細菌提取物刺激劑的制作方法

專利名稱：細菌提取物刺激劑的制作方法
技術領域：
本專利申請涉及能夠刺激負責植物(特別是茄屬的植物)自衛的代謝的細菌提取物。本發明還涉及用于生產此提取物和含有所述提取物的組合物的方法，其中所述組合物用于農業。最后，本發明涉及用于刺激植物自衛的方法，所述方法包括使用包含所述細菌提取物的組合物。
背景技術：
世界上約75%的生產損失可直接歸因于病害(Agrios 1997)。在此背景下，約的世界土豆生產的損失是由于細菌引起的病害，其中約40%的損失有時發生在發展中
國家(0erke，2006)。為避免損失，農業上必須使用農業化學制品。然而，這些用于防治病害的技術的應用因它們對環境和人類健康的影響而正在受到越來越多的質疑。為克服此困境，常規改良已經開發了更抗病害的栽培種。然而，對細菌病害的抗性品種仍然很少(Yi et al.，2004)。植物對病害的適應和抗性的產生可歸因于由涉及病原體存在識別的復雜機制引起的細胞代謝——例如蛋白合成和防御分子——的重要改變。通過給予刺激劑激活植物中的潛在抗性機制是一種用于農業病害防治的替代方法，該方法不使用對植物病原體具有直接作用并經常對人具有毒性作用的物質，例如殺真菌劑、殺細菌劑和殺線蟲劑。根據Medeiros et al. , (2003)，病原體與宿主植物細胞之間的接觸引發對所述病原體具有毒性的化合物的合成反應，類似于初級的人和動物的免疫系統。在某些情況下，難以確定所述植物反應發生在所述病原體識別之前還是之后。然而，通常情況下當植物受到微生物攻擊時，其能夠在侵入位置附近產生抑制分子，促進對所述病原體的生長抑制。植物與病原體的自然選擇和協同進化已經導致植物選擇一系列防御機制。依此， 人們認為抗性和易感性之間的差異可能是因為時間變化、細胞自主性或植物防御反應的強度(Moraes,1998)。非宿主植物中用于激活防御反應的病原體識別很可能由與所述病原體有關的分子的恒定水平——所述分子是所有微生物類別的特征——所決定，從而引起信號級聯放大，部分類似于介導動物體內先天免疫反應的那些機制(NUrnberger e Lipka, 2005).術語刺激劑最初用于指在植物細胞中誘導抗菌化合物(植物抗毒素)的合成或積累的分子及其他刺激物。植物抗毒素構成一組不同的隨后形成(subsequently-formed) 物質，所述物質在其分子中不含氮，其中，(環狀或非環狀)的類異黃酮、呋喃并乙炔 (furanoacetylene)或類萜化合物似乎是最重要的(Romeiro，2001)。目前，術語刺激劑用于指刺激植物中某種自衛機制的分子，所述自衛機制例如積累抗菌植物抗毒素、誘導細胞死亡(超敏反應)和合成抑制由病原體產生的降解酶的蛋白(Hahn，1996)。通常，刺激劑是植物致病性微生物的表面上的分子，所述分子在被施加于宿主或非宿主植物時會誘導所研究的病原-植物體系特有的抗性反應(Kortekamp and Zyprian，2003)。宿主受體——其識別所述病原體的刺激劑——的位置多數是未知的。研究表明這些受體存在于質膜之中或之外，而其他似乎位于細胞內區域中(Hutcheson，1998)。植物通過誘導對后續感染的長期且廣譜的抗性來對病原體感染起反應。多年來， 這種所誘導的對病害的抗性反應一直為人所知，并且具有不同的名稱，例如獲得性生理免疫或誘導性抗性；本文中我們使用英語縮寫SAR(系統獲得性抗性)來指代所述抗性反應 (Ryals et al. ，1994)。誘導系統抗性或系統獲得性抗性的現象被定義為由局部的植物病原體感染或者響應于不同非生物試劑的給藥而在植物中系統地誘導的對抗病害抗性的激活。在所述試劑中，我們可提及β-氨基丁酸(ΒΑΒΑ)、水楊酸(SA)以及各自的類似物，功能試劑例如2， 6-二氯異煙酸(INA)和苯并-[1，2，3]-噻二唑-7-硫代羥酸的S-甲基酯(benzo-(l,2, 3)-thiadiazole-7-carbothioic acid)(阿拉酸式苯-S-甲基，ASM) (Herbers et al, 1996 ； Guzzo，2004)。