器皿、小瓶、微量滴定板和細胞培養板。定義以下術語在本發明的上下文中應理解為細胞測定一用于檢查由化合物作用所引發的細胞過程的方法或試驗和用于測量細胞輸出的工具。這樣的測定尤其可用于藥物篩選。技術人員將會理解，細胞死亡或生存力不包括在該定義中。深低溫保藏一通過利用深低溫保藏法保藏(在一般為_20°C和更低的深冷溫度保藏包含完整活細胞的生物組織)。冷凍細胞一在_20°C或更低的溫度維持的完整活生物細胞。深低溫保藏培養基一有時稱為“細胞冷凍培養基”，是包含在深低溫保藏或冷凍期間減少細胞損傷或傷害的試劑或成分的任何培養基。這樣的深低溫保藏培養基的實例包括但不限于二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清、甘油、Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)、海藻糖及其混合物。
信號本底(S:B)這實質上是用+激動劑(刺激物)測定的平均值除以_激動劑(刺激物)測定的平均值。信號噪音(S:N)該公式考慮了用信號測定和本底測定觀察的標準差。它是測定性能的指示。
平均值(+激動劑)-平均值(-激動劑) 激動劑標準差)-(-激動劑標準差)2Z-因子其通常被制藥工業用來評價測定性能。在統計學中，Z-因子是高通量篩選測定質量或能力的量度。該公式包括+激動劑和-激動劑測定的平均數和標準差。值越接近于1， 性能越好。對于基于細胞的測定，>0. 40通常認為良好，而0. 5以上的值認為是極好(Zhang 等· (1999)A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays (用于高通量篩選測定的評估和驗證的簡單統計學參數)· (J Biomol Screen.，4 (2) 67-73)。
f3(+激動劑標準差)+ 3(-激動劑標準差)、 "t (+激動劑平均值)-(-激動劑平均值),通過本發明優選實施方案的下述描述，本發明的更多特征和優點將變得明顯，該描述是參考附圖僅以實施例的方式給出。
以實施例方式給出的以下描述并非旨在將本發明限制到描述的任何具體實施方案。該描述可結合通過引用結合到本文中的附圖理解。圖Ia顯示深低溫保藏前后在涂覆和未涂覆聚賴氨酸的板上生長的穩定表達由水泡性口膜炎病毒表位標簽2腎上腺素能受體_增強綠色發光蛋白質細胞組成的重組蛋白質的中國倉鼠卵巢細胞(CH0 VSV-i3 2AR-EGFP穩定細胞)圖的比較。圖Ib顯示深低溫保藏前后在涂覆和未涂覆聚賴氨酸的板上生長的人胚腎 293-水泡性口膜炎病毒標簽-β2腎上腺素能受體-增強綠色發光蛋白質細胞(ΗΕΚ293 VSV-i3 2AR-EGFP穩定細胞)圖的比較。圖2顯示在涂覆和未涂覆聚賴氨酸的板上接種的細胞系(CH0 ￥3￥-0 2々1 46 穩定細胞系和冊1(293 VSV-β 2AR-EGFP穩定細胞系)在解凍后利用 Cell Titer-Glo 發光細胞生存力測定(luminescent cell Viability Assay, Promega)測定的生存力的比較。圖3顯示在涂覆和未涂覆聚賴氨酸的板上接種的深低溫保藏AD293細胞的測定性能比較。圖4顯示CHO VSV- β 2AR-EGFP細胞的激動劑(a)和拮抗劑(b)的劑量應答曲線。圖5顯示HEK293 VSV- β 2AR-EGFP細胞的激動劑(a)和拮抗劑(b)的劑量應答曲線。發明詳述
