高通量和非侵襲性玻璃化豬胚胎的方法

專利名稱：高通量和非侵襲性玻璃化豬胚胎的方法
技術領域：
本發明涉及一種豬胚胎保存的方法，尤其涉及一種新的和改進的體外制備的豬胚胎的保存方法。
背景技術：
早期哺乳動物胚胎的成功低溫保存為種質保存以及全國性及國際性遺傳學運動提供了機會。令人遺憾的是，豬胚胎比很多哺乳動物胚胎難以低溫保存。基于觀察到豬胚胎對低溫條件非常敏感、去除胞內脂質(去脂)可以減輕這種敏感性[1_4]，成功低溫保存豬胚胎已取得顯著的進步。因為考慮與在體外制備胚胎相比更具發展競爭性，大多數研究集中于體內制備胚胎。可選擇的機械去脂法包括搖動細胞骨架[5]或改變玻璃化條件[6_8]。根據早期低溫保存在體內制備出的胚胎的研究，豬卵母細胞或者具有完整透明帶的胚胎在離心作用之后，極化的脂質微滴往往與卵母細胞的細胞質或者胚的分裂球仍通過橋樣結構保持連接[11]。在隨后培養或者低溫保存過程中，極化脂質微滴能再分配進入卵母細胞或者分裂球。如果卵周隙擴大，在離心作用后橋樣結構將破裂，脂質微滴將不再分配進入卵母細胞的細胞質或者胚胎的分裂球，但仍停留在完整的透明帶里。因此在體內衍生的胚胎需要在離心作用之后立即低溫保存，以防止低溫保存之前脂質再分配。之前的研究還發現，豬胚胎初期有豐富的、大的脂質微滴，在胚胎向胚泡期轉化并超過時，其尺寸和豐度逐漸下降[15’16]。有趣的是，早期胚胎里的大脂質微滴比后期胚胎里較小脂質微滴更容易通過離心作用去除。在豬胚胎例如由試管受精(IVF)獲得或者通過核轉移(NT)衍生的胚胎的體外制備過程中，已經用來建立疾病模型或者作為異體轉移的潛在的器官捐獻者。結果，對在體外制備的胚胎進行有效的低溫保存的需求已經大大增加。然而，與在體內制備的配對物相比， 在體外制備的(IVP)胚胎對低溫保存更敏感，因此低溫保存更難。迄今，成功實現低溫保存IVP胚胎是非常有限的。2006年，發明者實驗室報告了由低溫保存的NT胚胎制備出的兩窩轉基因小豬氣后續，Nagashima等_報告了由低溫保存的IVF衍生的胚胎制備成的小豬。然而，這兩個成功的報告低溫保存IVF或者NT衍生的胚都是通過離心和顯微操作使用機械去脂法[9’1(1]。因為在顯微操作期間能夠予以透明帶損害，機械去脂大幅增加病原體傳播的可能。這也是勞動密集和費時的。其他兩組[13’14]報告嘗試使用部分酶消化而隨后離心的方法改進豬單性生殖胚和手工克隆胚胎的低溫保存的存活率。具體講，當胰蛋白酶，鏈霉蛋白酶或者其他酶部分消化透明帶后，其尺寸膨脹，這導致卵母細胞質膜和透明帶之間的空間的量增加。因此當卵母細胞或者胚胎離心足夠時，出現可以使脂質完全分離的空間。然而，當用于脂質分離時，部分酶消化處理存在一些缺點。例如，酶(例如胰蛋白酶或者鏈霉蛋白酶)能引起單性生殖的卵母細胞激活。另外，酶消化處理可能無法連續工作、并且需要小組緊密地觀察和監督，因為酶處理的效果嚴重依賴于個體批次的酶。而且，兩組都沒有報告使用酶消化和離心作用方法的聯合從低溫保存的胚胎制備任何小豬。因此，需要發展一種實用的和非侵襲性的用于脂質分離和低溫保存IVP(例如 IVF-衍生的或NT-衍生的)豬胚胎的方法，其適于研究和商業目的。發明概述在本發明的一個方面，描述一種新的和改進的從體外制備(IVP)(試管受精(IVF) 衍生的或者核轉移(NT)制備的)的豬胚胎細胞質中分離或者去除脂質的方法。