此外，SAR可由不同分子誘導，所述分子例如碳水化合物、糖蛋白、蛋白質和脂質(Ricci et al,Hahn et al.，1996)。這些分子可源自細菌中的胞外脂多糖、致病性真菌的細胞壁的糖蛋白、非致病性真菌的細胞壁的碳水化合物等(Hahn and Albershein, 1978 ； Koch et al. , 1998 ；Coventry and Dubery，2001)。為此目的，Wulff 禾口 Pascholati (1999) 進行了釀酒酵母(Saccharomyces cereviseae)細胞壁中存在的糖蛋白刺激劑的部分純化和生化表征，該刺激劑能夠誘導高粱的弱化中胚軸中植物抗毒素的合成。在馬鈴薯(Solanum tuberosum)中，SAR可由真菌馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)菌絲的細胞壁的組分例如P印-13寡肽所誘導(Halim，2004)，其中發生局部和系統的氧化燃燒。依此，用刺激劑對植物復葉的小葉進行的局部處理誘導了亞系統的、局部的氧化燃燒，即在相同葉片的其他未經處理的小葉上僅發生系統燃燒(Park et al. , 1998 ； Vleeshouwers et al. ,2000) 在遠離擬南芥(Arabidopsis)葉片中無毒病原體丁香假單胞菌(I^eudomonas syringae)接種位置的組織中，SAR在更幼小的葉片中更有效地發展， 并且此反應與水楊酸的大量積聚有關(Zeier，2005)。各種試劑可誘導植物中的防御代謝，促進對抗多種植物病原體的持久保護反應。 這些試劑(產品)代表新一代的商品農業防護劑，所述防護劑通常不對病原體產生直接作用，但是導致植物抗性的增加。由于所述植物抗性誘導劑苯并-[1，2，3]_噻二唑-7-硫代羥酸的S-甲基酯(阿拉酸式苯-S-甲基 ，ASM)的發現，在利用植物中不同防御機制的激活能力的產品的開發中取得了巨大的進步。在商業產品中，Novartis公司生產的阿拉酸式苯_S_甲基(ASM)—— 其商品名為Actigard(歐洲)或Bion (巴西)——已在巴西注冊用于番茄、柑橘和可可的栽培。ASM似乎通過誘導大麥植株中植物抗毒素分子(香豆素)的合成和酚化合物的快速積累，并降低真菌對葉片的侵入而起作用。因此，對小麥給予ASM誘導了植物中抗性蛋白(PR蛋白)的合成。Eden Bioscience公司生產的Messenger 是活性成分為一種稱為過敏素 (harpin)的蛋白的商品，所述蛋白是使用細菌——梨火疫病菌(Erwinia amylovora)分離和純化的，并用人工方法生產的以用于商業目的，例如大腸桿菌(Escherichia coli)。此蛋白重44kDa并在高溫下高度穩定，在自然狀態下與細菌壁相連。在噴灑Messenger 后，過敏素蛋白附著于植物細胞的受體上，并在施用約5-10分鐘后引發防御反應，所述防御反應在3-5天后完成(Eden Bioscience, 2002) 0該產品對動物無毒，并在日光照射的作用下或通過植物表面和土壤中的分解生物作用下迅速降解。KHH BioSci Inc 生產的 Milsana ⑧，由植物-大虎杖(Reynoutria