在第一方面，本發明是深低溫保藏細胞培養物，其包括至少具有承載冷凍細胞的表面的容器，其中所述細胞培養表面涂覆有聚賴氨酸。在細胞培養系統中提供預分配的深低溫保藏細胞將減少細胞培養物操作所花費的時間量。細胞可以是瞬時轉染或穩定轉染細胞。處理“即用型”預冷凍細胞包括簡單地將板解凍、除去冷凍培養基，之后是簡單的PBS洗滌和加入測定培養基。已令人驚奇地發現聚賴氨酸化合物通過獨立 于細胞附著的過程改進測定性能 (甚至在長時間深低溫保藏之后)。該改進通過至少兩種單獨的機制起作用i)促進和維持HEK293細胞粘著尤其在長時間深低溫保藏之后和經歷多個洗滌步驟。聚賴氨酸介導的細胞附著是HEK293細胞非常確實的現象；確實增強的細胞粘著是聚賴氨酸的主要細胞生物學用途之一。ii)聚賴氨酸影響 CHO細胞系形態(Sordel 等，Influence of glass and polymer coatings on CHO cell morphology and adhesion (玻璃或聚合物涂層對CHP細胞形態和粘著的影響).Biomaterials第28卷，第8期，1572-1584，2007)。在傳統的CHO細胞培養物中，不常規使用聚賴氨酸，因為CHO細胞很有效地附著于“細胞培養塑料”上，故認為它是不必要的。然而，在細胞深低溫保藏前聚賴氨酸的使用似乎增強測定性能，且未影響細胞粘著。根據對CHO細胞士聚賴氨酸更細致的檢查，在表現出隆起形態的細胞數目和改進的測定性能(通過Z-因子測量確定)之間似乎存在相關性。聚D-賴氨酸和聚L-賴氨酸均可用于涂覆固體表面，且傳統上用作細胞的非特異性附著因子。聚賴氨酸的已知功能之一是增強與細胞膜相關聯的帶負電離子和細胞培養表面之間的靜電相互作用。當被吸附到細胞培養表面上時，聚賴氨酸增加可用于細胞結合的帶正電荷位點的數目。可獲得不同分子量范圍的聚賴氨酸，例如M,30，000-70，000的聚賴氨酸在溶液中粘性較小，因此較易分配，然而，> 300, 000的聚賴氨酸為每個分子提供更多附著位點。作為折衷，優選聚賴氨酸的Mr是70，000-150，000。在有些情況下，某些細胞能夠以蛋白酶解方式降解聚L-賴氨酸，這種情況下，細胞可因L-賴氨酸的過度吸收而遭到破壞，因此應將聚D-賴氨酸以聚陽離子形式使用。細胞培養容器選自器皿、小瓶、微量滴定板和細胞培養板。在細胞培養表面上冷凍的細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞、爬行動物細胞和禽類細胞。所述細胞優選為哺乳動物細胞；更優選為選自CHO細胞、 HEK293細胞和AD293細胞的哺乳動物細胞。下述列表由表示可能適用于本發明用途的細胞的哺乳動物細胞組成。該列表是作為實例給出，不應被認為是限制性的。此外，穩定表達異源基因的細胞也是該實施方案的一部分，例如前述穩定表達β 2腎上腺素能受體的ΗΕΚ293和CHO細胞系。α.代表性細胞系
HeLa黑人宮頸腺癌(人)
HEK293胚腎(人)
1321-N1腦星形細胞瘤(人)
U-2 OS骨肉瘤細胞(人)
Huh-7肝癌(人)
K-562成淋巴細胞(慢性骨髓性白血病)(人)
HepG2肝細月包癌(Liver hepatocellular
carcinoma)(人)
Hep3B肝細^ 癌(Hepatocellular
carcinoma)(人)BJ包皮成纖維細胞(人)
CAC02結腸直腸腺癌(人)
MCF7人乳腺腺癌(人)
Swiss和NIH 3T3 胚胎成纖維細月也(小鼠)
COS-I和COS-7 SV40轉化的腎細胞系(非洲綠猴) CHO (CHO-Kl) 中國倉鼠卵巢細胞(倉鼠)
b.代表性原代細胞
HUVEC臍靜脈內皮細胞(人)
MHEpC乳房上皮細胞(人)
HTEpC氣管上皮細胞(人)
HAOEC主動脈內皮細胞(人)
PBMC外周血單核細胞(人)
c.代表性干細丨射祖細胞 hESC-BGO IV 胚胎干細胞系(人) ES-C57BL/6 胚胎干細胞系(小鼠) MLPC多譜系祖細胞臍帶血(人) .代表性癌細胞