本發明所述的脂質去除方法包括以下步驟(1)在單細胞或者分裂期(在壓實之前)制備IVP豬胚胎， (2)凝縮所述胚胎以制備凝縮的胚胎，以及C3)離心凝縮的胚胎以從細胞質中分離脂質，從而制備脂質分離的胚胎。根據本發明方法的一個實施例，胚胎的體積可通過高同滲質量摩爾濃度處理進行凝縮。特別是，在處于壓實之前單細胞或者分裂期的IVF或者NT衍生的胚胎可暴露于具有預選擇的高同滲質量摩爾濃度(比在前的培養基大)的介質中預定的較短時間期間。根據任何標準程序，介質的同滲質量摩爾濃度可以通過向介質中添加下列物質調節鹽，例如氯化鈉，糖，例如蔗糖，棉白糖，果糖，甘露醇，ortrehalose或者其他有機試劑，例如DMSO或者乙二醇。在本發明的另一個方面，描述一種新的和改進的低溫保存和后續轉移脂質分離的 IVF或者NT衍生的豬胚胎的方法。脂質分離的豬胚胎可在胚胎進一步發育到胚泡期之后被低溫保存，并且對其進行玻璃化。玻璃化的胚胎可以加熱，它們的透明帶去除，并且轉移至接受者(例如代孕豬)。附圖簡述


圖1是本發明的低溫保存和恢復過程的流程圖。圖2(a)到(f)是在高同滲質量摩爾濃度處理之后試管受精衍生的胚胎的發育過程的照片。圖3 (a)到(f)是在高同滲質量摩爾濃度處理之后NT衍生的胚胎的發育過程的照片。圖4包括用不同的滲透性(通過氯化鈉或者蔗糖調節)處理的胚胎照片(第1排) 和離心處理后它們相應的及時胚胎照片(第2排)。發明詳述除特殊情況外，本發明使用全部技術和科學術語屬于本領域普通技術人員所理解通常的范疇。提及的全部出版物，專利申請，專利以及參考文獻通過引用并入本文。本發明，在前期研究的基礎上，教導在早期胚胎發育期脂質去除或者分離，對于低溫保存IVP (IVF-或-NT-衍生的)豬胚胎是關鍵的，并且另外通過部分酶消化來膨脹透明帶，可以通過凝縮胚胎的體積以擴大IVP豬胚胎的卵周隙，從而能夠使脂質去除/分離更容易。本發明還公開了將IVP胚胎暴露于高同滲質量摩爾濃度處理可以凝縮胚胎但仍然使胚胎保有活性。而且，和需要顯微操作單個卵母細胞或胚胎的目前去脂方法相比，本發明的脂質分離方法可用于一次處理多個胚胎。
參照
圖1，其是通過本發明的胚胎凝縮方法來進行本發明的低溫保存和恢復過程的流程圖。
圖1的步驟1提供預選擇的早期發育期、特別是在壓實之前單細胞或者分裂期的IVP胚胎。適用任何標準IVP方法，例如IVF或NT。根據本發明方法的一個實施例，體外受精過程可開始于從一個或多個豬卵巢的竇狀濾泡中抽取卵母細胞。卵母細胞可在成熟培養基中培養至成熟一段時間，然后剝離。示例性成熟培養基可含有 TCM199(Gibco，31100035，Grand Island，紐約)，有 0. 的 PVA， 3. 05mmol/L葡萄糖，0. 91mmol/L丙酮酸鈉，0. 57mmol/L半胱氨酸，0. 5 μ g/mL黃體生成素， 0. 5 μ g/mL促濾泡激素，10ng/ml黃體生成素表皮生長因子，75 μ g/mL青霉素和50 μ g/mL鏈霉素。卵母細胞可在成熟培養基內、在38. 5°C,5% CO2的濕空氣中培養約40-44小時。成熟后，卵母細胞可在補充0. 的PVA和0. 的透明質酸酶的TL-HEPES_中由通過旋渦一段時間例如約4分鐘清除丘細胞后被剝離。被剝離的卵母細胞在授精之前可以被儲存在很多不同的培養基里。良好的培養基可含有TCM 199，有0.6mmol/L碳酸氫鈉，2.9mmol/L Hepes,50y g/ml 青霉素，60gy g/ml 鏈霉素，30mmol/L 氯化鈉和;3mg/ml BSA[26]。