sachalinensis)的葉片提取物制備。將干燥且磨碎的植物材料(5g)與乙醇(IOOml)混合并噴灑到植物上。其已于2000年在美國注冊為生物殺蟲劑并用于觀賞植物(溫室)，幫助保護所述植物抵抗Oidio屬(Oidio spp)和灰霉——灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。此植物提取物引起I3R蛋白和植物抗毒素的積累，導致植物防御的增強。用Milsana 處理的黃瓜植物(Cucumis sativus)提高了其對黃瓜白粉菌 (Sphareotheca fuliginea)的抗性，引起植物內源性防御機制的提高，例如過氧化物酶、 β-1，3-葡聚糖酶的活性升高，以及產生對微生物具有毒性的糖基化酚化合物(Daayf et al.，1995)。此化合物的作用是可變的并依賴被保護的栽培品種。然而，此化合物對動物無毒并可產生類似于使用常規殺真菌劑時獲得的保護結果。Redox Chemicals 公司生產的 Oxycom 是活性氧簇(oxygen reactive species) 生產的誘導劑(過乙酸)(Hammerschimidt et al.，2001)與營養素混合物的結合物。在豆類植物中，此產品誘導編碼參與酚代謝和細胞壁增厚(強化)的蛋白并且與防御有關的基因的表達，并在煙草中誘導過氧化物酶和伸展蛋白(extensine)的表達。EID-Parry ^W]^zfe^ Neemazal(Azadirachta indica)白勺 取物獲得的產品，其已經作為殺蟲劑銷售。所述提取物的活性成分是三萜，其在所述商業產品中的濃度為5%。Quinabra公司生產Ecolife 40 由柑橘生物類黃酮(維生素P)、抗壞血酸(維生素C)、乳酸和檸檬酸構成，在工業上通過對取自檸檬植株的有機物的發酵和/或提取而獲得，還含有多酚和植物抗毒素。所述產品具有多種作用機制，其中通過增加植物抗毒素合成進行的抗性誘導似乎是最重要的機制之一(MOtOyama，2001)。所述產品對某些病害系統有效。Jayme et al. (1999)和Castro et al. (1999)著重指出了所述產品防治豆類植物中的白粉病和銹病的效力。類似地，feisparotto et al. Q000)證明了此產品可有效防治香蕉黑葉斑病(香蕉黑條葉斑病菌(Mycosphaerella fi jiensis))，顯示出類似于使用戊唑醇(tebuconazole)殺真菌劑獲得的保護水平，并具有不在果實上殘留的優點(Sanhueza， 2002)。Elexa 以一種由甲殼質衍生的碳水化合物分子作為其活性成分。在美國，有3 種含有甲殼質的產品:Elexa (0.95%殼聚糖)；Hygra Yield Enhancing Seed Treating Agent (2. 5%殼聚糖)和 Yea Poly-D-Glucosamine Solution O. 5%殼聚糖)。殼聚糖是主要見于節肢動物門動物中的多糖，其在植物中的作用機制類似于真菌侵害植物時所觀察到的機制。所述病原體通過對甲殼質單體的識別被感知，導致在系統獲得性抗性(SAR)的表達中達到頂點的生化反應。此產品被噴灑到草莓、番茄和蘋果作物上，引起植物抗性的增加。BioSafe生產的Oryzemate 主要作為殺真菌劑用于水稻耕作。然而，已經證明此產品對水稻病原體無直接作用，但其促進植物對微生物抗性的增加。此產品的成分包括 sulphamoilbenzaoto、糖精和N-β -D-吡喃葡萄糖基糖精。這種分子的混合物誘導防御蛋白PRRl的表達，促進對病原體稻瘟霉(Pyricularia oryzae)的抗性。可使用細菌培養物的提取物作為生物殺蟲劑。根據美國國家環境保護局(United States Environmental Protection Agency，EPA)采用的定義，生物殺蟲劑是來源于天然材料(例如動物、細菌和某些礦物質)的某些類型的殺蟲劑(http://www. epa. rov/ pesticides/biopesticides)0盡管EPA目前列出了多種注冊產品例如生物殺蟲劑，包括誘導植物系統抗性的生物殺蟲劑，然而許多其他促進植物抗性的產品由于高昂的產品(例如殺蟲劑)注冊費用而沒有作為生物殺蟲劑注冊(Anderson et al.