NTERA 1和2 睪丸胚胎癌性細胞(人)低分子量聚賴氨酸(Mr = 30，000-70, OOOkD)較易利用，因為它在溶液中粘性較小，但是> 300，OOOkD的高分子量為每個分子提供更好的細胞附著。細胞生物學中通常使用的聚賴氨酸分子量范圍一般為70，000-150，OOOkD。已表明經聚賴氨酸處理的固體表面支持神經突長出和提高許多來源于中樞神經系統的細胞的存活。因為聚α-賴氨酸是合成化合物，故它通常不刺激培養細胞中的生物反應。因為它經合成產生，故它通常不包含任何可能是其他天然聚合物相關的問題的生物學雜質。在聚賴氨酸上常規培養的一些細胞系實例包括一ΗΕΚ293人胚腎細胞(Sugawara， Τ·等· A missense mutation of the Na+ channel alpha II subunit gene Na(V)L 2 in a patient with febrile and afebrile seizures causes channel dysfunction ( 患有發熱性和無熱性癲癇患者中Na+通道ex II亞基基因Na(V) 1. 2的錯義突變導致通道功能障礙).Proc NatlAcad Sci U S A. 98 (11)，6384-9，2001)、MDA-231 乳腺癌細胞系 (Yoneda, T.等.Inhibition of 溶骨性骨轉移 of breast cancer by combined treatment with the bisphosphonate ibandronate and tissue inhibitor of the 基質金屬蛋白酶-2(通過用伊班二膦酸鹽和基質金屬蛋白酶-2組織抑制劑的聯合治療抑制乳腺癌的溶骨性骨轉移).J. Cl in. Invest. 99 (10)，2509-17，1997) 、垂體前葉細胞(Hinuma, S， 等.A prolactin-releasing peptide in the brain (腦中釋放催乳素的月太)· Nature， 393 (6682)，272-6，1998)、小膠質 MG-7 細胞(Szczepanik, AM.等.Amyloid-beta peptide fragments p3 and p4 induce pro-inflammatory cytokine and chemokine production in vitro and in vivo (淀粉狀β肽片段p3和p4誘發體外和體內促炎細胞因子和趨化因子產生)· J. Neurochemistry, 77 (1)，304-17，2001)和大鼠原代星形膠質細胞(Little, EB.等.A short segment within the cytoplasmic domain of the neural cell adhesion molecule(N-CAM)isessential for N-CAM induced NF-kappa B activity in astrocytes (神經細胞粘著分子(N-CAM)的胞質域內的短節段對于星形膠質細胞中的 N-CAM 誘導的 NF-kappa B 活性是必不可少的)· PNAS USA，98 (5)，2238-43，2001)。聚L-賴氨酸也已用于培養作為圖案化共培養的兩種不同細胞。透明質酸用于將初始細胞固定到玻璃基材上。隨后，將聚L-賴氨酸以不連續圖案的方式吸附到透明質酸上，從而改變培養表面的性質，因此促進第二種類型細胞的粘著。已證明利用該方法共培養胚胎干細胞和成纖維細胞(Khademhosseinin, A.等· Layer-by-layer exposition of hyaluronic acid and poly L-Iysine for patterned cell co_cultures (透明質酸禾口聚賴氨酸的逐層沉積以使細胞共培養物圖案化)，Biomaterials, 25, 3583-92, 2004)。聚賴氨酸涂覆的電子顯微鏡樣品薄膜已用于觀察雙鏈和單鏈DNA分子。 (Williams, RC. Use of polylysine for adsorption of nuclei acids and enzymes to electron microscope specimen films (在電鏡樣品膜中使用聚賴氨酸吸附核酸和酶)， PNAS，74 (6),2311-2315，1977)。雙歧桿菌(Bifidobacterium)是存在于人腸道菌叢中不運動的革蘭氏陽性厭氧細菌。在微膠囊制備期間已將這些細菌結合到藻酸鹽聚L-賴氨酸微膠囊中，以有助于深低溫保藏。載有細菌的微膠囊經凍干，并進行長期深冷貯藏。在這種情況下，聚賴氨酸事實上不起冷凍保護劑的作用，而是用作穩定堿性藻酸鹽結構的工具(Cui，JH.等.Effect of Additives on the Viability of Bifidobacteria Loaded in Alginate Poly-l-lysineMicroparticles duri ng the Freeze—drying Process (在凍干過禾呈其月間添力口齊[J對裝載在藻酸鹽聚賴氨酸微粒中的雙歧桿菌的生存力的影響)，Arch Pharm. Res.，29 (8)，707-711， 2006)。聚L-賴氨酸涂覆的塑料和玻璃皿也已用于研究魚胚胎發育相關過程。魚卵通常不附著于許多經細胞培養物處理的表面。但是，這些卵會附著于已涂覆有聚賴氨酸的塑料和玻璃皿上。然后引入精子使卵子受精，并監測之后的發育過程(Andoh，Τ.等.The use of poly-L-lysine to facilitate examination of sperm entry into pelagic, non-adhesive fish eggs (使用聚賴氨酸便于觀察精子進入深海非粘著型魚卵)，Int. J. Dev. Biol. 52，753-7，2008)。實驗本發明的實施例僅提供用于闡述目的，不應視為限制由所附權利要求限定的本發明的范圍。本說明書下文和他處給出的所有參考文獻均通過引用包含于本文中。1.用聚D-賴氨酸涂覆細胞培養板將聚D-賴氨酸氫溴酸鹽(Sigma，P7405，> 300k 或 P6407，70_150k)—聚 D-賴氨酸溶解到無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，濃度為lOOng/ml。將等分試樣(50 μ 1)分配到96 孔細胞培養板的各孔中。將其在室溫(通常為25°C)下溫育30min。該時間過后，將任何剩余的聚D-賴氨酸溶液傾析，并用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS) (200 μ 1)洗滌各孔3次。保留最后加入的100 μ 1 PBS以防干燥。聚賴氨酸涂覆的板可在冰箱中貯藏數天， 但常規在48小時內使用。舉例給出聚D-賴氨酸的使用，且決非限制性的。2.深低溫保藏利用描述于“Cells-Αlaboratory Manual (細胞-實驗室手冊)”，Spector D. L.， Goldman R. D.禾口 Leinwand L. A. , Cold Spring Harbor laboratory press (1998)的常規細胞培養技術在細胞培養器皿中使細胞生長。在適當的生長期，使用市售Xl胰蛋白酶/ EDTA(乙二胺四乙酸)將細胞從細胞培養器皿表面移走，并重新懸浮到適當的細胞培養基中。按照制造商的說明書用Chemotec Nucleocounter測定細胞數目。將體積為100 μ 1禾口 20 μ 1的20，000或5，000個細胞分別分配到96孔或384孔用聚賴氨酸涂覆的Costar組織培養處理的白色聚苯乙烯細胞培養物測定板(商品目錄號 3917和3712)中，使其附著和復蘇16小時。第二天，除去培養基并用市售PBS洗滌細胞2 次。