制備IVP胚胎可遵循任何標準授精方法。根據一個實施例，被剝離的有極體的卵母細胞可首先被轉移到合適的IVF介質中與懸浮精子結合。示例性IVF介質可以含有改進 tris-緩沖的培養基，有113. lmmol/L氯化鈉，3mmol/L氯化鉀，7. 5mmo/L氯化鈣，5mmol/L 丙酮酸鈉，llmmol/L 葡萄糖，20mmol/L tris，2mmol/L 咖啡因和 2mg/ml BSA。根據本發明的另一個實施例，NT衍生的胚胎可開始于核轉移供體細胞和商業的卵母細胞。核轉移供體細胞可以從轉基因小豬或者通過野生型細胞的遺傳修飾產生的細胞收集。在卵母細胞成熟后，在補充0. 的PVA和0. 的透明質酸酶的TL-HEPES中旋渦約4 分鐘清除丘細胞。來自這些卵母細胞的第一極體和相鄰的細胞質在含有7. 0 μ g/ml細胞松弛素B操作介質中被抽出。隨后，供體細胞被轉移進卵間隙。在兩個1. 2Kv/cm的30 μ s脈沖下、在融合/活化介質(例如0. 3Μ甘露醇，1. OmM氯化鈣，0. ImM氯化鎂和0. 5mM HEPES) 中，融合和活化同步完成。或者，融合和活化可以分步驟完成，首先在融合中暴露于只有低濃度鈣的介質(例如，0. 3M甘露醇，0. ImM氯化鈣，0. ImM氯化鎂和0. 5mM HEPES)，然后在暗處暴露于200 μ M硫柳汞中約10分鐘，然后在8mM DTT中30分鐘以活化[21]，或者其他任何合適的方法。在授精或者NT之后，IVP胚胎培養至單細胞或者分裂期(受精卵，2細胞或4細胞期，在壓實之前)。可使用任何合適的培養方法。根據一個實施例，IVP胚胎(由試管受精或者NT衍生)可以在38. 5°C,5% CO2的空氣中在多種不同的培養基內培養觀到30小時， 以選擇2細胞期的胚胎。示例性培養基PZM3[27]可以包含108. Ommol/L氯化鈉，10. 0mmol/L 氯化鉀，0. 35mmol/L磷酸二氫鉀，0. 4mmol/L七水硫酸鎂，25. 07mmol/L碳碳氫鈉，0. 2mmol/ L丙酮酸鈉，2. 0mmol/L五水二鈣(乳酸鹽)，1. 0mmol/L谷氨酰胺，5. 0mmol/L亞牛磺酸， 20ml/L BME氨基酸溶液，10ml/L MEM氨基酸溶液，0. 05mg/ml慶大霉素，Sng/ml BSA，滲透壓 288士2，pH 7. 3士2。
圖1中步驟2增加胚胎的同滲質量摩爾濃度以凝縮胚胎。可使用幾種不同的介質配方增加同滲質量摩爾濃度，以凝縮卵母細胞或胚胎的體積。本發明提供使用在不同濃度 (導致不同的同滲質量摩爾濃度)下氯化鈉或者蔗糖的例子，但其他導致高同滲質量摩爾濃度和隨后細胞體積收縮的配方應有效。
根據本發明方法的一個實施例，可通過調整浸沒胚胎的介質的同滲質量摩爾濃度來增加同滲質量摩爾濃度。例如，氯化鈉或蔗糖可以以約300m0smo(例如，300-3IOmOsmo的儲備溶液，有7. 0 μ g/ml黃體生成素細胞松弛素B和0. lmg/ml BSA)添加到儲備介質中，以獲得具有各種同滲質量摩爾濃度的介質，例如350，400，500，600和800-850m0smo。在離心之前，IVP衍生的胚胎可暴露在預選擇的高同滲質量摩爾濃度介質中較短時間，約5到10分鐘。