，2006)。關于專利的出版來源包括多種與刺激劑組合物有關的文獻，其中與本發明最相關的描述如下。文獻Pl 0402152-5由通過復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)的酵母進行的捕食過程對儲藏食品中或農田中酵母和真菌進行的生物防治構成。文獻Pl 0402152-5使用來自加拿大的外來活酵母，所述酵母被直接引到植株或其部分上，所述植株或其部分必須被保護免于受到降解微生物或產毒素物的作用。文獻US 5，968，504使用真菌鏈孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)通過對致病性真菌生長的競爭和抑制機制作為生物防治試劑。本發明與所引用文獻不同，因為本發明促進植物防御機制的提高，而不與降解微生物或造成植物病害的微生物直接相互作用。依此，本發明不倚賴存在拮抗生態相互作用
(antagonistic ecological interaction)--例如競爭、寄生、抗菌素的產生，并且不需
要冒動物和人的條件致病菌定殖的風險。文獻Pl 0418380-0A由生物提取物的復合混合物的應用構成，所述混合物在被噴灑到植物上時在植物中促進對植物致病性黃單胞菌OCanthomonas)侵襲的抗性的誘導。所述產品由非植物致病性黃單胞菌屬哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和植物西地格絲蘭 (Yucca schidigera)的提取物的混合物構成。所述產品促進對植物天然防御系統的誘導， 所述防御系統可抵抗黃單胞菌屬品種及其變種。本發明與所述文獻不同，因為本發明促進對這樣的病原體的抗性，即所述病原體與從中獲得所述提取物的細菌無關。本發明由含有柑橘潰瘍病黃單胞菌(Xanthomonas axonopodis pathovar. citri)的提取物構成，所述提取物——優選被噴灑到例如馬鈴薯的植株、秧苗和種子上——在茄科植物中誘導抵抗細菌和致病性真菌的天然植物防御， 其中所述細菌優選胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)，真菌優選索蘭尼鏈格孢 (Alternaria solani)。文獻 US 6，242，420 涉及由真菌綠木霉(Trichoderma virens)的培養物中提取和純化、并以溶液形式施用于植株、秧苗和種子上的蛋白(分子量為18kDa) 的使用。本發明與此文獻不同，因為本發明使用柑橘潰瘍病黃單胞菌的提取物，所述提取物同時含有來自細胞壁和胞質組分的結構。因此，可看出現有技術未記載甚至未暗示本發明的目的，因此本發明滿足專利性的要求。

發明內容
在第一方面，本發明提供能夠促進和/或刺激植物抵抗病原體的天然防御的細菌提取物。本發明的一個目的是含有從黃單胞菌屬的細菌獲得的質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白的提取物。本發明的另一目的是一種組合物，包含a)含有從黃單胞菌屬的細菌獲得的質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白的提取物，和b)可接受賦形劑(vehicle)。具體而言，所述組合物被施用于農業上有價值的植物例如馬鈴薯，并且所述賦形劑可為用于稀釋所述提取物的相同培養基。在第二方面，本發明提供一種通過培養和裂解細菌來生產提取物的方法。本發明的另一目的是一種包括以下步驟的方法a)在液體培養基中培養黃單胞菌屬的細菌；b)裂解所培養的細菌，得到質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白；以及c)稀釋提取物。本發明的第三方面記載了一種用于刺激植物防御的方法，包括對需要刺激物以產生防御的植物給予包含以下組分的組合物的步驟a)含有從黃單胞菌屬的細菌獲得的質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白的提取物，和b)可接受賦形劑。本發明的這些和其他目的將在下面進行詳細描述。