將由90%胎牛血清和10% DMSO組成的深低溫保藏培養基分配到附著細胞上面。然后， M parafiIm(Pechiney Plastic Packages) gJc Whatman Laboratory ^MM^MMM^a^f 板的邊緣,并用Saran Barrier Wrap (Dow Chemical Company)纏繞整個平板。將細胞培養板冷凍至-80°C持續16小時，之后轉移到-140°C長期貯藏。3.測定性能在復蘇時，將冷凍的細胞培養板從-140°C移走并使其解凍。除去深低溫保藏培養基，并用預熱的PBS洗滌細胞2次。然后加入補充有合適激動劑的測定培養基。利用對于所用報道分子系統最為合適的方法和/或市售試劑盒進行基于細胞的測定。( )聚賴氨酸對細胞附著和形態的影響在了解聚賴氨酸對細胞附著和形態的影響的過程中，比較深低溫保藏前后在涂覆和未涂覆聚賴氨酸的板上生長的細胞圖(圖1)。就CHO VSV- β 2AR-EGFP穩定細胞系(圖la)而言，在聚賴氨酸存在下觀察到隆起的細胞形態。當細胞在無聚賴氨酸情況下生長時，不存在該形態。就HEK293 VSV- β 2AR-EGFP穩定細胞(圖lb)而言，聚賴氨酸清楚地通過促進和維持細胞附著起作用。在無聚賴氨酸情況下，細胞可能在深低溫保藏和洗滌步驟期間脫離。 ii)聚賴氨酸對細胞系牛存力的影響在解凍后用Cell Titer-Glo發光細胞生存力測定(Promega)對接種到涂有聚賴氨酸的板上的細胞系的生存力進行測定。將細胞接種到96孔板(士聚賴氨酸)中、深低溫保藏，然后復蘇。可從圖2看到，就CHO VSV-β 2AR-EGFP穩定細胞系而言，當CHO細胞與或不與聚賴氨酸一起鋪板時，未發現細胞生存力的顯著差異，表明聚賴氨酸不促進細胞附著或改善深低溫保藏。然而，就HEK293 VSV-β 2AR-EGFP穩定細胞而言，聚賴氨酸的存在顯著提高了產生的發光信號。與細胞圖像數據一起，這些數據表明聚賴氨酸在深低溫保藏和洗滌步驟期間支持和維持ΗΕΚ293細胞附著。iii)聚賴氨酸對細胞測定件能的影響將細胞以20，000個細胞/孔的密度接種到帶有(+)或未帶有(_)聚賴氨酸的96 孔板中，并使其附著過夜，除去生長培養基并加入冷凍培養基(90%胎牛血清和10%二甲亞砜)。將板密封并深低溫保藏。作為對照，也利用傳統的“冷凍小瓶”保藏系統深低溫保藏細胞。(Cells-Α laboratory Manual (細胞-實驗室手冊)，Spector D. L. , Goldman R.D.禾口 Leinwand L. A. , Cold Spring Harbor laboratory press (1998)。為解凍冷凍小瓶中所含細胞，用細胞特異性生長培養基稀釋深低溫保藏培養基， 并將懸浮液離心(l，000Xg，5min)。將得到的細胞沉淀重新懸浮到新鮮的生長培養基中，并以20，000細胞/孔的密度將細胞分配到96孔板(帶有⑴和不帶㈠聚賴氨酸涂層)的孔中。在測定前，在37°C和5% CO2的條件下將細胞溫育16小時，以促進細胞附著。在測定時，將板從冰箱中移走并解凍。除去冷凍培養基，用PBS洗滌細胞，并加入含β 2AR激動劑異丙基腎上腺素的培養基。用DiscoverX的Hithunter cAMP II和 Leadseeker Instrument (GE Healthcare)監測在GPCR活化時cAMP水平的上升。利用毛喉素的腺苷酸環化酶測量用作對照(未顯示)。在描述的實驗中，用32AR激動劑異丙基腎上腺素或者拮抗劑異普萘洛爾 (isopropranolol)攻擊穩定轉染β 2AR的HEK293和CHO細胞。一旦暴露于激動劑，胞內cAMP濃度上升，這些濃度可通過多種市售發光試劑盒例如HitHunter cAMPII試劑盒 (DiscoveRx)聯合 Leadseeker Instrument 平臺(GE Healthcare)監測。