圖1中的步驟3從凝縮的胚胎中分離脂質，通常通過離心進行。例如，在高同滲質量摩爾濃度介質中凝縮的胚胎可以以13，400X克離心約6到20分鐘。離心條件(力或者時間)可以改變離心作用力和時間長短，只要足以實現全脂質分離同時保持胚胎的活性。 如果力增大，處理時間可特別地縮短。同樣如果使用較小的力，可需要更長的時間。過長時間暴露在高同滲質量摩爾濃度下可影響胚胎的活力。培養約12個小時后可檢查脂質分離；在一些情況下(特別是NT衍生的胚胎，因為它們相對更有價值)可進行第二輪高同滲質量摩爾濃度處理和隨后的離心以實現相對完全的脂質分離。第二輪高同滲質量摩爾濃度處理可是任選的，只要在壓實之前胚胎保持在分裂期。
圖1中步驟4，然后脂質分離的后胚胎允許進一步發育到胚泡期。具體講，脂質分離的胚胎可以在PZM3里培養3到6天以使胚胎達到胚泡期。
圖1中步驟5是進一步發育的胚胎的玻璃化。胚胎可通過任何標準方法/工序玻璃化。根據一個實施例，通過使用改進的開放式拉長細管(“OPS”)法，可以使進一步發育的胚胎在胚泡期玻璃化。具體講，進一步發育的胚胎可以短時間(例如約2分鐘)放在平衡溶液里，然后暴露于玻璃化溶液，然后載入OPS細管中，立即投入液氮。示例性的平衡溶液可包含10%的乙二醇，10%的二甲亞砜(“DMS0”)，而示例性的玻璃化溶液可以包含20% 的乙二醇和20%的DMS0。在投入氮氣之前，所述方法可在38. 5°C加熱期進行。從暴露于玻璃化溶液到投入氮氣的時間通常為約25到30秒之間的較短范圍。
圖1中步驟6至8是恢復被保存的胚胎并且把它轉移到接受者中的步驟。具體講，玻璃化的胚胎可通過在稍微高溫(例如約38. 5°C )下浸沒在緩沖溶液(例如蔗糖)中一段時間而融化。融化的胚胎可用0.5%的鏈霉蛋白酶處理軟化并且去除透明帶。脂質分離的和透明帶去除的胚胎然后可被轉移到接受者或者代孕物的輸卵管或子宮中。圖2(a)到(f)是在高同滲質量摩爾濃度處理(在400m0sm，用氯化鈉)之后 IVF-衍生的胚胎的照片。圖2(a)顯示的是高同滲質量摩爾濃度處理和離心之后培養數小時的胚胎。圖2(b)和2(c)顯示的是在胚泡期的胚胎。圖2(d)顯示的是在玻璃化和加熱之后胚胎。圖2(e)顯示的是在去除它們的透明帶之后的胚胎。圖2(f)顯示的是在BRL細胞條件培養基體外培養后重新擴大的胚胎。圖3 (a)到(f)是用氯化鈉或蔗糖高同滲質量摩爾濃度處理之后NT-衍生的胚胎的發育的照片。圖3(a)和3(b)顯示的是在高同滲質量摩爾濃度和離心處理后培養數小時的NT-衍生的胚胎；圖3(c)和3(d)顯示的是進一步培養至胚泡期的胚胎；圖3(e)顯示的是在玻璃化之后被加熱的胚胎；以及圖3(f)顯示的是在BRL細胞條件培養基體外培養后重新擴大的胚胎。本發明進一步研究了不同試劑(調整同滲質量摩爾濃度)，不同同滲質量摩爾濃度和離心時間對脂質分離率的影響。本發明發現不同的試劑，例如氯化鈉或蔗糖，對脂質分離有相似影響；脂質分離的理想范圍的重量摩爾滲透壓為從約350到約500m0sm ；在合適的離心力/速度下離心約6分鐘到約20分鐘的時間范圍也對脂質分離率有積極作用。圖4顯示的是離心前后經過不同同滲質量摩爾濃度(用氯化鈉或蔗糖調節)處理的體外受精胚胎的照片。第1排顯示的是胚胎暴露于不同同滲質量摩爾濃度300m0sm(對照)、400m0sm(用氯化鈉調節)、600m0sm(用蔗糖調節)、以及SOOmOsm(用蔗糖調節)下的照片，明顯地顯示出在提高的同滲質量摩爾濃度下凝縮(與對照相比)。第2排列出了在離心后胚胎相應的照片。