圖1示出了在用細菌懸液多次接種后分析的馬鈴薯的葉片(接種后48和96小時)。圖A顯示酚化合物，圖B顯示類黃酮的含量。不同字母標示顯著差異(AN0VA，TUrkey P ( 0. 05)。進行三次獨立實驗，結果相似1-未經處理的葉片；2-水；3-柑橘潰瘍病黃單胞菌；4-胡蘿卜軟腐歐文氏菌。圖2說明了在用細菌懸液接種后分析的馬鈴薯葉片上的多酚氧化酶的活性(接種后48和96小時)。不同字母標示顯著差異(ANOVA，Turkey ρ ^ 0. 05)。進行三次獨立實驗，結果相似1-未經處理的葉片；2-水；3-柑橘潰瘍病黃單胞菌；4-胡蘿卜軟腐歐文氏菌。圖3說明了用經高壓滅菌的柑橘潰瘍病黃單胞菌的提取物噴灑或用水(對照)噴灑的馬鈴薯植株的死亡百分比。在噴灑后，用病原體胡蘿卜軟腐歐文氏菌接種全部植株。對照(□)；提取物(■)圖4說明了具有由植物病原細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌導致的病害癥狀的馬鈴薯植株葉片的百分比。所述植株事先用經高壓滅菌的柑橘潰瘍病黃單胞菌的提取物、用抗性誘導劑Bion 或用水(對照)噴灑過一次。在噴灑全部植株后，將它們用病原體胡蘿卜軟腐歐文氏菌接種。用所述病原體接種72天后進行結果分析。
具體實施方式
這里給出的實施例僅為舉例說明本發明的多種結果之一但不構成限制，因為類似的結果也處于本發明的范圍內。本發明的細菌提取物的優點是需要較少的植株施用次數(僅一次)，產生持續約 60天的高免疫率(rate of immunisation) 0另一優點是使用來源于天然環境的生物誘導劑(黃單胞菌屬)，其用于誘導適于巴西環境的茄屬植物的抗性。所述誘導劑與所述植物之間的接近度增加了免疫中產生更大效力的機率。在此背景下，本發明用于增加馬鈴薯對細菌和真菌的抗性，藉此降低在這些微生物引起的病害防治中使用的農業有毒物質的水平。本發明優選的可產生所述提取物的細菌選自黃單胞菌屬。優選細菌品種的實例包括但不限于柑橘潰瘍病黃單胞菌，其是造成芝麻菜和柑橘植株病害(柑橘潰瘍)的土壤來源細菌。用于配制所述產品的作用物優選柑橘潰瘍病黃單胞菌；也可使用任何其他致病性或非致病性微生物。所述細菌的同義詞如下Pseudomonas citri Hasse、Xanthomonas citri (Hasse) Dowson、Xanthomonas citri f. sp. aurantifoliae Namekata & Oliveira、Xanthomonas campestris pv.Citri(Hasse)Dye 1978、Xanthomonas campestris pv.Aurantifolii Gabriel et al.、Xanthomonas citri (ex Hasse)nom. rev. Gabriel et al.、Xanthomonas axonopodis pv. Aurantifolii Vauterin et al. 0柑橘潰瘍病黃單胞菌的培養物可從被感染并呈現病害(柑橘潰瘍)癥狀的柑橘植株獲得，所述病害的特征是油狀、微小、環狀膿皰的形成以及被感染葉片的背軸面(abaxial surface)上的棕色。分離平板使得可觀察該屬特有的黃橙色克隆著色。此分離可依照 Meneguim et al. 2007記載的技術使用營養瓊脂進行。細菌柑橘潰瘍病黃單胞菌的培養物用于生產水性提取物。這些細菌的提取物以其原始形式用于所述試驗，而不使用任何純化方法或工藝。將接受所述提取物的植物是農業常見的可栽培植物。這些植物的實例包括屬于茄科，特別是屬于茄屬的植物。優選品種是馬鈴薯。所述提取物可有效抵御被認為在可栽培植物中是致病性的細菌和/或真菌。這些細菌和/或真菌的實例包括但不限于廣泛分布于環境中的土壤細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌古月胃卜 @冑1 禾中(Erwiriia carotovora subsp. carotovora),