作為對照，在用其相應的激動劑毛喉素攻擊遍在表達的腺苷酸環化酶活性時，也分別監測胞內cAMP濃度的上升。在AD293細胞系中，僅監測腺苷酸環化酶活性。由于DiscoveRx測定系統設計用于監測胞內cAMP濃度，故測定培養基補充有終濃度為ImM的一般性磷酸二酯酶抑制劑異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)。異丙基腎上腺素測定一將異丙基腎上腺素(Sigma 12760)溶于水中至儲備濃度為 IOOmM0然后將其稀釋以在測定培養基中產生最終的異丙基腎上腺素濃度范圍200 μ M-IpM0
毛喉素測定一將毛喉素(Sigma F6886_10mg)溶于DMSO中至儲備濃度為 10mM。然后用半對數稀釋法將其系列稀釋以在測定培養基中產生最終的毛喉素濃度范圍 316μΜ-3. 16ηΜ。 普萘洛爾測定一將普萘洛爾(Sigma P8688)溶于水中至儲備濃度為100mM。然后將其稀釋以在測定培養基中產生最終的普萘洛爾濃度范圍200μΜ-1ρΜ。在20ηΜ異丙基腎上腺素存在情況下作普萘洛爾的劑量應答曲線。也進行無激動劑對照，其中將減去激動劑或拮抗劑的測定培養基加入到細胞。DiscoveRx HitHunter cAMP II測定一這是按照制造商說明書進行，簡要包括以下步驟。在從-140°C的儲藏庫中復蘇時，使在細胞培養處理的96孔板上冷凍的細胞解凍。 在解凍時，除去深低溫保藏培養基并用PBS洗滌細胞2次。然后加入補充有ImM IBMX和合適的激動劑和/或拮抗劑的測定培養基。一般地，對于在96孔細胞培養處理的板中進行的測定，使用20，000個細胞。一經加入測定培養基到細胞，將測定板在37°C溫育30分鐘，之后加入40μ 1的DiscoveRx cAMP II ED/底物混合物。其由1份cAMP II ED試劑與1份Substrate Working Solution(Substrate Working Solution 由 1 份 Galacton_Star、5 份Emerald II 禾口 19 份 Substrate Diluent組成)組成。渦動測定板以確保有效的細胞覆蓋。然后加入等體積的 EA-Ab/Lysis混合物(40 μ 1)。其由1份cAMP II EA-Ab試劑和1份cAMP II裂解緩沖液組成。將測定板在室溫下溫育4小時，并通過利用Leadseeker Instrument平臺監測發光信號的產生來測定cAMP濃度。除了每孔僅分配5，000個細胞以及使用體積減少50%的DiscoveRx cAMP II ED/ Substrate混合物和EA-AB/Lysis混合物(即減少至20 μ 1)之外，在384孔細胞培養處理的板中進行的測定與上述一樣。就CHO VSV-β 2AR-EGFP細胞而言，在無聚賴氨酸情況下，相比用聚賴氨酸涂覆的冷凍小瓶和板，冷凍超過4周的板的測定性能在S/B、S/N和尤其Z-因子方面下降。以下兩種情況的細胞均表現出相當的測定性能(i)在涂覆和未涂覆聚賴氨酸的板上測定時的冷凍小瓶保藏細胞，和(ii)在涂覆聚賴氨酸的板上直接深低溫保藏和測定的細胞。可從表 1看出，對于在冷凍小瓶中深低溫保藏并隨后復蘇和轉移到微量滴定板以測定的細胞，聚賴氨酸似乎對測定性能基本無影響。表權利要求
1.一種深低溫保藏細胞培養物，包括 至少具有表面的容器、承載在所述表面上的冷凍細胞， 其特征在于所述表面涂覆有聚賴氨酸。
2.權利要求1的細胞培養物，其中聚賴氨酸選自聚D-賴氨酸、聚L-賴氨酸和其混合物。
3.前述權利要求中任一項的細胞培養物，其中所述容器選自器皿、小瓶、微量滴定板和細胞培養板。
4.前述權利要求中任一項的細胞培養物，其中所述細胞是貼壁細胞。