在對照中可在離心之后觀察到橋樣結構(顯示不完全脂質分離)；在暴露于400m0sm的胚胎中可以觀察完全脂質分離，而較大橋樣結構存在于用600或SOOmOsm0 處理的胚胎中。圖2表明在約400m0sm的同滲質量摩爾濃度下提供最完全的脂質分離，當同滲質量摩爾濃度增加到600及以上時，脂質分離被阻礙。本發明進一步定量評價不同的同滲質量摩爾濃度和離心條件對于脂質分離率、胚胎發育和孵化能力的影響。基于包括在表1 (IVF衍生的胚胎，同滲質量摩爾濃度用氯化鈉調節)，2 (IVF衍生的胚胎，同滲質量摩爾濃度用蔗糖調節)，以及3 (NT衍生的胚胎，同滲質量摩爾濃度同時用氯化鈉和蔗糖調節，全部3份表格附上)中的數據，脂質分離的優選條件是將IVP胚胎暴露在大于300到約500m0sm范圍的同滲質量摩爾濃度，優選從約350到約 450m0sm,隨后以13，400X克的速度離心約6到約20分鐘。離心時間可縮短或者延長，這取決于離心速度。然而，延長離心時間可使胚胎長期暴露于高同滲質量摩爾濃度下，這可能對胚胎的活性有不利的影響。而且，在表3中，對于NT-衍生的胚胎(在第一輪處理無法凝縮)進行第二輪高同滲質量摩爾濃度處理，這增加總的脂質分離率。第二輪高同滲質量摩爾濃度處理可進行，只要在胚胎仍處在壓實之前的分裂期。表1 IVF*開始18-20小時后、經過不同同滲質量摩爾濃度處理和不同離心時間處理的IVP胚胎的脂類分離和發育
權利要求
1.一種IVP豬胚胎的脂質分離的方法，包括(a)在壓實之前，在單細胞或分裂期制備IVP豬胚胎，(b)使這樣的胚胎短時間暴露于具有預選擇的同滲質量摩爾濃度的介質以制備凝縮的胚胎，以及(c)在預選擇的速度下離心這樣的凝縮的胚胎預選擇的和時間期間，以制備脂質分離的胚胎。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述的IVP豬胚胎是通過試管受精、核轉移、或者其他體外方法制備的。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述的介質的同滲質量摩爾濃度在約300m0smO到約 500m0smo的范圍內。
4.如權利要求4所述的方法，其中所述的離心條件是在13，400X克速度下離心約6到約20分鐘。
5.一種低溫保存和恢復在體外制備的豬胚胎的方法，包括(a)在壓實之前，在單細胞或分裂期制備體外制備的豬胚胎，(b)使所述的胚胎短時間暴露于預選擇的同滲質量摩爾濃度以制備凝縮的胚胎；(c)離心所述的凝縮的胚胎以制備脂質分離的胚胎，(d)培養所述的脂質分離的胚胎至胚泡期以制備脂質分離的胚泡，(e)通過玻璃化或冷凍低溫保存所述的胚泡，(f)通過加熱恢復所述的胚泡，再水合，并且去除透明帶，以及(g)轉移所述透明帶去除后的胚泡至接受者。
全文摘要
本發明提供一種實用的、非侵襲性的、有效的低溫保存體外制備的豬胚胎的方法。本發明方法是在壓實之前將在單細胞或分裂期的IVP(例如IVF-或-NT-衍生的)胚胎在高同滲質量摩爾濃度的條件下處理，接著進行高速離心。高同滲質量摩爾濃度處理擴大了卵周隙，且離心能夠使脂質從細胞質中分離。經過高同滲質量摩爾濃度處理后，脂質分離的胚胎被成功低溫保存，后來被恢復和轉移以產生活體后代。
文檔編號A01K67/00GK102197130SQ200980142807
公開日2011年9月21日 申請日期2009年8月28日 優先權日2008年8月29日
發明者C·N·墨菲, L·斯佩德, R·S·普萊特爾, R·李 申請人:密蘇里大學管理者