害，其中馬鈴薯被此病原體感染最多。此細菌在收獲后和塊莖儲存中引起軟腐病和腐根病， 影響農田中的植物。胡蘿卜軟腐歐文氏菌屬于復雜分類群，由具有廣泛表型的、生化和遺傳變種并且具有不同宿主的株系構成。提取方法所述提取方法包括以下步驟a)在液體培養基中培養黃單胞菌屬的細菌；b)裂解所培養的細菌，得到質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白；以及c)稀釋提取物。優選地，所述方法由以下全部步驟構成1.選擇黃單胞菌屬細菌；2.在液體培養基中培養黃單胞菌屬細菌，優選柑橘潰瘍病黃單胞菌；
3.從所述培養基中取出細菌，優選通過離心；4.重懸浮所述細菌并調節細菌溶液的光密度(DO· = 1. OOAbs)；5.使用物理和化學方法裂解所述細菌，優選在121°C下高壓滅菌20分鐘。6.稀釋所述提取物(5ml提取物/L)，溶劑可為水，有機溶劑例如乙醇、甲醇，無機溶劑或其結合物。7.噴灑要保護植物的葉片(IOml/植株)。包含所述提取物的組合物是農用組合物，包含a)含有從黃單胞菌屬的細菌獲得的質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白的提取物，和b)可接受賦形劑。可接受賦形劑是可使所述組合物分散的任何賦形劑。此外，所述組合物可為液體或固體形式。所述賦形劑甚至可以是所述提取物的稀釋培養基。所形成的產品由細菌柑橘潰瘍病黃單胞菌的提取物構成，優選在水中配制；也可使用其他有機或無機溶劑。所述提取物的濃度在600nm下可在0. 1到1. 5Abs之間。所述提取物由所述細菌的細胞壁和胞質組分碎片構成。所述提取物優選通過使用超聲波和3個 M小時的冷凍-解凍(_20°C )循環制備；也可使用其他物理和化學方法來促進細菌裂解并得到所述提取物。所形成的產品的濃度為在液體培養基中制備的5ml原始提取物。對每株植株使用 IOml所述產品，優選直接對植株或根使用噴灑方法；可使用粉末形式或任何其他形式。其可以單獨使用或者與殺真菌劑或其他增強對防御相關代謝的誘導的生物和非生物因子結合使用。其使用也可借助促進與所述植物附著的表面活性劑進行。實施例1胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種細菌用于在施用所述抗性誘導產品后評估其在馬鈴薯植株抗性試驗中的有效性。使用置于溫室中的7周齡的盆栽馬鈴薯植株。用H2O配制含有柑橘潰瘍病黃單胞菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種細菌的細菌懸液(Abs 0.3-0.4，600nm)。用帶有針頭的注射器在頂生小葉的背軸面上進行對分枝的基部、中部和頂部葉片的接種。施用所述產品以誘導植物抗性代謝與用病原體進行試驗之間的時間為5天。僅對所述植株進行一次施用。采集經處理植株的不同葉片的樣品(每片0.5g)，然后通過將所述樣品浸泡在 80%甲醇中進行提取，這用于定量酚化合物O^olin-Ciocaulteau法)和類黃酮(硝酸鋁和乙酸鉀)。在通過將所述葉片浸泡在冷磷酸鹽緩沖液中得到的提取物中進行酶活力的測定。 對于PPO酶的活性，在含有氯原酸底物的緩沖液中評估吸光度的不同。對結果進行單向方差分析(P彡0. 05)和Tukey檢驗。