5.前述權利要求中任一項的細胞培養物，其中所述細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、 兩棲動物細胞、魚類細胞、爬行動物細胞和禽類細胞。
6.前述權利要求中任一項的細胞培養物，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
7.權利要求6的細胞培養物，其中所述細胞選自CHO細胞、HEK293細胞和AD293細胞。
8.一種在細胞培養物中深低溫保藏細胞的方法，所述方法包括以下步驟a)將含有細胞的培養基加到容器表面，使得所述細胞附著在所述表面上并形成細胞培養物，b)加入深低溫保藏培養基，和c.)將所述細胞培養物的溫度降低至-20°C或更低； 其特征在于在步驟a)之前用聚賴氨酸涂覆所述表面。
9.權利要求8的方法，其中聚賴氨酸選自聚D-賴氨酸、聚L-賴氨酸和其混合物。
10.權利要求8或9的方法，其中通過用聚賴氨酸的溶液洗滌所述表面來涂覆所述表面。
11.權利要求8-10中任一項的方法，其中所述容器選自器皿、小瓶、微量滴定板和細胞培養板。
12.權利要求8-11中任一項的方法，其中所述細胞是貼壁細胞。
13.權利要求8-12中任一項的方法，其中所述細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞、爬行動物細胞和禽類細胞。
14.權利要求8-13中任一項的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
15.權利要求8-14中任一項的方法，其中所述細胞選自CHO細胞、HEK293細胞和AD293 細胞。
16.權利要求8-15中任一項的方法，還包括在低于_80°C的溫度貯藏所述細胞培養物的步驟。
17.一種用于進行細胞測定的方法，所述方法包括以下步驟a)將含有細胞的培養基加到容器表面，使得所述細胞附著在所述表面上并形成細胞培養物，b)加入深低溫保藏培養基，c)降低所述培養基的溫度以冷凍所述細胞培養物，d)將所述細胞培養物貯藏在低于_20°C的溫度，e)通過升高所述細胞培養物的溫度解凍所述細胞；f)對所述細胞進行細胞測定，其特征在于在步驟a)之前用聚賴氨酸涂覆所述容器表面。
18.權利要求17的方法，其中所述細胞培養物貯藏在低于-80°C的溫度。
19.權利要求17或18的方法，其中聚賴氨酸選自聚D-賴氨酸、聚L-賴氨酸和其混合物。
20.權利要求17-19中任一項的方法，其中所述容器選自器皿、小瓶、微量滴定板和細胞培養板。
21.權利要求17-20中任一項的方法，其中所述細胞是貼壁細胞。
22.權利要求17-21中任一項的方法，其中將步驟a)的細胞附著在一種或多種微載體上。
23.權利要求22的方法，其中用聚賴氨酸涂覆所述一種或多種微載體。
24.權利要求17-23中任一項的方法，其中所述細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞、爬行動物細胞和禽類細胞。
25.權利要求17-24中任一項的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
26.權利要求17-25中任一項的方法，其中所述細胞選自CHO細胞、HEK293細胞和 AD293細胞。
全文摘要
本發明涉及深低溫保藏細胞培養物、用于深低溫保藏細胞的方法和用于對這樣的細胞進行細胞測定的方法。本發明的深低溫保藏細胞培養物包括至少具有用聚賴氨酸涂覆的表面的容器和承載在所述表面上的冷凍細胞。
文檔編號A01N1/02GK102256481SQ200980151813
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月16日 優先權日2008年12月18日
發明者A·M·多伊爾, P·J·塔特內爾, S·蓋姆 申請人:通用電氣醫療集團英國有限公司