在接種柑橘潰瘍病黃單胞菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌后，觀察所述植株以檢查病害癥狀的發展，并從所述葉片采樣以評估繼發的代謝植物防御的標志物水平(酚化合物、類黃酮、多酚氧化酶(poliphenoloxidase)和過氧化物酶的酶活力)。在被所述細菌接種的葉片區域可觀察到防御反應的形成。該事實表明馬鈴薯植株具有識別柑橘潰瘍病黃單胞菌的存在、誘導抑制所述細菌在其組織中發展的防御反應的能力。在馬鈴薯葉片中接種胡蘿卜軟腐歐文氏菌培養物導致病害癥狀形成，繼而導致植株死亡。此結果表明此植物品種沒有抵抗致病性植物病原細菌侵害的防御機制。所述植物因細胞上缺乏可識別所述植物病原細菌的特異性受體或所述受體的敏感性低而不能保護所述植物。用胡蘿卜軟腐歐文氏菌接種的植株未表現出生化防御反應——例如酚化合物水平的升高(圖1A)。然而，柑橘潰瘍病黃單胞菌的存在促進與植物防御相關的化合物大量增加，表明誘導了防御反應。依此，當用柑橘潰瘍病黃單胞菌接種馬鈴薯植株時，在所述馬鈴薯植株葉片中的類黃酮的水平呈現大量且穩定的增加(圖1B)。酚化合物和類黃酮的水平均增加代表抵抗微生物侵害的植物防御機制。在分析與植物防御機制相關的酶活力時，觀察到柑橘潰瘍病黃單胞菌促進活性的明顯提高(圖幻。在所述實驗中使用的細菌中，觀察到柑橘潰瘍病黃單胞菌引起酚類和類黃酮的增加以及PPO活性的增加。此結果表明此植物病原細菌作為與馬鈴薯栽培品種中的防御相關的代謝誘導劑起作用。所述結果表明柑橘潰瘍病黃單胞菌誘導了與植物防御相關的代謝的有效增加。實施例2為評估柑橘潰瘍病黃單胞菌提取物增加馬鈴薯植株對致病性植物病原細菌的抗性的效力，施用經高壓滅菌的柑橘潰瘍病黃單胞菌提取物并隨后用致病性細菌接種。使用約12周齡的馬鈴薯植株。用H2O配制含有柑橘潰瘍病黃單胞菌的細菌懸液 (Abs 0. 3-0. 4,600nm)。將所述細菌懸液在120°C和Iatm下高壓滅菌20分鐘。將所述植株用經高壓滅菌的柑橘潰瘍病黃單胞菌細菌懸液或用無菌蒸餾水噴灑僅一次。在噴灑5天后，用來自馬鈴薯植株的致病性植物病原細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌的培養物接種全部植株。此接種依照與之前所用相同的方法，但是用無針頭的注射器接種葉片。在此試驗中，在將致病性植物病原細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌直接施用至葉片的接種78 天后，觀察到先使植株與所述經高壓滅菌的柑橘潰瘍病黃單胞菌提取物接觸可使死亡減少 60% (圖 3)。在用胡蘿卜軟腐歐文氏菌接種78天后，對照給藥(用水噴灑)呈現75%的死亡率。這些結果證明了柑橘潰瘍病黃單胞菌栽培方法對降低隨后植物病原細菌侵害以及降低其他致病性微生物的可能侵害的保護效果，證據是死亡的延遲和植株死亡率的降低。在此實驗中，柑橘潰瘍病黃單胞菌提取物僅施用一次；也可增加施用次數以進一步提高植株保護作用的水平。將所述經高壓滅菌的柑橘潰瘍病黃單胞菌提取物的效力與作為馬鈴薯抗性誘導劑(類別植物激活劑)使用的商品 Bion 500WG(Syngenta Prote9ao de Cultivos Ltda.公司)進行比較，以評估所誘導的保護作用的百分比。為此，施用經高壓滅菌的柑橘潰瘍病黃單胞菌提取物、Bion 溶液(濃度為0. 0005g/植株)或水，然后用致病性細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌接種。抗性誘導劑或水僅進行一次噴灑。當比較黃單胞菌屬提取物的免疫效果與商品Bion 產生的保護作用時，可確認所述細菌提取物明顯優于其他給藥(圖4)。這些結果表明黃單胞菌屬提取物對于誘導馬鈴薯抗性的增加非常有效。尚不知此反應的機制或確切途徑，但其肯定涉及對植物防御機制的刺激并可能包括酚化合物的合成途徑。這種高水平效力還可能與以下情況有關使用復合提取物代替單一分子例如阿拉酸式苯-S-甲基(Bion )，從而使得植物中多個反應途徑的共同激活。
權利要求
1.一種細菌提取物刺激劑，其中包含從黃單胞菌(Xanthomonas)屬的細菌獲得的質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白。
2.權利要求1的細菌提取物，其中所述細菌選自柑橘潰瘍病黃單胞菌(Xanthomonas citri)、里予油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、地毪草黃單胞菌(Xanthomonas axonopodis)及其組合。
3.—種細菌提取物的生產方法，其特征在于包括以下步驟a.培養黃單胞菌屬的細菌；b.裂解所培養的細菌，得到質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白；以及c.稀釋提取物。
4.權利要求3的方法，其特征在于所述細菌選自柑橘潰瘍病黃單胞菌、野野油菜黃單胞菌、地毯草黃單胞菌及其組合。
5.權利要求3的方法，其特征在于包括選擇細菌的預備步驟。
6.權利要求3的方法，其特征在于在液體培養基中培養細菌。
7.權利要求3的方法，其特征在于包括從液體培養基中分離所述細菌的步驟。
8.權利要求7的方法，其特征在于通過離心進行分離。
9.權利要求3的方法，其特征在于通過物理和/或化學方法進行裂解。
10.權利要求9的方法，其特征在于通過高壓滅菌進行裂解。
11.權利要求3的方法，其特征在于所述稀釋溶劑選自水、乙醇、甲醇及其組合。
12.權利要求11的方法，其特征在于所述提取物的終濃度在600nm下在0.1到1. 5Abs 之間。
13.包含細菌提取物的組合物，其特征在于包含以下組分a.包含從黃單胞菌屬的細菌獲得的質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白的提取物，和b.可接受的賦形劑。
14.權利要求13的組合物，其特征在于所述細菌選自柑橘潰瘍病黃單胞菌、野油菜黃單胞菌、地毯草黃單胞菌及其組合。
15.權利要求13的組合物，其特征在于其為固體或液體形式。
16.權利要求15的組合物，其特征在于液體形式的賦形劑為培養基。
17.權利要求13的組合物，其特征在于將其噴灑于植物。
18.權利要求17的組合物，其特征在于所述植物屬于茄(Solanaceae)科。
19.權利要求18的組合物，其特征在于所述植物是馬鈴薯(Solanumtuberosum)。
20.權利要求13的組合物，其特征在于還包含促進所述組合物附著于植株上的試劑。
21.一種用于植物的防御刺激方法，其特征在于包括給予包含細菌提取物刺激劑的組合物，所述細菌提取物刺激劑包含從黃單胞菌屬的細菌獲得的質膜碎片、細胞壁和胞質蛋白。
22.權利要求21的組合物，其特征在于所述植物為馬鈴薯(Solanumtuberosum)。
23.權利要求21的組合物，其特征在于所述提取物可施用于所述植物的葉片和/或根。
全文摘要
本發明誘導馬鈴薯植株抗性的增加，而對所述植株無明顯毒性。預實驗表明植物代謝的增加有效地促進(大于60％)致病性植物病原細菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)——導致馬鈴薯病害的主要作用物之一——的繁殖下降。
文檔編號A01N63/02GK102256495SQ200980150963
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月16日 優先權日2008年12月16日
發明者F·R·達拉瑪斯, L·V·阿斯塔麗塔, V·A·D·波依阿提 申請人:巴西教育和援助聯盟